一株高效防治美国白蛾的爪哇棒束孢BE01及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及爪哇棒束孢菌株及其在防治害虫方面的应用。

背景技术：

美国白蛾(Hyphandria cunea)又名秋幕毛虫、秋幕蛾，属鳞翅目(Lepidor tera)、灯蛾科(Arctiidae)、灯峨亚科(Arctiinae)，在很多国家都是一种重要的害虫。该虫原产于北美，20世纪40年代末，通过人类活动和运载工具传播到欧洲和亚洲降。1979年我国辽宁省丹东地区首次发现美国白蛾，其造成严重危害，后又传播到北京、天津、河北、山东和山西等省市。目前，由于这种侵入性的鳞翅目害虫的危害，已在林业和果树甚至在农业上引起了巨大的损失。此害虫的寄主几乎包含了所有的林木、果树、观赏植物、观赏花卉、蔬菜、农作物、草药和灌木。同时美国白峨体型小但食量大，且持续取食为害，因此又被称为“森林无烟的火灾”。

近年来，美国白蛾的防治方法主要是化学防治。化学防治主要应用于美国白蛾幼虫，且对4龄前的幼虫有较好的效果，对破网扩散的美国白蛾效果减弱。且长期使用化学杀虫剂，会带来严重的环境污染，甚至影响人类的身体健康。

美国白蛾的昆虫天敌以周氏啮小蜂(Chouioia cunea Yang)为主，侵染美国白蛾的真菌只有球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、粉棒束孢(Isaria farinose)已见报道。但未见利用爪哇棒束孢(Isaria javanica)防治美国白蛾的报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效爪哇棒束孢菌株，满足使用需求。本发明的另一目的是提供所述高效爪哇棒束孢菌株防治美国白蛾的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株防治美国白蛾的爪哇棒束孢，其分类命名为爪哇棒束孢Isaria javanica，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13192，保藏日期为2016年11月28日，保藏地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号。

所述的爪哇棒束孢BE01在防治美国白蛾中的应用。

所述的应用，采用爪哇棒束孢BE01的孢子液直接喷洒在美国白蛾幼虫上进行防治。

所述的孢子液制备方法为：从分离纯化得到的爪哇棒束孢BE01菌株中，挑取菌丝接种到铺有玻璃纸的SDAY平板上，在25℃培养20天，刮取玻璃纸上的菌丝及孢子放入0.1％的吐温－80水溶液中，充分搅拌震荡，过滤，得到孢子母液，将孢子浓度调整到1.0×10⁴个/mL～1.0×10⁸个/mL。优选孢子液浓度为1.0×10⁶个/mL～1.0×10⁸个/mL。

所述爪哇棒束孢BE01采用察氏培养基培养，25℃条件下培养13天。

本发明运用自然筛选法，通过采集天然感病的昆虫、分离纯化出菌株、真菌鉴定、致病性测定等步骤获得一株对美国白蛾高效的爪哇棒束孢Isaria javanica BE01。爪哇棒束孢BE01的形态学特征：如图1-图3所示，在察氏培养基平板上，菌落不规则形，菌丝白色，孢子层颜色紫灰色，背部淡黄色,延长培养可见孢梗束。显微镜下菌丝透明，无色，宽度0.3-1.2μm，透明光滑。分生孢子梗上着生2-4个瓶梗形成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细；分生孢子透明光滑，长椭圆形，两端较尖。之后进行分子鉴定，构建系统发育树，最后确定该菌株为爪哇棒束孢(Isaria javanica)BE01。

有益效果：与现有技术相比，本发明的爪哇棒束孢BE01菌株从美国白蛾幼虫僵虫上分离得到，通过试验证实，在1.0×10⁴个/mL以上的孢子浓度下，对不同虫龄的美国白蛾均具有较好的毒力，侵染率超过53.33％，在1.0×10⁸个/mL的孢子浓度下，侵染率超过73.33％，能高效防治美国白蛾。

附图说明

图1是BE01菌株在察氏培养基上生长13天的形态图；

图2是BE01菌株的产孢结构图；

图3是BE01菌株的分生孢子形态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细阐述本发明。下述实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述了所述菌株的发明思想，实施方式不一一在实例中追 述，但不因此限制本发明，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。

下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得：

供试昆虫：美国白蛾(Hyphandria cunea)幼虫僵虫：安徽省宿州市采集；美国白蛾(Hyphandria cunea)幼虫：江苏省淮安市采集。

SDAY培养基配方如下：1％酵母浸出粉，4％葡萄糖，1％胰蛋白胨，2％琼脂，加无菌水定量至1L，121℃灭菌20分钟。

察氏培养基：0.2％硝酸钠，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％氯化钾，0.05％七水合硫酸镁，0.001％七水合硫酸亚铁，3％蔗糖，2％琼脂，加无菌水定量至1L，121℃灭菌20分钟。

实施例1爪哇棒束孢BE01分离鉴定

爪哇棒束孢BE01，是从安徽宿州采集到的美国白蛾幼虫僵虫上分离得到的。方法如下：从僵虫虫体上挑取菌丝，接种到加有氨苄青霉素和硫酸链霉素的SD AY培养基上培养，25℃条件下培养5天。在形成的菌落中心挑取菌丝，接种到加了氨苄青霉素和硫酸链霉素的SDAY培养基上进行纯化培养，纯化培养重复3次。将筛选得到的一株真菌编号为BE01。

1)形态学鉴定：如图1-3所示，将纯化后的菌株接种到察氏培养基上，菌落不规则形，菌丝白色，孢子层颜色紫灰色，背部淡黄色，延长培养可见孢梗束。在蔡司显微镜观察下，菌丝透明，无色，宽度0.3-1.2μm，透明光滑。分生孢子梗上着生2-4个瓶梗形成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细；分生孢子透明光滑，长椭圆形，两端较尖。

2)分子生物学鉴定

爪哇棒束孢BE01总DNA的提取方采用CTAB法，得到提取的DNA样本；以提取的菌株总DNA作为基因扩增模版，采用真菌EF1-α引物983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’)和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’)，进行PCR扩增，PCR产物回收纯化、连接转化并进行DNA测序后，该序列如SEQ ID NO.1所示。与GenBank中所有已测定的真核生物的EF1-α序列比较同源性，构建BE01菌株系统发育树，结果表明BE01菌株与KT225600. 1(Isaria javanica)聚为一类，并且其形态特征符合爪哇棒束孢(Isaria javanica)的特征，所以可以鉴定BE01菌株为Isaria javanica，命名为爪哇棒束孢BE01。

实施例2爪哇棒束孢BE01防治美国白蛾

孢子悬浮液的配制：从分离纯化得到的爪哇棒束孢BE01菌株中，挑取菌丝接种到铺有玻璃纸的SDAY平板上，在25℃培养20天，刮取玻璃纸上的菌丝及孢子放入0.1％的吐温－80水溶液中，充分搅拌震荡，过滤，得到孢子母液。用血球计数板测量孢子浓度，将孢子浓度调整到1.0×10⁴个/mL、1.0×10⁵个/mL、1.0×10⁶个/mL、1.0×10⁷个/mL、1.0×10⁸个/mL。

采用喷洒法，将配制好的各浓度的孢子液喷洒到3-5龄幼虫身上，对照喷洒0.1％吐温-80溶液，每个虫龄的每个浓度接种10头，每个处理3个重复，接种后的幼虫置于25℃培养箱内光暗12:12，进行饲养，每天定时观察、记录各处理的具体死亡情况，并将死亡幼虫放在放有己灭菌湿滤纸的培养皿内在25℃用保湿棉球保湿培养，记录僵虫的头数，计算结果如表1。

侵染率公式：侵染率(％)＝僵虫数/供试虫数

表1爪哇棒束孢BE01对美国白蛾3、4、5龄幼虫的侵染能力

结果表明，爪哇棒束孢BE01对美国白蛾具有致病性，在1.0×10⁴个/mL的孢子浓度下，死亡率超过53.33％。该菌株对美国白蛾3、4龄幼虫有较好的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学 安徽省林业科学研究院

<120> 一株高效防治美国白蛾的爪哇棒束孢BE01及其应用

<130> 100

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 643

<212> DNA

<213> Isaria javanica

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gccccccaag cgtcccctcg acaagcccct ccgtcttcct cttcaggatg tctacaagat 120

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<212> DNA

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<223> 引物983F序列

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gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物2218R序列

<400> 3

atgacaccra crgcracrgt ytg 23