一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法，其特征在于，该方法包括：使用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增18-22个循环时出现荧光，则表示杨梅组织中含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环时不出现荧光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌。利用该技术可以很好的区分携带凋萎病菌和健康的杨梅树，并快速准确。
CGMCC No.8713
2014.01.10
CGMCC No.8714
2014.01.10
【专利说明】一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原菌的分子诊断领域，特别的，属于如何采用RT-PCR并结合特 异的引物检测杨梅树中是否携带凋萎病菌的方法。
【背景技术】
[0002] 杨梅（Myrica rubra Sieb. Et Zucc.)是我国南方特有的珍稀水果，果实甜酸适 口，风味独特，在国内外享有盛誉，因其显著的经济与生态效益，已成为浙江省主要水果种 类，其产值已稳居各类水果首位。杨梅凋萎病是近年来新发现的一种病害，发病初期，杨梅 部分嫩梢干枯，随病情加重，嫩梢干枯数量逐渐增多并蔓延至全树，发病后3-5年整株死 亡。杨梅凋萎病在浙江省杨梅主产区呈迅速蔓延趋势，严重影响杨梅产业的可持续发展。引 起杨梅凋萎病的病原菌为异色拟盘多毛孢（Pestalotiopsis versicolor)和小孢拟盘多毛 抱（P. microspora)。
[0003] 在植物病害检测中，采用分子手段进行病原菌DNA的大量扩增来检测植物病害目 前被大量使用，这种检测方法不仅快速，而且特异性比较高。比传统的分离方法检测要快 速，而且准确。杨梅凋萎病病原菌为异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢，凋萎病给杨梅树可 以带来毁灭性的灾害。这就需要提供快速、准确的检测杨梅树是否携带凋萎病菌的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明实验小组惊讶的发现，采用常规的普通PCR技术不能对健康或携带凋萎病 病菌(异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢)的杨梅树进行准确的区分。我们进行了特异引物 的设计，采用实时定量RT-PCR (Real time Quantitative PCR)技术对携带凋萎病菌的杨 梅苗木进行检测，发现可以很好的区分感病和健康的杨梅苗木，即可以从那些表面看似健 康的杨梅苗木中鉴别出携带病菌的杨梅苗木。
[0005] 为了有效利用荧光定量PCR扩增技术，筛选特异性引物及最适的荧光定量PCR扩 增条件是检测杨梅树是否患有凋萎病的重要先决条件。
[0006] 本发明提供方法，该方法采用荧光定量RT-PCR扩增方法对杨梅树是否带有异色 拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌进行分子鉴定的方法。该方法包括：使用荧光定量PCR 对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增循环18-22个循环时出现荧光，则表示杨梅组织 中含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环时不出现荧 光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌。
[0007] 在一个优选的方式中，采用荧光定量RT-PCR所使用的引物对下列引物对中的 一对或多对：AATCCGCCGTTGTAITTCAG/CTGTTCGAGCGTCAITTCAA ;AATCCGCCGTTGTAITTCAG/ TGTTCGAGCGTCATTTCAAC ; TTGAAATGACGCTCGAACAG/TCGAATCTTTGAACGCACAT。用该引物对可以 检测杨梅组织是否携带有异色拟盘多毛孢真菌。
[0008] 在一个优选的方式中，采用荧光定量RT-PCR所使用的引物对下列引物对中的 一对或多对：AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/ CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。用该引物对可以 检测杨梅组织是否携带有小孢拟盘多毛孢真菌。
[0009] 在一个优选的方式中，该方法的杨梅组织包括根、茎或叶片。
[0010] 在一个优选的方式中，使用的最终DNA浓度为lOOpg/μ 1。
[0011] 在一个优选的方式中，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的体系为： SYBR? PrcinixExTuq? (2X) 10μ 1，2 条 RT-PCR Primer (ΙΟμΜ)各 0·6μ1，ROX Reference Dye II (50Χ)4μ1，Template (50 ?100ng) 2 μ l，dH206.4yl。
[0012] 在一个优选的方式中，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的程序为：95 °C 30 秒；95 °C 5 秒，55 °C 30 秒，72 °C 34 秒，40 个循环。
[0013] 对于保藏真菌的生物学特性说明 菌株PMYS1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为 CGMCC No. 8713,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁 学名：Pestalotiopsis microspora，中文名称为：小孢拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01 月10日。 菌株PVXJ1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为 CGMCC No. 8714,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁 学名：Pestalotiopsis versicolor,中文名称为：异色拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01 月10日。 有益效果
[0014] 本发明采用特殊的引物以及RT-PCR技术可以有效的从健康杨梅树中鉴定出感病 的杨梅树，可以快速有效的获得鉴定结果，为杨梅树凋萎病提供了新的分子鉴定技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1采用引物CPV1L/CPV1R鉴定异色拟盘多毛孢菌株，引物CPM1L/CPM1R鉴定小 孢拟盘多毛孢菌株的普通PCR扩增的电泳图。
[0016] 图2对采用图1中的引物扩增对照菌普通PCR扩增的电泳图。
[0017] 图3PCR检测健康和接种凋萎病菌杨梅根的样品(对于相同的叶片和茎的样品获 得同样的结果，图省略)。
[0018] 图4使用引物PvlL/PvlR的荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
[0019] 图5使用引物Pv2L/Pv2R荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
[0020] 图6使用引物Pv3L/Pv3R荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
[0021] 图7使用引物PmlL/PmlR荧光定量PCR溶解曲线（小孢拟盘多毛孢菌株）
[0022] 图8使用引物Pm2L/Pm2R荧光定量PCR溶解曲线（小孢拟盘多毛孢菌株）
[0023] 图9使用引物Pm3L/Pm3R荧光定量PCR溶解曲线（小孢拟盘多毛孢菌株和异色拟 盘多毛孢菌株）
【具体实施方式】
[0024] 一、采用普诵PCR抟术对带菌棺株和对照棺物以及病菌的培养某培养讲行比较试 验
[0025] 实施例子1 :PCR引物和探针设计
[0026] 根据本发明小组分离的杨梅凋萎病菌的致病力菌株XJ27 (经过鉴定属于异色 拟盘多毛孢）和YS26 (经过鉴定属于小孢拟盘多毛孢）的共有区域ITS (转录间隔区）的 序列（JN861773;JN861776)(Ren HY，Li Gang，Qi XJ，Fang Li，Wang HR，Wei JG，Zhong S. Identification and characterization of Pestalotiopsis spp. causing twig blight disease of bayberry(Myrica rubra Sieb. &Zucc)in China. European Journal of Plant Pathology, 2013, 173(3) :451-461.)。使用 Primer3software 设计荧光定量 PCR和传统 PCR 的引物。引物用途及序列见表1。
[0027] 表1引物序列特性
[0028]
【权利要求】
1. 一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法，其特征在于，该方法包括： 使用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增18-22个循环时出现荧光，则表 示杨梅组织中含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环 时不出现荧光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用荧光定量RT-PCR所使用的引 物对下列引物对中的一对或多对：AATCCGCCGTTGTATTTCAG 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA、 AATCCGCCGTTGTATTTCAG 和 TGTTCGAGCGTCATTTCAAC 或 TTGAAATGACGCTCGAACAG 和 TCGAATCTTTGAACGCACAT 〇
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用荧光定量RT-PCR所使用的引 物对下列引物对中的一对或多对：AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ; AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA ;AAAGCAGTAGGCTCCCAACA 和 CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的的杨梅组织包括根、茎或叶片。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的最终DNA浓度为100 pg /μ?。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的体系为： SYBR? Premix Ex Taq? (2Χ)10 μ1，2 条 RT-PCR Primer 各 0.6 yl，ROX Dye II (50X) 4 μ?,模板 2 μ1,(1Η20 6·4 μ?。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的程序为： 95。C 30 秒；95° C 5 秒，55° C 30 秒，72° C 34 秒，40 个循环。
【文档编号】C12Q1/04GK104232748SQ201410085409
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】任海英, 戚行江, 梁森苗, 郑锡良, 朱潇婷 申请人:浙江省农业科学院