专利名称：鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医领域。具体涉及鹿结核病血清检测诊断方法。
背景技术：
鹿结核病(Deer tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium)引起的鹿的一种慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，几乎每个国家的鹿场都曾发生过结核病或曾经检出过结核病菌。近年来，鹿 结核病在国内外养鹿场广有流行，造成巨大的经济损失， 严重影响了养鹿业的发展。目前，没有专门用于鹿结核病特定的检测方法。以往多沿用其他家畜结核病的传统方法，检测结果特异性较差，敏感性较低，过程较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法。用于鹿结核病的诊断，克服以往鹿结核病检测特异性差，敏感性低等不足。本发明检测方法选用的生物材料有牛型提纯蛋白衍生物(Pro)、兔抗鹿IgG，兔抗鹿I gG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清。本发明检测方法的步骤是I、包被抗原在酶标板上选定待检血清孔、阴性对照孔、阳性对照孔、抗原对照孔、抗体对照孔、酶结合物对照孔、空白对照孔；将牛型提纯蛋白衍生物(PPD)用抗原稀释液稀释成 10-50 u g/ml后，等量加入上述各孔中。在35-42°C湿盒内2_4小时包被后3X3'洗涤。2、加血清用血清稀释液将待检血清按血清比稀释液为I : 50-1 150的比例稀释，在待检血清孔中加待检血清、标准阳性对照孔和抗体对照孔加阳性血清，标准阴性血清对照孔加阴性血清，抗原对照孔加入血清稀释液，加入量均相同于步骤I所加抗原的体积量， 35-42°C湿盒内孵育0. 5-1. 5小时，3X3'洗涤。3、加酶结合物-兔抗鹿IgG-HRP将兔抗鹿I gG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液为I : 2000-1 8000 的比例稀释，将将兔抗鹿IgG-HRP液加入全部待检血清孔和对照孔中，每孔加入量相同于步骤I加入的抗原液体积量，35-42°C湿盒内孵育0. 5-1. 5小时，3X3'洗涤。4、加底物-兔抗鹿IgG在完成步骤3的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加兔抗鹿IgG，作为底物反应,每孔加入量相同于步骤I加入的抗原液体积量，35-42°C湿盒内孵育10-20分钟；5、终止反应在完成步骤4的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加2摩尔质量硫酸终止反应；每孔加入量为步骤I加入的抗原液体积的1/2。6、用酶联免疫检测仪测量
将完成步骤5的培养板置于酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，测各孔的OD值；以PPD的OD值彡O. 56为阳性。上述的抗原稀释液为按碳酸钠(Na2CO3)O. 318g，碳酸氢钠(NaHCO3)O. 560g，加去离子水后得IOOOml溶液的用料比例，先用少量固体物溶解，待完全溶化后补全部去离子水，混匀所得到的溶液。上述的血清稀释液为按牛血清白蛋白O. lg，洗液IOOml的比例，溶化混匀所得溶液本发明中使用的兔抗鹿IgG通过以下过程制备取来自健康鹿的血清，用50%饱和(MM)2SO4盐析一次后，再用37. 5%饱和(NH4) 2S04盐析三次，提取鹿血清IgG :充分透析至无NH4+、S042+。以O. 01MpH8. O磷酸缓冲液透析平衡，过DEAE-32柱。以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，測定蛋白含量；以聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定其纯度。以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条帯，且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的Y-球蛋白带组中最后一条带相ー致，则说明所提蛋白为鹿IgG，且纯度高。将所提鹿血清IgG浓缩，_20°C冰箱中保存备用。本发明中使用的兔抗鹿IgG-HRP按以下用量或用量相等倍数变化所取的原料及过程制备将5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于O. 5ml蒸馏水中，加入新配制的O. 06摩尔质量NaIO4水溶液O. 5ml，混匀置冰箱中4°C 30min，取出后加入O. 16摩尔质量こニ醇水溶液O. 5ml,于室温放置30min后，加入含有5mg纯化兔抗鹿IgG的水溶液Iml,混勻并装入透析袋，用O. 05摩尔质量pH9. 5碳酸盐缓冲液搅拌6h，使之结合。然后，从透析袋中吸收出来，加入NaBH4溶液(5mg/ml) O. 2ml，置4°C冰箱中2h，将上述结合物混合液加入等体积pH7. O饱和(NH4)2SO4溶液，置4°C冰箱中30min，3000r/min离心30min，将得到的沉淀物溶于少许O. 02摩尔质量pH7. 4磷酸盐缓冲液中，并在PBS中透析12h，中间换液三次，次日再离心，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗鹿IgG结合物。最后，用PBS加至4. 5ml分装。_20°C冷冻保存备用。本发明的积极效果是在首创完成兔抗鹿ニ抗的基础上，进ー步对鹿结核间接ELISA的诊断抗原进行筛选，以牛型提纯蛋白衍生物(PPD)作为最佳抗原并确立了最佳试验步骤和条件，建立ー种特异性强(94. 4% )，敏感性高(91. 1% )，简便快捷，耗资少的鹿结核病诊断方法。以PPD为抗原技术效果说明表I使用PH)与其他常用抗原ELISA检测结果与剖检、细菌检查符合率
权利要求
1.鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是 (1)使用的生物材料有牛型提纯蛋白衍生物、兔抗鹿IgG、兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清； (2)检测步骤是 ①包被抗原 在酶标板上选定试验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、抗原对照孔、抗体对照孔、酶结合物对照孔、空白对照孔；将牛型提纯蛋白衍生物用抗原稀释液稀释成10-50μ g/ml后，等量加入上述各孔中。在35-42°C湿盒内2-4小时，包被后3X3'洗涤； ②加血清 用血清稀释液将待检血清按血清比稀释液I : 50-1 150的比例稀释，在待检血清孔中加待检血清、标准阳性对照孔和抗体对照孔加阳性血清，标准阴性血清对照孔加阴性血清，抗原对照孔加入血清稀释液，加入量均相同于步骤①所加抗原的体积量，在35-42°C湿盒内孵育O. 5-1. 5小时，3X3'洗涤。
③加酶结合物-兔抗鹿IgG-HRP 将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液I : 2000-1 8000的比例稀释，将兔抗鹿IgG-HRP液加入全部待检血清孔和对照孔中，每孔加入量相同于步骤①加入的抗原液体积量，在35-42°C湿盒内孵育O. 5-1. 5小时，3X3'洗涤； ④加底物-兔抗鹿IgG 在完成步骤③的酶标板上全部试验孔和对照孔中加兔抗鹿IgG，作为底物反应，每孔加入量相同于步骤①加入的抗原液体积量，在35-42°C湿盒内孵育10-20分钟； ⑤终止反应 在完成步骤④的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加2摩尔质量硫酸终止反应；每孔加入量为步骤①加入的抗原液体积的1/2 ； ⑥用酶联免疫检测仪测量 将完成步骤⑤的培养板置于酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，测各孔的OD值；以PPD的OD值彡O. 56为阳性。
2.根据权利要求I所述的鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的抗原稀释液为按碳酸钠(Na2CO3)O. 318g,碳酸氢钠(NaHCO3)O. 560g,加去离子水后得IOOOml溶液的用料比例，先用少量固体物溶解，待完全溶化后补全部去离子水，混匀所得到的溶液。
3.根据权利要求I所述的鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的血清稀释液为按牛血清白蛋白O. lg，洗液IOOml的比例，溶化混匀所得溶液。
4.根据权利要求I所述的鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的兔抗鹿IgG通过以下过程制备 取来自健康鹿的血清，用50%饱和(MM)2SO4盐析一次后，再用37. 5%饱和(MM)2SO4盐析三次，提取鹿血清IgG :充分透析至无NH4+、S042+ ;以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液透析平衡；过DEAE-32柱，以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，测定蛋白含量；以聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定其纯度，以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条带，且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的Y-球蛋白带组中最后一条带相一致，将所提鹿血清IgG浓缩，_20°C冰箱中保存备用。
5.根据权利要求I所述的鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是本发明中使用的兔抗鹿IgG-HRP按以下用量或用量等倍数变化所取的原料及过程制备 将5mg辣根过氧化物酶溶于O. 5ml蒸馏水中，加入新配制的O. 06摩尔质量NaIO4水溶液O. 5ml，混匀置冰箱中4°C 30min，取出后加入O. 16摩尔质量乙二醇水溶液O. 5ml，于室温放置30min后，加入含有5mg纯化兔抗鹿IgG的水溶液1ml，混匀并装入透析袋，用O. 05摩尔质量pH9. 5碳酸盐缓冲液搅拌6h，使之结合，然后，从透析袋中吸收出来，加入NaBH4浓度为5mg/ml溶液O. 2ml，置4°C冰箱中2h，将上述结合物混合液加入等体积pH7. O饱和(NH4) 2S04溶液，置4°C冰箱中30min，3000r/min离心30min，将得到的沉淀物溶于少许O. 02摩尔质量PH7. 4磷酸盐缓冲液中，并在PBS中透析12h，中间换液三次，次日再离心，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶-兔抗鹿IgG结合物，最后，用PBS加至4. 5ml分装，_20°C冷冻保存备用。
全文摘要
鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法属于兽医领域。克服以往鹿结核病检测特异性差，敏感性低等不足。所选用的生物材料有牛型提纯蛋白衍生物(PPD)、兔抗鹿IgG，兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清。检测方法的步骤有包被抗原、加血清、加酶结合物-兔抗鹿IgG-HRP、加底物-兔抗鹿IgG、终止反应后用酶联免疫检测仪测量，在490nm处空白调零，测各孔的OD值；以PPD的OD值≥0.56为阳性。本发明的积极效果是在首创完成兔抗鹿二抗的基础上，对鹿结核间接ELISA的诊断抗原进行筛选，以牛型提纯蛋白衍生物(PPD)作为最佳抗原并确立了最佳试验步骤和条件，建立一种特异性强，敏感性高，简便快捷，耗资少的鹿结核病诊断方法。
文档编号G01N33/535GK102621303SQ20111003180
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者于淼, 刁燕, 刘东旭, 刘晓, 张梦, 时坤, 李建明, 杜锐 申请人:吉林农业大学