著抑制了 4T1乳腺癌的生长（P〈0. 05 ;图5A)。但是VNP(phoP/Q_)与VNP20009表现出相似的抗肿瘤 作用（P〈〇. 05 ;图5A)。肿瘤倍增时间由PBS对照组的5. 30天（Cl，4. 5天一6. 25天）显著 延长到VNP20009 组的 7. 13 天（Cl，6. 64 天一7. 70 天）和VNP(phoP/Q-)组的 7. 33 天（Cl， 6. 52天一8. 38天）（P〈0. 05 ;图5B和表1)。肿瘤生长延迟时间由PBS对照组的15. 62天 (Cl，15. 41 天一15. 91 天）明显增加到VNP20009 组的 22. 07 天（Cl，21. 51 天一22. 72 天） 和VNP(phoP/Q-)组的 23. 27 天（Cl，22. 24 天一24. 60 天）（P〈0. 05 ;图 5C和表 1)。
[0086] 本发明还将VNP(PhoP/Q_)用于十多种不同的实体肿瘤的抗肿瘤效果分析，都获 得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)在十多种不同的实体肿瘤中都具有与VNP20009表现出 相似的抗肿瘤作用。
[0087] 本发明还将VNP(PhoP/Q-)与化疗（紫杉醇、顺钼等）、放疗、生物治疗（抗体药物、 恩度、TRAIL等）、中药（雷公藤多甙、冬凌草甲素等）用于联合治疗十多种不同的实体肿瘤 的抗肿瘤效果分析，都获得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)可以与化疗、放疗、生物治疗、 中药联合治疗肿瘤，发挥更好的抗肿瘤效果。
[0088] 表1.细菌应用对于肿瘤生长和生存率疗效的回归分析
[0089]
[0090]a从最初治疗开始以对应时间（d,days)的体积（V，cm3)做回归生长曲线，相关系 数以r表明。
[0091]b肿瘤倍增时间来于指数增长曲线。*P〈0. 05，PBS组与VNP20009组和VNP(phoP/ Q-)组相比。
[0092] c生长延迟时间以达到1000_3的时间间隔来确定。*P〈0. 05，PBS组与VNP20009 组和VNP(phoP/Q-)组相比。
[0093] 免疫荧光检测
[0094] 将肿瘤体积生长达到150mm3的4T1乳腺癌荷瘤小鼠随机分为2组。一组小鼠腹 腔注射100UL转入pRNAU6.IRNA干扰质粒（表达EGFP)的VNP20009,另一组小鼠腹腔注 射100iiL转入pRNAU6.IRNA干扰质粒的VNP(phoP/Q-)。治疗6天后，处死两组小鼠并 使用标准程序制备冰冻肿瘤切片。为了分析4T1肿瘤细胞的EGFP表达水平，4T1肿瘤细胞 用大鼠抗小鼠CD44(BDPharmingenTM，USA)染色。二抗使用Cy3标记的山羊抗大鼠IgG抗 体（JacksonImmunoResearch,USA)。细胞的细胞核用DAPI染色。EGFP的表达表明了肿瘤 细胞中的干扰质粒表达shRNA的能力。
[0095] 本发明具体分析了VNP(phoP/Q_)能否释放shRNA表达质粒载体进入宿主细胞的 胞浆中以便制备shRNA。干扰载体pRNAU6.IRNA(表达EGFP)通过VNP20009和VNP(phoP/ Q-)靶向进入乏氧肿瘤组织。EGFP的表达表明在乏氧肿瘤细胞中出现了干扰质粒的shRNA 表达。低功率透镜下的免疫荧光结果表明VNP(ph〇P/Q-)-pRNAU6.IRNA感染的小鼠乏氧肿 瘤组织的EGFP表达水平与VNP20009-pRNAU6.IRNA感染的小鼠相比明显提升（图6A)。我 们进一步通过共定位确定了表达EGFP的细胞，结果显示EGFP蛋白是由4T1肿瘤细胞和巨 噬细胞表达（图6B和6C)。总之，VNP(phoP/Q_)能够释放shRNA表达质粒进入4T1肿瘤细 胞和巨噬细胞的胞浆中表达shRNA和EGFP蛋白。
[0096] 小鼠STAT6基因RNA干扰片段的设计
[0097] 根据Genbank提供的小鼠STAT6序列，按照siRNA设计原则设计两对STAT6siRNA 片段，序列片段如下：siSTAT6-lsense:5'-CGAAUGUGAUACAACUGUAUC-3' ； siSTAT6-lantisense:5'-UACAGUUGUAUCACAUUCGAG-3'。
[0098] 本发明利用VNP(PhoP/Q-)菌株携带具有干扰效果的siSTAT6表达质粒 pSi-STAT6(含有EGFP基因）。本发明分析了VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在肿瘤细胞中释 放干扰质粒的效果和对乏氧的肿瘤组织的细胞中STAT6mRNA表达的影响。siSTAT6表达质 粒携带的EGFP的免疫荧光分析显示：VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6处理的肿瘤组织中CD44阳 性的4T1乳腺癌细胞中有明显的EGFP表达，而在VNP(PhoP/Q-)处理的肿瘤组织中未观察 至IJ。说明VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在乏氧肿瘤组织中感染细胞后能够释放干扰质粒，并 启动干扰质粒的表达。本发明还进一步提取了肿瘤组织总RNA，采用实时荧光定量PCR分 析了不同治疗肿瘤组织中STAT6mRNA的表达水平，结果显示VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6(简 称VpSi-STAT6)应用于治疗的乏氧肿瘤组织中STAT6mRNA的表达水平较PBS和VNP(PhoP/ Q-)-pSi_Vector空载质粒感染组（简称VpSi-Vector)显著性下降（P〈0. 05)。而PBS和 VNP(PhoP/Q-)-pSi-Vector空载质粒感染组治疗组之间STAT6mRNA的表达水平比较无差异 (P>0. 05)(图 7)。
[0099] 本发明还将VNP(PhoP/Q-) -pSi_STAT6用于十多种不同的实体肿瘤的STAT6RNA干 扰，都获得了类似的同时下调STAT6mRNA的表达水平和表达EGFP基因的结果。
[0100] 本发明还将VNP(PhoP/Q-) -pSi-STAT6与化疗（紫杉醇、顺钼等）、放疗、生物治疗 (抗体药物、恩度、TRAIL等）、中药（雷公藤多甙、冬凌草甲素等）用于联合治疗十多种不 同的实体肿瘤的抗肿瘤效果分析，都获得了类似的结果，即VNP(Ph〇P/Q-)-pSi-STAT6可以 与化疗、放疗、生物治疗、中药联合治疗肿瘤，发挥更好的抗肿瘤效果。
[0101] 可以理解的，可以直接在purl和msbB基因已经突变的VNP20009菌株上构建上述 用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株。
[0102] 可以理解的，可以在phoP和phoQ基因已经突变的沙门氏菌菌株上构建上述用于 哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株。
[0103] 可以理解的，可以在野生型沙门氏菌菌株上构建上述用于哺乳动物细胞中RNA干 扰的沙门氏菌菌株。
[0104] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详 细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡 在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，其特征在于：其是含有purl、 msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。2. 如权利要求1所述的沙门氏菌菌株，其特征在于：所述沙门氏菌菌株可携带表达质 粒、在细胞内同时表达RNA干扰和基因表达。3. 如权利要求1所述的沙门氏菌菌株，其特征在于：所述沙门氏菌菌株能够高丰度富 集于乏氧环境。4. 一种权利要求1所述的沙门氏菌菌株的制备方法，其特征在于：扩增2个末端含有 拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，转入拟敲除的沙门氏菌 中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获 得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终获得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因 敲除的沙门氏菌突变菌株。5. -种权利要求1所述的沙门氏菌菌株的制备方法，其特征在于：扩增2个末端含有 拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，将PCR产物片段克隆在 PKD46质粒中，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码 序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终 获得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。6. -种含有权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株的药物。7. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备抗乏氧组织相关疾病药物中 的应用。8. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备基因治疗药物中的应用。10. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备RNA干扰药物中的应用。11. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治 疗性能的药物中的应用。12. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治 疗性能的抗乏氧组织相关疾病药物中的应用。13. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治 疗性能的抗肿瘤药物中的应用。14. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治 疗性能的抗乳腺癌药物中的应用。15. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物与化疗、放疗、生 物治疗、中药治疗药物或方法的联合应用。16. 如权利要求1-5任一项中所述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治 疗性能的抗肿瘤药物与化疗、放疗、生物治疗、中药治疗药物或方法的联合应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，其是含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。同时，本发明还公开了该沙门氏菌菌株的制备方法及应用。
【IPC分类】A61K48/00, A61P35/00, C12N15/09, A61K35/74, C12R1/42, C12N1/20
【公开号】CN105087418
【申请号】CN201410209851
【发明人】华子春, 程侠为, 张晓昕
【申请人】江苏靶标生物医药研究所有限公司, 常州南京大学高新技术研究院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月16日