agenInc.，Chatsworth，CA)获得质粒。 经KineticChromagenicLAL(Endosafe，Charleston，SC)测定外毒素水平低于0 · 01EU/yg〇 通过分析在近几年内被证明对人具有致死性的16H5病毒的原始病毒序列和多于40种人NI 病毒生成一致序列HA和NA。从LosAlamosNationalLaboratory's流感序列数据库下载这 些序列。在生成一致序列之后，将构建体优化用于哺乳动物表达，包括添加Kozak序列、密码 子优化和RNA优化。然后将这些构建体亚克隆至pVAX载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。除非 另外指明，在无菌水中稀释质粒制剂并用多聚L谷氨酸钠盐配制成1 %重量/重量(MW= 10 · 5kDa平均）（Sigma，St·Louis，M0)，在VGXPharmaceuticals，ImmuneTherapeutics Division(TheWoodlands，TX)进一步HPLV纯化。 B. 小鼠中的报告基因表达
[0173] 这一实验检测SEAP或EGFP表达质粒的递送和表达以确定哪些电穿孔参数(最低有 效电流）、延迟时间（注射和开始电穿孔之间的时间）、制剂和目标肌肉影响表达和抗体水 平。使用CELLECTRA?皮肤EP装置(包括使用3X规格26电极）用各种电流和用于IM或ID注射 的延迟时间电穿孔动物。
[0174] 在第一个实验(Exp.l)中，将10yg在肌肉特异性合成启动子(pSPc5-12_SEAP)控制 下表达SEAP的质粒注射至C57/B16小鼠组的胫骨前肌(TA)或腓肠肌(G)肌肉中，延迟时间为 4或80秒，恒定电流为0.1A。对照组TA注射质粒而不进行EP(无EP)。其它组的动物TA或G肌肉 接受等摩尔的无质粒骨架(NB)但是具有相同的启动子、转基因和3'多腺苷酸化信号的表达 盒，不进行EP。
[0175] 在第二个实验(Exp. 2)中，给小鼠组(n= 4HM或ID注射总体积分别为5或25yL的50 ygpCMV-EGFP，终质粒浓度为10mg/mL或2mg/mL。对剖离组织和肌肉部分照相并在注射后5 天测量荧光。对经处理组的身份不了解的独立观察着对经处理区域评分。与具有最高表达 的样品相比基于分布面积和荧光强度计算数字评分(0 =无荧光，无分布;5 =最亮荧光、最 大分布）。
[0176] 在第三个小鼠实验(Exp. 3)中，总共使用80只小鼠，分为16组，每组5只（表2)。以不 同制剂（盐水、盐水+1 %LGS、水、水+1 %LGS)和电流强度给小鼠（η= 5/组)注射50ygCMV-SEAP(10mg/mL)。以4秒延迟时间和不同电流(0.1A至0.2A)对ΤΑ或G肌肉IM注射的动物进行 电穿孔。 表2小鼠中CMV-SEAP制剂实验的分组
[0177] 在所有情况下，使动物适应三天，称重并在耳朵进行标记。在整个实验过程中可随 意获取食物和水。在研究一开始称重动物、采血并使用啮齿类组合麻醉剂麻醉，即甲苯噻嗪 (37.511^/11^ ;0.051111730克体重）、氯胺酮（1.911^/11^;0.0161111710克体重）、乙酰丙嗪 (0.37mg/mL;0.025mL/15克体重），根据设计给予质粒并进行电穿孔。对于实验1和实验3,眼 眶后采血并使其凝结。离心所有收集的血液以分离血清和血浆，接着分装至置于冰上的试 管中用于SEAP测定法和抗-SEAPELISA，如之前所进行并存在较小的修改。第14天后，在手 术麻醉计划下将动物放血。 C. 分析 血液收集
[0178] 在第0、4、7和11天称重小鼠并分别眼眶后采血至微量离心管中。使血液在室温下 凝结10至15分钟并接着于3000Xg离心10分钟，将血清储存于-80°c用于进一步分析。 SEAP测定法
[0179] 将血清样品冻融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit (AppliedBiosystems，Bedford，MA)根据操作说明对50yL进行分析。该测定法的检测下限 为3pg/mL。测定SEAP活性之前在小鼠血清中1:10稀释更浓缩的血清样品。使用LUMIstar Galaxy光度计(BMGLabtechnologies，0ffenburg，Germany)读数所有样品。 SEAP间接ELISA
[0180] 在小鼠中使用以下经修改的操作测定对人SEAP蛋白的免疫原性。用经纯化的roS 中的人胎盘碱性磷酸酶(每100yL包含100纳克/孔的人胎盘碱性磷酸酶(Sigma))在4°C包被 NuncMaxisorb(Rochester·ΝΥ)板过夜。倾倒板子并洗涤三遍。用含有1 %BSA(Sigma)和 0.05 %吐温20的roS封闭板子并于室温下温育2小时。将样品1:100稀释并接着在单独的稀 释板中用含有1 %BSA(Sigma)和0.05 %吐温20的PBS以1:4序列稀释。将封闭液从板中倾倒 出。向各孔中加入l〇〇yL经稀释的待测血清并于室温下温育2小时。倾去血清稀释液并洗涤 三次。在含有l%BSA(Sigma)和0.05%吐温20的？83中以1:1000稀释第二抗体(与辣根过氧 化酶结合的兔抗小鼠抗体)并于试问下温育1小时。倾倒板子并洗涤。将每孔l〇〇yL的邻苯二 胺(0PD)底物加入(0.67mg/mL)0.1M柠檬酸缓冲液中并温育8分钟;加入100yL1MH2S〇4终止 反应。在SpectramaxPlus384读板仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上于490nm测量 吸光度。 D. 小鼠中的结果 SEAP表达依赖于目标肌肉
[0181] 与G肌肉相比如果将SEAP表达质粒注射剂给予TA(图22)，注射和使用皮肤EP装置 进行EP之间的时间为80s和4s，则表达增加。当将SPc5-12-SEAP质粒注射至TA肌肉时，血清 SEAP水平比在不进行EP条件下接受质粒的对照动物高285倍(P<1.3E-21);未发现80s和 4s延迟时间对于TA肌肉的差异(357±6^.357±6.2?8/1111^);在相同条件下注射至6肌肉 得到比对照高90至182倍的SEAP水平(G80svs.无EP对照，P<0.003;G4svs.无EP对照，P <7.7E-0.6)。当以等摩尔制剂将仅包含表达盒的质粒片段注射至TA和G(无骨架(NB)，但是 具有相同的启动子、转基因和3'多腺苷酸化信号），表达水平比未接受IM+EP的对照组高 210-250倍（（80svs·无EP，P< 1 · 8E-08;4svs·无ΕΡ，Ρ<3 · 8E-05)JA80S中的SEAP表达比 NB80s组高24%(P<0.004)。给予C5-12-SEAP和NB而不进行EP(无EP)的两组均显示可忽略 不计的SEAP表达。 GFP表达
[0182] 仔细剖离注射部位后观察GFP表达并由不了解处理组的观察者评分。ID(4.63土 0.24vs. 3.25 ± 0.14，P= 0.01)和頂注射动物中给予浓缩质粒的组与非浓缩质粒组相比GFP 评分更高（图23)。在这些研究中浓缩制剂(高至10mg/mL)与更高的总体表达相关。基于这一 实验的结果，实验3中以1Omg/mL的浓度使用质粒。 SEAP表达依赖于制剂和电流强度
[0183]当SEAP转基因由普遍存在的启动子(相对于实验1中使用的肌肉特异性启动子)控 制时评价SEAP水平的差异。与之前的实验一致，与G肌肉（P= 0.05)相比如果质粒注射-EP操 作在TA中进行（图24)则表达增加。在这一具体实验中，与盐水制剂相比盐水+LGS制剂得到 更高的血清SEAP水平(分别为41 ·l±7.9pg/mL/gvs.31.0±5.9pg/mL/g)，尽管由于组内差 异性并未达到统计学显著性。总体而言，与接收相同LGS质粒制剂并以0.2A恒定电流递送的 动物相比以0.1A电流设置进行电穿孔的动物得到更高的SEAP表达。此外，接受0.2A以水配 制的质粒的动物与相同肌肉接受〇 . 1A的动物相比得到显著较低的SEAP水平（对TA，P< 0.05;对G，P<0.001)。当将LGS加入水制剂时对ΤΑ肌肉的差异并不显著但是对G肌肉仍然保 持(Ρ<0·04)。 抗SEAP抗体的诱导
[0184]SEAP质粒与盐水+LGS的制剂得到更高的蛋白表达，但是与注射用水+LGS配制的 SEAP质粒的动物相比抗SEAP抗体的滴度更低（图25)，尽管由于组内差异性并未达到统计学 显著性。 实施例9灵长类中皮内递送和肌肉内递送的比较 灵长类血清 1%马血清中A/vietnam/2003/04HI滴度
DNA构建体 1.HIVEvnCladeA 2.HIVEvnCladeC 3.HIVEvnCladeD 4.HIVGag 5.HIVPol 6.FluH5 7.FluNA 8.FluM2NP 9.HPV16E6/E7 10.HPV18E6/E7 11.IL2
[0185]在这些实验中免疫猕猴。在起始实验之前使动物适应2个月。按以下进行实验:第Ο 周进行第一次免疫(质粒剂量给予)和基线采血;第2周进行采血;第三周进行第2次免疫(质 粒剂量给予）；第5周进行采血;第6周进行第三次免疫(质粒剂量给予)和采血;第8周进行采 血。
[0186]所有质粒均以水配制为10mg/mL，用于注射+1%LGS，如之前实施例所描述，并与各 实验组的单溶液混合物(A-Η组，上表中）。计算命名为頂CELLECTRA?IDCELLECTRA?和 IM注射器的各组的准确注射体积。对于ID给药，如果所要求注射剂量超过每个位点100yL， 将制剂分至数个注射位点（2、3或6,取决于总共给予多少毫克的疫苗）。接受IM注射的动物 将在一个注射位点给予全部制剂。
[0187] 在上述实施例中用于猪实验和非人类实验的CELLECTRA?适应性恒流装置也用于 这些非人灵长类实验中。电穿孔条件如下:对于頂注射和电穿孔组，条件为:〇.5Amps，52毫 秒/脉冲，三次脉冲，质粒注射和电穿孔之间4秒延迟。对于ID注射和电穿孔组，条件为： 0.2Amps，52毫秒/脉冲，三次脉冲，质粒注射和电穿孔之间4秒延迟。
[0188]红细胞凝集抑制反应测定法-通过用三份血清稀释一份酶并于37°C水浴中温育过 夜用受体破坏酶(RDE)处理猴血清。在56°C温育30分钟使酶失活，然后加入6份ros最终达到 1/10稀释。在V底96孔微量滴定板中进行HA测定法，使用病毒的HA单位和1 %马血红细胞。本 文显示的数据为第二次免疫后的结果(在第三次免疫之前采血）。
【主权项】
1. 一种体内电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉 冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括： 可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件； 包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组 件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织； 其特征在于 该电穿孔组件包含反馈机制； 多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并在递送脉冲过程中测定 期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至反馈机制；以及 其中所述反馈机制可接受已测定阻抗并可调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒 定电流。2. 权利要求1的装置，其中所述皮肤电极为针状电极、导电杆或导电薄膜区域。3. 权利要求1或2的装置，其中所述针状电极适应于接触真皮内或皮下组织而基本不刺 入肌肉组织。4. 权利要求1或2的装置，其中所述皮肤电极组件进一步包括： 活化器开关，以及 报告皮肤电极组件活化的状态指示器。5. 权利要求1或2的装置，其中所述电极阵列包括至少三个皮肤电极。6. 权利要求1或2的装置，其中所述三个皮肤电极具有等腰三角形的空间排列。7. 权利要求1或2的装置，其中多个皮肤电极可在程序化序列下通过对皮肤电极的控制 以分散模式递送能量脉冲，所述程序化序列由使用者输入至电穿孔组件。8. 权利要求1或2的装置，其中所述程序化序列包括按序列递送的多个脉冲，其中由至 少两个活性皮肤电极递送多个脉冲的各脉冲，所述活性皮肤电极中的一个为测量阻抗的中 性皮肤电极;并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个活性皮肤电极的另一个递送，所述 活性皮肤电极中的一个为测量阻抗的中性皮肤电极。9. 权利要求1或2的装置，其中反馈机制由类比闭环电路执行。10. 权利要求1或2的装置，其进一步包括： 接受使用者的输入并控制电穿孔组件以根据输入递送能量脉冲的控制器。11. 权利要求10的装置，其中所述控制器为单芯片微控制器。12. 权利要求1或2的装置，其进一步包括： 与电穿孔组件相连并与皮肤电极组件电子相连的电流波形发生器;其中使用者输入程 序化序列至电穿孔组件，其将程序化序列传递至电流波形发生器;其中所述电流波形发生 器可根据所提供的程序化序列生成电流脉冲串波形。13. 权利要求12的装置，其中所述电流波形发生器为功率晶体管类比电路。14. 权利要求1或2的装置，其进一步包括可检测皮肤电极与期望组织之间是否建立电 子连接的阻抗检测器。15. 权利要求1或2的装置，其进一步包括与电穿孔组件连接的波形记录器;其中所述波 形记录器可在能量脉冲递送过程中持续记录电穿孔电压和电流波形。16. 权利要求1或2的装置，其进一步包括与使用者和电穿孔组件直接通信的输入装置， 所述输入装置可接受输入指令并将该输入指令传送至电穿孔组件;其中所述输入装置为数 字式键盘或触屏。17. 权利要求1或2的装置，其进一步包括与电穿孔组件连接的状态报告元件。18. 权利要求1或2的装置，其进一步包括与电穿孔组件相连的通信端口，与电穿孔组件 相连的存储器组件，或与电穿孔组件相连的能量源，或它们的组合。19. 权利要求1或2的装置，其中所述电极阵列为一次性的并与皮肤电极组件可移除地 连接;其中所述一次性电极阵列为皮肤电极盘。20. 权利要求1或2的装置，其中所述电穿孔组件包括： 控制器； 与该控制器电子连接的波形发生器； 与该控制器电子连接的波形记录器；以及 与波形发生器电子相连的电池;其中 所述控制器接受来自使用者的输入，指示波形发生器根据输入向期望组织递送能量脉 冲并根据所递送的能量脉冲将数据传送至波形记录器并且其中 所述电池向波形发生器发送电荷，所述电池为锂离子、镍金属氢化物、铅酸或镍镉电 池。21. 权利要求1~20任一项的装置在制备用于向哺乳动物期望皮肤组织递送能量脉冲 以在所述期望组织细胞中引起电穿孔发生的方法的试剂盒中的用途，所述装置经装配以递 送能量脉冲，产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，所述方法包括： 将多个针状皮肤电极插入皮肤组织而基本不刺入肌肉组织;和 向多个针状皮肤电极施加能量脉冲以向皮肤组织递送与预设定电流相等的电流； 使用多个针状皮肤电极中的一个中性电极测量皮肤组织中的阻抗并响应所测量阻抗 使用电穿孔装置中的反馈机制调节施加的能量脉冲以维持递送至皮肤组织的电流恒定。22. -种体内电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉 冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括： 可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件； 包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组 件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织； 其特征在于 该电穿孔组件包含反馈机制； 多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并在递送脉冲过程中测定 期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至反馈机制；以及 其中所述反馈机制可接受已测定阻抗并可在脉冲持续期间持续和即时调节电穿孔组 件递送的能量脉冲以维持恒定电流。23. -种体内电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉 冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括： 可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件； 包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组 件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织； 其特征在于 该电穿孔组件包含反馈机制； 多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并在递送脉冲过程中测定 期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至反馈机制，其中所述多个皮肤电极可以以分散模式 递送能量脉冲；以及 其中所述反馈机制可接受已测定阻抗并可持续和即时调节电穿孔组件递送的能量脉 冲以维持恒定电流。24. -种体内电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉 冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括： 可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件； 包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组 件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织，其中所述电极阵列 在所述皮肤电极四周产生均一压力，且在所需组织中生成均一的电场； 其特征在于 该电穿孔组件包含反馈机制； 多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并在递送脉冲过程中测定 期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至反馈机制；以及 其中所述反馈机制可接受已测定阻抗并可调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒 定电流。25. -种体内电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉 冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括： 可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件； 包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组 件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织； 其特征在于 该电穿孔组件包含反馈机制； 多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并在递送脉冲过程中测定 期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至反馈机制，其中所述多个皮肤电极以分散模式递送 能量脉冲；以及 其中所述期望组织是皮下或真皮内组织，且所述反馈机制可接受已测定阻抗并可在脉 冲持续期间持续和即时调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
【专利摘要】本发明涉及电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法。本发明涉及电穿孔装置和用该装置有效促进将生物分子导入身体特定组织(特别是皮肤例如真皮内或皮下组织)的细胞的方法。在某些方面，本发明是皮肤EP装置，其产生能量脉冲，用皮肤电极阵列将能量脉冲递送至皮肤组织，并基于使用者的输入在该皮肤组织维持恒定电流，包括预设定电流，并能够存储和获取电流波形数据。
【IPC分类】A61N1/32
【公开号】CN105457157
【申请号】CN201510716613
【发明人】R.德雷希亚-阿克利, A.S.韩, M.A.波普, P.A.布朗
【申请人】Vgx药品公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2007年10月17日
【公告号】CA2666501A1, EP2066399A1, EP2409727A1, US20080091135, WO2008048632A1, WO2008048632A8