A干扰的沙门氏菌菌株，对包括肿瘤在内的乏 氧组织生长抑制能力与VNP20009相近。
[0034] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，能够在宿主细胞中比 VNP20009更为有效地释放shRNA表达和基因表达质粒，作为RNA干扰和基因表达的输送载 体高效沉默靶基因并表达特定基因。
[0035] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，能够在包括肿瘤组 织在内的乏氧组织中发挥作为RNA干扰和进行基因表达的输送载体的作用，有效地释放 shRNA表达和基因表达质粒，在组织中高效沉默靶基因并表达特定基因，VNP20009则不具 备该种功能。
[0036] 本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在干扰 细胞内基因表达并进行基因表达的应用：将含有RNA干扰和表达基因（例如EGFP)的表达 质粒转染上述一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌，然后以与细胞：细菌按一定 的比率（1:3-1:30)加入到培养细胞中。细胞在37°C温育1小时对细菌进行吞噬作用，并 用PBS除去游离的细菌，含有RNA干扰和表达基因（例如EGFP)的表达质粒即可在细胞中 发挥RNA干扰作用，沉默靶基因并表达特定基因。
[0037] 本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在在 体内干扰之氧组织的基因表达并进彳丁基因表达的应用：将带有RNA干扰和表达基因（如 EGFP)表达质粒的所述用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株通过口服、静脉注射 或者腹腔注射动物体内，在乏氧组织中脾脏或者肿瘤中用免疫荧光观察要表达的目的基因 的表达情况，用定量PCR和免疫印迹westernblot方法验证RNA干扰靶基因表达的结果。
[0038] 本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在制备 抗肿瘤药物上的应用：将带有RNA干扰表达质粒的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙 门氏菌菌株通过口服、静脉注射或者腹腔注射到肿瘤动物模型体内，观察分析带有RNA干 扰表达质粒的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株的抗肿瘤效果。
[0039] 本发明的有益效果：（1)在体外细胞内更低的生存率：上述的一种用于哺乳动 物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)在体外细胞（包括巨 噬细胞、包括肿瘤细胞等不同类型的细胞）内的生存能力与VNP20009相比明显减弱，这 使得VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)在体外具有更好的生物安全性，不易在细胞内存活。 (2)在体内更低的毒副作用：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI/msbB/phoP/phoQ)感染正常小鼠的毒性效应比VNP20009显著降低、其对肝 脏和脾脏肿大的影响显著低于VNP20009。（3)在体内更好安全性和更高的乏氧组织特异 性：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purl/msbB/phoP/ PhoQ)感染动物后，在正常组织肝脏和脾脏中的细菌滴度比比VNP20009显著降低；但是 在荷瘤小鼠模型中，VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)感染小鼠乏氧（肿瘤）组织的细菌滴 度比VNP20009有显著增加。VNP(purI/msbB/phoP/phoQ)与VNP20009相比表现出优 异的安全性并具有更高程度的乏氧（肿瘤）组织特异性。（4)更好的RNA干扰质粒表达 效果：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purl/msbB/phoP/ phoQ)能够在细胞和组织水平表达质粒并释放干扰RNA，还能同时再进行目标基因的表达。 (5)更强的抗肿瘤应用效果：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)无论在单独应用，还是在携带RNA干扰表达质粒应用时都能 比VNP20009产生更好的抗肿瘤治疗效果。
【附图说明】
[0040]图 I.VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)[简写为：VNP(phoP/Q-)]感染正常小鼠的毒 性效应A.体重，*P〈0. 05,感染VNP(phoP/Q_)或VNP200093天后的体重与感染1，2天后的 体重相比。B.脾重。C.肝重，*P〈0.05,感染VNP(phoP/Q_)或VNP200093天后的肝重与感 染1，2天后的肝重相比。
[0041] 图2.正常小鼠肝脏和脾脏中免疫细胞亚群分析
[0042]A.肝脏中的⑶4+T细胞。B.肝脏中的⑶8+T细胞。C.肝脏中的F4/80+巨噬细胞。 D.肝脏中的Gr-I+粒细胞。E.脾脏中的⑶4+T细胞。F..脾脏中的⑶8+T细胞。G.脾脏 中的F4/80+巨噬细胞，*P〈0. 05,感染3天后VNP20009感染小鼠中的巨噬细胞与VNP(phoP/ Q-)感染小鼠相比。a脾脏中的Gr-I+粒细胞。
[0043]图 3.VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)在体外细胞内的生存。
[0044]A?巨噬细胞中细菌的数量，*P〈0.05,VNP20009与VNP(phoP/Q_)相比。B?肿瘤 细胞中细菌的数量，*P〈〇. 05,VNP20009与VNP(phoP/Q-)相比。
[0045] 图4.VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)在正常小鼠和荷瘤小鼠中的生物分布。
[0046]A-B?正常小鼠中肝脏和脾脏中的细菌滴度，*P〈0. 05，VNP20009与VNP(phoP/Q-) 相比。C.感染VNP20009和VNP(phoP/Q_)后荷瘤小鼠中肝脏，脾脏和乏氧肿瘤组织中的 细菌滴度，*P〈〇. 05,VNP20009 与VNP(phoP/Q-)相比。D?感染VNP20009 和VNP(phoP/ Q-)后荷瘤小鼠中乏氧肿瘤组织与肝脏和脾脏中的细菌滴度比例，*P〈〇.〇5,VNP20009与 VNP(phoP/Q_)相比。
[0047]图 5.VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)的抗肿瘤作用。
[0048]A?肿瘤生长曲线，*P〈0. 05，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q-)感染组相t匕。B?肿瘤倍增时间，*P〈0.05，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q_)感染组相比。 C.生长延迟时间，，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q-)感染组相比。
[0049]图 6.VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)释放质粒的作用。
[0050]A.乏氧肿瘤组织中EGFP的表达。B.乏氧肿瘤组织巨噬细胞中的EGFP表达。C.乏 氧肿瘤组织中4T1肿瘤细胞的EGFP表达。
[0051]图 7?带有 STAT6干扰质粒的 VNP(PhoP/Q-) -pSi-STAT6(简称 VpSi-STAT6)可在 肿瘤组织中的表达并下调STAT6的mRNA表达水平。
【具体实施方式】
[0052]VNP(purl/msbB/phoP/phoQ)的构建
[0053] (1)重组DNA片段的制备
[0054] 以在VNP20009菌株基础上进行构建的制备方法为例，VNP(phoP/Q-)的构建 依据文献报道的经典方法进行（DatsenkoKA等人，ProcNatlAcadSciUSA2000; 97:6640-6645)，按如下步骤进行：将沙门氏菌染色体上的phoP/phoQ基因被PCR扩增产生 的带有卡那霉素（Kna)抗性的基因片段所取代。这一卡那霉素抗性片段是以pkd4质粒为 模板通过PCR扩增所得，所使用的引物序列如下：
[0055]PhoP-F:
[0056] 5 '-CACCATAATCAACGCTAGACTGTTCTTATTGTTAACACAAGGGAGAAGAGGTGTAGGCT GGAGCTGCTTC-3'，
[0057] phoQ-R:
[0058] 5 '-CGATTATAACGGATGCTTAACGAGATGCGTGGAAGAACGCACAGAAATGTCATATGAATATCCTCC TTAG-3，。
[0059] 在以上引物的5'末端包含有与phoP/phoQ基因同源的40-50碱基对。PCR产物用 来通过RedA基因重组系统取代ph〇P/ph〇Q基因的编码序列。
[0060] 为了获得用于基因重组的PCR产物，将10ill的5XPrimeSTAR缓冲液 (Mg2+Plus)、4ul的dNTP混合液（各 2. 5mM)、1 的PhoP-F: (25pmol/L)、1 的 PhoP-F: (25pmol/L)、Iill的pKD4 质粒、Iill的PrimeSTAR酶及 32ill的重蒸水混合形成 反应混合物，该反应混合物的总体积为50yl。
[0061] 将上述反应混合物在下述反应条件下进行PCR扩增：94°C预变性5min后进行 94°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸2min、30个循环，然后72°C延伸IOmin后保存于4°C。 PCR扩增结束后取IOiUPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，检测条带特异性。为了增加 PCR浓度，将10管50iU的反应体系混合，用乙醇沉淀法进行浓缩。样品最终溶于19iU无 菌双蒸水中，备用。
[0062] 经浓缩的PCR产物片段进行甲基化处理：将17iU的PCR产物片段、IiU的 DnpI、2ii1的IOXbuffer进行混合后，置于37°C水浴锅中反应Ih,再采用乙醇沉淀法回 收PCR产物片段，溶于无菌双蒸水，存于4°C备用。PCR产物用来通过RedA基因重组系统取 代phoP/phoQ基因的编码序列。
[0063] (2)携带pKD46质粒的VNP20009菌株制备和诱导
[0064] 制备VNP20009的电转化感受态，将pKD46质粒电转化进入VNP20009菌株，涂布于 含AMP抗性的LB平板上，置于30°C培养16h后挑取菌落，接种于液体LB培养基中培养至 过夜，次日按照1 :100接种携带PKD46质粒的菌株VNP20009于25mlLB培养基中，并加入 阿拉伯糖，使其终浓度为〇. 1M，然后30°C培养4h后，5000rpm/min离心5min收集细菌，用 预冷的无菌双蒸水洗涤4次，然后重悬于80 10 %甘油中，冰上放置30min后，加入800ng 的I. 2.I. 1浓缩的DNA片段，冰上静置5min后，电转化，然后向电转化溶液中加入350ml的SOC培养基，在30°C培养30min，离心细菌