时间：当使 用MA时所观察到的注射和EP之间的操作时间为4秒(见图10，第四列），使用LA为80秒。分析 质粒剂量、制剂体积、延迟时间、电流振幅和脉冲长度的许多其他条件并列于图10。如一般 规律，具有足够质粒剂量的较小体积(更浓缩的溶液)具有更好的结果。 实施例5猪的皮内递送与肌肉内递送的对比
[0138] 对比在猪中皮内（ID)或肌肉内（頂)递送浓缩剂量的CMV-GHRH和CMV-SEAP质粒理 的递送和表达。使用两种分泌蛋白（SEAP，GHRH)以及检测第一次在猪中的SEAP免疫原性结 果显示了哪一种递送方法可获得猪中的最高表达。
[0139] 单独饲养动物并使其适应7天。在实验一开始将动物称重、采血，然后麻醉。以各种 浓度和电流强度给猪(η= 4/组)注射lmgCMV-SEAP和CMV-GHRH+0.1 %多聚L谷氨酸盐(表 1)。4秒钟后使用CELLECTRA?电穿孔装置（VGXPharmaceuticals，Inc.，BlueBell， PA19422) ((5个针，52毫秒脉冲，脉冲之间间隔1秒，总共3次脉冲）以不同电流（0.1至 0.5Amp)对动物进行电穿孔。使猪从麻醉中恢复并监控24小时以确保完全恢复。记录任何没 有在2或3个小时内恢复的动物。第2、4、7、9和11天将猪称重和采血。在整个实验过程中可随 意获得食物和水。采集血液用于SEAP、SEAP抗体ELISAs、GFRF和IGF-I。 表1实验组摘要
[0140] 使用化学发光试剂盒Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit (AppliedBiosystems，Bedford，MA)根据操作说明在血清样品中测定SEAP表达，见图12。该 测定法的检测下限为3pg/mL。给予稀释质粒组的SEAP水平高于以0.5Amp电穿孔的頂注射浓 缩质粒的动物(高出43%，*P= 0.024)。在ID注射的动物血清中发现极低水平的可检测SEAP 蛋白。
[0141] 用于本实验的SEAP为人蛋白质并且因此其在猪中诱导免疫应答。使用ELISA进行 抗体应答的检测，结果见图13所示的图中。第11天血清样品中的抗体应答与11天的血清 SEAP结果一起作图。浓缩质粒样品得到最高的平均抗体滴度。
[0142] 在GHRH轴中使用下游激素测量GHRH表达，即胰岛素样生长因子I或IGF-I。结果可 见图14显示的图中。IGF-I是血清中较稳定的蛋白质并可使用IGFI-RIA方便地检测。与頂给 予浓缩质粒组相比IM给予非浓缩质粒（C-IM-0.5A)组注射后第11天的血清IGF-I(D-IM- 0.5A)水平更高。
[0143] 结果表明注射体积和途径对已表达和分泌的蛋白质的表达和对这些蛋白的免疫 原性具有重要影响。就表达相对于免疫原性而言，浓缩和非浓缩DNA具有显著差异。
[0144] 頂注射并以0.5Amps电流强度电穿孔的动物中IGF-I表达更高。更低的电流强度得 到更低的表达水平，但是小数量的动物使得该差异为非统计学差异。 实施例6在猪中的皮肤EP研究 材料和方法 动物
[0145] 在前期实验中使用三至六周大，重量在25_40kg的混合性别的幼杂交猪（n= 5/ 组）。根据AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare的标 准在Stillmeadow，Inc.，Sugarland，TX饲养动物。在可随意获取食物和水的围栏中按组饲 养动物。在开始实验之前使动物适应5天。 质粒
[0146] pEGFP-Nl或pSEAP-2基础载体（ClontechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)分别 用于实验1和2。用于实验1 (Exp. 1)的pEGFP-Nl编码野生型绿色荧光蛋白（GFP)的红移变异 体，其经优化在哺乳动物细胞中具有更亮的荧光和更高的表达(最大激发光= 488nm;最大 发射光= 507nm)。普遍存在的细胞巨化病毒启动子(CMV)驱动pSEAP-2基本载体中分泌型胚 胎碱性磷酸酶（SEAP)的表达；该质粒用于猪实验2(Exp. 2)。使用可商业购买的试剂盒 ((^&8611111(3.，〇1&七8￥〇1'1：11，0厶，1]3厶）获取质粒。内毒素水平经1(；[1161：；[。011'01]1&8611；[。1^\1^ (Endosafe，0^1"1681:011，30测定小于0.0]^1]八^。在无菌水中稀释质粒制剂并用多聚1^谷氨 酸钠盐（]\^=10.51^3平均）配制成1%重量/重量（3丨811^，3丨几〇11丨8，]\10)，在￥6父 Pharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands，TX)进一步HPLV纯化。 皮内/皮下（ID/SQ)给予质粒和电穿孔(EP)
[0147] 在实验1的第0天，将动物称重并用异氟烷(5%诱导，2-3%维持)麻醉。将两侧肋上 的两个3〃X3〃位点剃毛并仔细清理。用纹身墨水标记一英寸的区域用于之后识别。在该区 域的中央进行各质粒注射。动物接受ID/SQ注射;在不同EP条件下（见下文）、注射体积和剂 量：质粒剂量、注射体积（5(^8/5(^1^、5(^8/10(^1^、10(^8/10(^1^和20(^8/10(^〇、电流振幅 和脉冲长度均变化并且由不了解处理组身份的独立观察者对经处理区域的活组织检查评 分。对剖离的皮肤区域照相并在注射后5天测量荧光。基于分布面积和荧光强度计算数字分 数，与具有最高表达的样品相比(〇 =无荧光，无分布;5 =最亮荧光，最大分布）。在所有实验 中使用方波脉冲并使用皮肤EP装置CELLECTRA?装置（VGXPharmaceuticals，Immune TherapeuticsDivision，TheWoodlands，TX)给予。其可递送适当的恒定电流(如下层组织 经受的恒定电流）。在所有情况下，适当的恒定电流参数为0.1-0.4Amps之间，具有2或3次脉 冲，持续20毫秒/脉冲或52毫秒/脉冲，并且脉冲间相隔一秒。
[0148] 在实验1中使用两种阵列类型：之前用于肌肉内（IM)EP的电极阵列，其为5个等空 间排列的规格21固体不锈钢针状电极的环形阵列(直径lcm)，安装于非传导性材料上；ID/ SC皮肤针状电极由三个长3mm以等腰三角形(两个长边长5mm，短边长3mm)排列的安装于非 传导性材料上的规格26固体不锈钢针状电极组成(见图17B)。
[0149] 在实验2中，ID/SQ注射动物并用lmgpSEAP(或者为2mg/mL的标准质粒制剂(500μ L，与IM注射相似)或者为lOmg/mL的浓缩质粒制剂)进行皮肤EP，测量SEAP表达直至给予质 粒后11天。 血液收集和SEAP测定法
[0150]在实验2的第0、4、7和11天，于8 :30AM称重动物并通过颈静脉穿刺收集血液至MICROTAINER血清分离管中。使血液在室温下凝结10或15分钟，接着3000xg离心10分钟并将 血清_80°C保存用于进一步分析。
[0151 ]将血清样品冻融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit (AppliedBiosystems，Bedford，MA)根据操作说明对50yL进行分析。该测定法的检测下限 为3pg/mL。测定SEAP活性之前在小鼠血清中1:10稀释更浓缩的血清样品。使用LUMIstar Galaxy光度计(BMGLabtechnologies，0ffenburg，Germany)读数所有样品。 结果 实验1
[0152]使用皮肤针状电极和頂电极均得到最高GFP评分。但是，使用頂电极的最佳结果需 要以相同的浓度将质粒剂量加倍，即与用于皮肤针状电极阵列的配置于50yL的50yg质粒相 比为配置于l〇〇yL的100yg质粒（图15)。此外，使用0.2Amps、2次脉冲、52ms/脉冲、脉冲间相 隔1秒(其为我们经过测定用于皮肤EP的最佳条件），可大大减少操作时间：当使用皮肤电极 时操作时间仅为4-5秒，当使用IM阵列时为80秒。如一般规律，具有足够质粒剂量的较小体 积(更浓缩的溶液)具有更好的结果。 实验2
[0153]使用在之前实验中确定的最适于与皮肤EP联用的ID/SQ质粒递送的条件处理猪， 艮P0.2Amps、2次脉冲、52ms/脉冲、脉冲间相隔1秒。给予动物相同的质粒量，lmgpSEAP，使用 小体积制剂或IM+EP注射常用的体积。使用浓缩质粒制剂和较低注射体积得到更高的SEAP 数值(图16)，P<0.05.在非人类灵长类动物中进一步验证这些条件。 实施例7灵长类实验
[0154] 用低剂量DNA(0 · 2mg/抗原）免疫两次猕猴，然后用高剂量DNA(0 ·lmg/抗原）通过 ID/SQ注射免疫三次，之后进行皮肤EP。经IFNyELISpot测定在单独ID/SQ组和ID/SQ注射接 着进行皮肤EP(ID/SQ+EP)的组中两次低剂量免疫得到弱细胞免疫应答。但是，三次免疫后 在ID/SQ组中DNA剂量的增加将应答提高至1000SFU/106PBMCs<JD+EP组比ID/SQ组的IFNy 产生细胞多50 %。ID/SQ+EP组免疫原性的增强也表现于记忆T细胞应答，其中ID/SQ+EP组比 ID/SQ组的抗原特异性IFNγ产生细胞多50%。单独ID/SQ免疫未得到gag或env抗体滴度的 显著产生（ <终点滴度）。但是用EP进行质粒递送得到8800的峰gag终点滴度和1600的env终 点滴度。最后，同时给予质粒编码的rhIL-12也可得到经IL-4ELISpot测定法测定的ΤΗ1特 异性免疫应答。 材料和方法 动物
[0155] 根据AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare 的标准在可随意获取食物和水的条件下在BI0QUAL，Inc. (Rockville，MD)单独饲养猕猴 (Macacamulatta)。在任何实验之前允许动物在隔离区适应30天。
[0156] 质粒
[0157] 本实验中使用pGag4Y、pEY2El_B和WLV104质粒。pGag4Y包含编码HIVgag蛋白的表 达盒。将Gag4Y基因亚克隆至表达载体口\%1(1]1￥；[1：1'08611，031'18匕3(1，04)用于进一步研究。 PEY-2E1-B包含编码HIVcladB包膜的表达盒。WLV104M为编码猕猴IL-12基因的质粒。使用 可商业购买的试剂盒（QiagenInc.，0^七8￥01"1:11，04，1]34)获得质粒。经1(;[1161:;[0 ChromagenicLAL(Endosafe，Charleston，SC)测定内毒素水平小于0.OlEU/yg。在无菌水中 稀释质粒制剂并用多聚L谷氨酸钠盐配制成1%重量/重量(MW=10.5kDa平均）（Sigma， St·Louis，M0)，在VGXPharmaceuticals，ImmuneTherapeuticsDivision(The Woodlands，TX)进一步HPLC纯化。
[0158] 免疫
[0159] 在非人灵长类中使用(n= 3/组)和不使用(n= 3/组)EPID/SQ递送HIVDMA疫苗，其 中使用CELLECTRA?适应性恒定电流EP装置(如上文中实施例3)和皮肤针状电极阵列。在四 周内分别进行免疫并且每两周采集动物血液以测量抗体和T细胞应答。前两次免疫递送 0.2mg的两种HIV抗原(gag和evn)并且将IL-12表达质粒作为佐剂，体积为200yL，分开用于 每只动物的两个ID/SQ注射位点。使用lmg各HIV疫苗和更高质粒浓度（10mg/mL)的IL-12质 粒(总共3mg)进行接下来的两次免疫以在与之前两次免疫相同的体积中达到更高的质粒剂 量。电穿孔条件为〇. 2Amps恒定电流、2次脉冲、52ms脉冲长度，脉冲间隔1秒。 血液收集
[0160] 在实验过程中每两周采集动物血液。将10mL血液收集至EDTA试管中。通过标准 Ficoll-hypaque离心分离PBMCs并接着重悬于完全培养基(含有2mM/LL谷氨酸并添加了 10%加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和55μΜ/1β巯基乙醇的RPMI 1640)中。用ACK裂解缓冲液(CambrexBioScience，EastRutherford，NJ)裂解RBC。 酶联免疫测定法(ELISA)
[0161] 用 100ng/孔的重组HIV-1IIIBp24或gbl20(IrnrnunoDiagnostics，Wobu;rn，MA) 包被96孔板过夜以分别测定HIVgag和env应答。包被了 100ng/孔胎牛血清白蛋白的板作为 阴性对照。用3%BSA-PBST于37°C封闭板1小时。接着将板子与四倍系列血清稀释液于37°C 温育1小时。然后以1:1 〇〇〇〇稀释度向板中加入羊抗猴IgG辣根过氧化物酶结合抗体(MP Biomedicals，Aurora，0H)并于37°C温育1小时。使用四甲基联苯胺（R&Dsystems， Minneapolis，MN)显色并用2NH2S〇4终止反应。然后测定光密度(0D)。
[0162]IgG终点滴度定义为可以得到比BSA孔的平均0D值大两倍的0D值的交互血清稀释(reciprocalserumdilution)。 酶联免疫斑点测定法(ELISpot)
[0163] 使用IFNγ或IL-4捕获和检测抗体(MabTech，Sweden)进行ELISpot。通过用包含肽 的孔数减去阴性对照的空数测定抗原特异应答。结果以三个孔的平均值（点/百万脾细胞） 表不。 统计学分析
[0164] 使用PrismGraphpad软件分析数据并表示为平均值土SEM。 非人灵长类实验设计
[0165] 根据图17A说明的设计用经优化的HIV-1gag和env构建体和质粒编码的猕猴IL-12 免疫猕猴； 用于猪实验的装置也用于非人灵长类 （图 17BKID/SQ注射免疫三只动物，ID/ SQ注射结合皮肤电穿孔（ID/SQ+EP)免疫三只动物。在第0、4、8、12、16周免疫动物5次。每两 周采集血液，每次免疫后两周进行ELISpot测定，而每次免疫后四周进行ELISA测定。 ELISpot分析
[0166] 通过IFNγELISpot测定每次免疫之后细胞免疫应答的诱导（图18)。在0.2mg每抗 原的一次低剂量免疫后，ID/SQ和ID/SQ+EP组均具有弱应答(分别为72± 11SFU/106PBMCs 和85±34SFU/106PBMCs)。第二次低剂量免疫使ID/SQ组中IFNy产生细胞的数量加倍（173 ±77SFU/106PBMCs)并且使ID/SQ+EP组的应答增加至三倍（287±34SFU/106PBMCs)。已在 两次低剂量免疫后观察到较弱的细胞应答，我们使用高剂量DNA进行接下来的三次免疫。 ID/SQ组第三次免疫的免疫应答并未显著增加（176±72SFU/106PBMCs)。但是ID/SQ+EP组 确实在较高剂量将IFNγ产生细胞的数量提高至两倍(383 ± 162SFU/106PBMCs)。用lmg剂 量的DNA第四次免疫动物。与之前免疫相比在ID/SQ组中观察到IFNy应答的三倍增长(376 ±210SFU/106PBMCs)。在第三次接种时，使用皮肤EP递送高剂量DNA得到双倍的IFNy应答 (1466±762SFU/106PBMCs)。在最后的免疫中维持了这些高水平的抗原特异应答（1453土 873SFU/106PBMCs)。最后一次免疫进一步加倍了ID/SQ组中IFNy产生细胞的数量(927土 191SFU/106PBMCs)。 记忆T细胞应答
[0167] 诱导强效的T细胞应答是成功免疫的一个重要方面。为了评价ID/SQDNA免疫诱导 的记忆T细胞群，在最后一次DNA接种后10周进行ELISpot分析（图19)。ID/SQ+EP组的记忆 IFNγ应答是ID/SQ组强度的两倍(分别为998 ± 290和449 ± 108SFU/106PBMCs)。 Th2T细胞应答
[0168] 使用基因枪用于皮肤免疫的研究已例证对Th2偏倚(biased)T细胞应答的诱导。但 是已显示如果也递送IL-12可将这一偏倚逆转至TH1应答。在IDDNA免疫中一起递送给猕猴 IL-12以确定其共递送是否可引起对TH1偏倚应答的诱导（图20)。在最后一次免疫后10周通 过IL-4ELISpot测定法测定对抗原特异Th2应答的诱导。仅进行ID/SQ的组中所有动物具有 阴性IL-4应答（>50SFU/106PBMCs)并且ID/SQ+EP组中仅有一只动物具有阳性IL-4应答 (136SFU/106PBMCs)，表明显著的ThI应答。 体液应答
[0169]DNA免疫的一个弱点在于其不能在非人灵长类和人类临床实验中诱导抗体应答。 通过ELISA测定法测定各组诱导对重组p24和gbl60抗原的HIV-gag和evn特异抗体滴度的能 力（图21)。对两种抗原而言，ID/SQ组未显示显著的抗体滴度（<50终点滴度）。ID/SQ+EP组 在第二次低剂量免疫后具有低水平的抗体(终点滴度：100 ±50)。但是在使用高剂量DNA的 第三次免疫中增加所递送DNA的剂量之后观察到更大的抗体诱导（2220±1000)。第四次免 疫中提高了抗体滴度（8800 ±4000)。env抗体应答也反映了我们在有低滴度（<50终点滴 度）的ID/SQ组观察到的gag抗原的结果并且ID/SQ组达到最大终点滴度1600±800。 頂相对ID/SQ电穿孔
[0170] 用相同的HIVgag、env和rhIL-12构建体（如上所述）以1.0mg/mL通过IM免疫将猕 猴免疫三次。与细胞免疫应答诱导相比，前两次免疫之后頂和ID/SQ途径二者具有相似水平 的IFNγ产生细胞。相反的，与頂+EP相比在第一次高剂量免疫之后ID/SQ+EP免疫得到高水 平的HIVgag抗体滴度。在两次免疫之后，ID/SQ+EP组的HIVgag终点滴度是IM+EP组的两 倍。
[0171] 在这些实验中，我们使用皮肤针状电极递送至ID/SD区室，并比较所得免疫应答与 頂+EP之后得到者(见表1)。 表1.经頂或ID/SQ途径通过电穿孔诱导的免疫应答的比较。显示了 3次高剂量（l.Omg/ 抗原）免疫后IFNyELISpot和HIVgagELISA结果。
实施例8使用皮肤EP在小鼠中进行DNA接种 A. 质粒构建体
[0172] 在实验1和3中（Exp. 1和Exp.3)使用普遍存在的细胞巨化病毒（启动子)或肌肉特 异性合成启动子(SPc5-12)驱动人分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)在pSEAP-2基本载体中的 表达。野生型绿色荧光蛋白（GFP)表达质粒pEGFP-Nl的红移变异体(其经优化在哺乳动物细 胞中具有更亮的荧光和更高的表达(最大激发光= 488nm;最大发射光= 507nm))用于报告 基因实验中（Exp. 2)。使用可商业购买的试剂盒(Qi