本发明涉及细胞领域，特别涉及培养基及葡萄细胞次生代谢物的制备方法。
背景技术：
：葡萄籽原花青素是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8键共价相连组成的多聚体。由于这类物质的分子中具有多电子的羟基部分，使它拥有较强的抗氧化、清除自由基和抑制脂质过氧化的能力，是目前发现的最强效的氧自由基消除剂和脂质过氧化抑制剂之一。衰老是生命过程中必然出现的极其复杂的生理现象，目前最具有代表性的衰老学说之一是1956年Harman提出的自由基学说。Das等的研究表明，人体内存在清除自由基的防御系统，包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)等抗氧化酶系。随着年龄的增长，抗氧化防御物质的合成和活性下降，大量代谢产物丙二醛(malondialdehyde，MDA)产生，机体产生和清除自由基的平衡被破坏，自由基堆积，加速机体衰老。目前葡萄的原花青素均用化学提取法。存在如下问题：1.化学合成方法工艺复杂。2.安全性低，生产过程中使用大量有机溶剂，极易残留在成品中。3.受限于葡萄的生长季节，影响成品的产量。4.细胞大量培养具有浓缩有效物的功效。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种培养基及葡萄细胞次生代谢物原花青素的制备方法。本发明利用葡萄细胞培养物中的次生代谢物(葡萄细胞培养过程中合成并释放至培养液中具生物活性物质的总称)含有原花青素，将其次生代谢物收集进行冻干保存。利用原花青素具抗氧化功效，达到抗衰老的目的，可将该冻干粉运用到化妆品中。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种培养基，包括2,4-D、6-BA和基础培养基。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基所述2,4-D在所述培养基中的浓度为0.2～2.0mg/L；所述6-BA在所述培养基中的浓度为0.5～2.0mg/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基还包括葡萄糖。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为1.0～5.0g/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述基础培养基为MS培养基。本发明还提供了所述培养基在培养葡萄细胞制备次生代谢物中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述次生代谢物为原青花素。本发明还提供了一种葡萄细胞次生代谢物的制备方法，包括如下步骤：步骤1：获得葡萄细胞；步骤2：取步骤1获得的葡萄细胞与本发明提供的培养基混合后初步培养，再与本发明提供的所述培养基混合后扩大培养，收集培养液。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述葡萄细胞的制备方法为取葡萄果皮与基础培养基、纤维素酶和果胶酶混合后酶解，过滤，收集滤液。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述纤维素酶的加入量为所述葡萄果皮质量的0.2～1.0％，优选为0.5～1.0％；所述果胶酶的加入量为所述葡萄果皮质量的0.1～0.5％。在本发明的一些具体实施方案中，所述纤维素酶的酶活为30000U/mg，所述果胶酶的酶活为50000U/mg。在本发明的一些具体实施方案中，纤维素酶和果胶酶的体积比2:1。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解的时间为1.5小时。在本发明的一些具体实施方案中，所述初步培养的条件为：取葡萄细胞加入I号灭菌培养基将葡萄细胞株配制成5～10×105/ml密度的葡萄细胞液，取100ml葡萄细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以90～150rpm/min，25～26℃，培养14天。I号灭菌培养基的配方如下：I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.2～1.0mg/L6-BA1.0～2.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素。在本发明的一些具体实施方案中，所述扩大培养的条件为：经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将葡萄细胞配制成5-8x106/ml密度的葡萄细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，25-50rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.001-0.005m3/s，培养7天。Ⅱ号灭菌培养基的配方如下:Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0～2.0mg/L6-BA0.5～1.5mg/L葡萄糖1.0～5.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素。在本发明的一些具体实施方案中，步骤2收集培养液之后，还包括过滤、浓缩，收集浓缩液后除菌，冻干的步骤。在本发明的一些具体实施方案中，所述冻干为于-20～-35℃，真空度为50～200Pa的条件下，冻干24～36小时。本发明还提供了所述的制备方法制得的葡萄细胞次生代谢物。在本发明的一些具体实施方案中，所述葡萄细胞次生代谢物为原花青素。本发明还提供了所述葡萄细胞次生代谢物在制备抗脂质过氧化的药物、食品和/或化妆品中的应用。此外，本发明还提供了所述葡萄细胞次生代谢物在制备抗衰老的药物、食品和/或化妆品中的应用。本发明提供了一种培养基，包括2,4-D、6-BA和基础培养基。通过该培养基以及本发明提供的方法制得的葡萄细胞培养物中的次生代谢物(葡萄细胞培养过程中合成并释放至培养液中具生物活性物质的总称)含有原花青素，将其次生代谢物收集进行冻干保存。利用原花青素具抗氧化功效，达到抗衰老的目的，可将该冻干粉运用到化妆品中。具体实施方式本发明公开了一种培养基及葡萄细胞次生代谢物原花青素的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了一种山竹细胞次生代谢物的制备方法，包括如下步骤：获取葡萄细胞株：取1kg新鲜含葡萄籽的葡萄进行清洗消毒，浸在10L15％～20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的葡萄果皮，用灭菌后的研磨碾碎葡萄。将碾碎后的葡萄转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g葡萄果皮加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，加入0.2～1.0％(w/w)纤维素酶和0.1～0.5％(w/w)果胶酶，消化1.5小时。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得葡萄细胞株。葡萄细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将葡萄细胞株配制成5～10×105/ml密度的葡萄细胞液，取100ml葡萄细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以90-150rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将葡萄细胞配制成5-8×106/ml密度的葡萄细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，25-50rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.001-0.005m3/s，培养7天。葡萄细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集葡萄细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa，冻干时间为24～36小时，即得到葡萄细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。本发明采用植物细胞培养法提取葡萄中的原青花素。并对提取出的原花青素进行冻干处理，易于保存和应用，增大稳定性。1.提取工艺稳定，有效成分浓度大，并能保存其活性。2.安全性高，不残留有机溶剂。3.不受限于葡萄的生长季节影响。本发明提供的培养基及葡萄细胞次生代谢物原花青素的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1获取葡萄细胞株：取1kg新鲜含葡萄籽的葡萄进行清洗消毒，浸在10L15％～20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的葡萄果皮，用灭菌后的研磨碾碎葡萄。将碾碎后的葡萄转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g葡萄果皮加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，加入0.2％(w/w)纤维素酶和0.3％(w/w)果胶酶，消化1.5小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得葡萄细胞株。葡萄细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将葡萄细胞株配制成5-10×105/ml密度的葡萄细胞液，取100ml葡萄细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以90-150rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将葡萄细胞配制成5-8×106/ml密度的葡萄细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，25-50rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.001-0.005m3/s，培养7天。表1I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.2mg/L6-BA2.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表2Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L葡萄糖3.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素葡萄细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集葡萄细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-20℃，真空度为120Pa，冻干时间为24小时，即得到葡萄细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例2获取葡萄细胞株：取1kg新鲜含葡萄籽的葡萄进行清洗消毒，浸在10L15％～20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的葡萄果皮，用灭菌后的研磨碾碎葡萄。将碾碎后的葡萄转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g葡萄果皮加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，加入1.0％(w/w)纤维素酶和0.1％(w/w)果胶酶，消化1.5小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得葡萄细胞株。葡萄细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将葡萄细胞株配制成5-10×105/ml密度的葡萄细胞液，取100ml葡萄细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以90-150rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将葡萄细胞配制成5-8×106/ml密度的葡萄细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，25-50rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.001-0.005m3/s，培养7天。表3I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.0mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表4Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D2.0mg/L6-BA1.0mg/L葡萄糖1.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素葡萄细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集葡萄细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时，即得到葡萄细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例3获取葡萄细胞株：取1kg新鲜含葡萄籽的葡萄进行清洗消毒，浸在10L15％～20％次氯酸钠中20分钟。倒去次氯酸钠溶液，在无菌条件下，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。在无菌的条件下，取下消毒后的葡萄果皮，用灭菌后的研磨碾碎葡萄。将碾碎后的葡萄转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g葡萄果皮加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培养基，加入0.5％(w/w)纤维素酶和0.5％(w/w)果胶酶，消化1.5小时。纤维素酶的酶活为30000U/mg，果胶酶的酶活为50000U/mg。用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，获得葡萄细胞株。葡萄细胞大量培养：加入I号灭菌培养基将葡萄细胞株配制成5-10×105/ml密度的葡萄细胞液，取100ml葡萄细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，以90-150rpm/min，25-26℃，培养14天。经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将葡萄细胞配制成5-8×106/ml密度的葡萄细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，25-50rpm/min，25-26℃，通入过滤空气，速率为0.001-0.005m3/s，培养7天。表5I号培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D0.6mg/L6-BA1.5mg/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素表6Ⅱ号灭菌培养基的配方(1LMS培养基中)名称含量名称含量2,4-D1.5mg/L6-BA0.5mg/L葡萄糖5.0g/L注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素葡萄细胞次生代谢物冻干粉的制备：收集葡萄细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-28℃，真空度为50Pa，冻干时间为30小时，即得到葡萄细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。实施例4次生代谢物冻干粉中原青花素的测定采用铁盐催化比色法。标准组：将原青花素配制成浓度为0、20、40、60、80、100mg/ml的标准溶液样品组1～3：实施例1～实施例3制备的冻干粉溶解成液体。混合液：按体积比85:5:0.4的正丁醇、浓盐酸、Fe3+离子混合液。样品和标准液各取1ml，均加9ml混合液，在水浴温度60℃，反应60min，取出后冷却，在550nm波长下测其吸光光度值A，得出其原青花素浓度。结果见表7。表7组别原青花素含量(mg/ml)样品组1(实施例1制备)86.4样品组2(实施例2制备)86.7样品组3(实施例3制备)85.7结论：本专利的植物细胞培养方法能成功提取出丰富的原青花素，且不同批次间的含量无明显差别(P<0.05)，证明方法稳定。实施例5葡萄次生代谢物冻干粉对大白鼠皮肤组织匀浆中MDA生成量的影响自由基形成后，其代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增高，MDA为极活泼的交联剂，它能使真皮结构发生大分子交联，使真皮纤维扭曲增粗紊乱，使人的皮肤在外观上日见衰老，MDA含量的高低可间接表征物质的抗脂质过氧化(即抗MDA生成)活性，MDA含量越小，表明物质的抗脂质过氧化能力越强；反之，则抗脂质过氧化能力越弱。将40只大白鼠分成4组，每组10只，去其背部被毛，暴露面积约6cm。，取同一批次的实施例1制得的葡萄细胞次生代谢物冻干粉，涂抹前将与其配对的2ml溶酶完全倒入冻干粉中，充分混匀，将2ml混合物全部均匀地涂抹至小鼠暴露的背部，每两天涂抹一次。第一组，连续涂抹实施例1制得的葡萄细胞次生代谢物冻干粉5次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第二组，连续涂抹实施例1制得的葡萄细胞次生代谢物冻干粉10次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第三组，连续涂抹实施例1制得的葡萄细胞次生代谢物冻干粉15次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第四组不涂抹实施例1制得的葡萄细胞次生代谢物冻干粉，30天后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。标准管取0.2ml10mol/ml标准品、标准空白管取0.2ml无水乙醇、测定管取0.2ml测试样品，然后三管均加入0.2ml试剂一，混匀后，均加入3ml试剂二和1ml试剂三。旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟。取上清，532mm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测各管吸光度值，检测各组的MAD含量。结果见表8。表8注：*表明与对照组之间数据有显著差异(P<0.05)结论：证明本发明提供的葡萄细胞次生代谢物冻干粉中的原青花素具有明显抗氧化作用(P<0.05)，随着使用天数的增加，效果有明显提升。取实施例2、实施例3制备的葡萄细胞次生代谢物冻干粉进行上述实验，实验结果与实施例1制备的葡萄细胞次生代谢物冻干粉的实验结果相近，与其无显著差异(P＞0.05)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3