一种短短芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短短芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术：

根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。已知危害蔬菜的线虫主要有花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫以及甜菜根结线虫等。线虫寄主范围广泛，常危害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、胡萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害。根结线虫是一种重要的农作物病原物，每年造成大约数十亿元的损失。根结线虫主要侵染农作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根结，可相互连接形成串珠状，由于根部被破坏，影响正常的吸收机能，所以地上部生长发育受阻，被侵染后的植株地上部表现矮化，叶部黄化，结果小而且少。天气干燥时易萎蔫或枯萎。长期连作的温室中，特别是可以使西瓜、西瓜、番茄等绝产。

由于抗根结线虫病的种质资源稀少，所以在生产中化学防治仍然是防治根结线虫的重要措施，如棉隆、氯化苦和百亩威等，这些药剂虽然杀虫快，但是会严重降低蔬菜质量，污染环境，破坏生态平衡，使用过程中对人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人们的关注。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、不安全的问题，提供一种短短芽孢杆菌菌株及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种短短芽孢杆菌，所述菌株为短短芽孢杆菌Bb-1，建议的分类命名为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CGMCC 12365。

本发明还提供了利用短短芽孢杆菌制备的生防菌剂。

本发明还提供了短短芽孢杆菌制备的生防菌剂在防治根结线虫中的应用。

进一步的，所述根结线虫为南方根结线虫。

本发明还提供了生防菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将短短芽孢杆菌Bb-1划线接种在LB培养基上，恒温培养后得到单株菌落；

(2)将短短芽孢杆菌Bb-1的单株菌落接种在种子培养基中，恒温振荡培养后得到种子液；

(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，获得浓度为10⁶-10⁸cfu/mL的发酵液；然后将发酵液直接分装成液体剂型。

进一步的，步骤(1)中，在恒温培养箱中培养48-72h，培养温度为35-40℃。

进一步的，步骤(1)中，LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，余量为水。

进一步的，步骤(2)中，在恒温摇床振荡培养，转速160rpm，温度为35-40℃，振荡培养24-48h。

进一步的，步骤(3)中，将种子液以接种量1-2％接种到发酵培养基中，发酵温度为35-40℃。

进一步的，步骤(2)中的种子培养基与步骤(3)中的发酵培养基均为LB培养基。

本发明的有益效果为：本发明中的短短芽孢杆菌分离自土壤，对于根结线虫具有良好的防效，易于在土壤中定殖，且利于早期防控根结线虫危害，该菌株对于解决根结线虫的防治具有巨大的应用潜力，有助于实现蔬菜的高产、安全、无公害生产；短短芽孢杆菌Bb-1菌株的发酵液对根结线虫的致死率达到100％，在盆栽实验中的防治效果达到81.6％，防治效果高且稳定，适于农业生产需求。

附图说明

图1为本发明短短芽孢杆菌Bb-1的细菌形态图；

图2为本发明短短芽孢杆菌Bb-1的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。

实施例1

短短芽孢杆菌的分离、纯化及鉴定：

从顺义番茄种植田块中均匀取土壤样品，10g土壤分别与100mL灭菌水进行混合制成悬浮液，然后依次进行梯度稀释，取稀释10000倍的土壤混液100μL涂布于LB培养基平板上，LB培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉1.3-1.5g/100mL，定容至1L，封口。121℃、20min，高温高压灭菌后，在培养皿中铺制成平板。将培养基置于37℃培养，待组织块长出菌落后，挑取单菌落在LB培养基上纯化，用于分类鉴定。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。

用灭菌的牙签挑取单菌落，放入盛有300μL细菌裂解液SDS的EP管中，65℃裂解2小时，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取细菌DNA，以DNA为模板，用引物27F和1492R分别进行16srRNA序列扩增。PCR扩增反应体系为50μL，含有5μL 10×Ex Taq Buffer、1μL Ex Taq酶、5μL dNTP(2.5mM each)、1μL正向引物、1μL反向引物、3μLDNA模板、无菌水34μL。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。

结果：

参见附图1-2，获得Bb-1菌株在LB培养基平板上，37℃，培养3天后，菌落呈圆形，表面色暗，变厚和不透明。菌体杆状，很少成链，染色均匀。鞭毛侧生，孢子中生到次端生，柱状孢子使孢囊膨胀成纺锤状或棍棒状，孢子表现出强的着色力。萌发时芽孢壳赤道裂。自营养细胞露出后，孢子壳消解缓慢。依照《伯杰氏细菌鉴定手册》对Bb-1菌株形态进行测定，确定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。采用引物27F和1492R分别扩增16s rRNA序列，通过BLAST同源比对，与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的16SrRNA序列相似性达到100％，因此将Bb-1菌株确定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。

用引物1492R、27F和21FA、22RA分别进行16SrRNA和pheS序列扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳。经测序分析菌株扩增的16SrRNA序列长为1400bp。将菌株的16SrRNA序列进行BLAST分析后，结果显示，Bb-1菌株与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)相似度达到了100％。鉴定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。

实施例2

1、Bb-1菌株发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将短短芽孢杆菌Bb-1划线接种在LB培养基上，在恒温培养箱中平板培养60h，培养温度设定为37℃，得到单株菌落；

(2)将短短芽孢杆菌Bb-1的单株菌落接种在种子培养基(LB培养基)中，在恒温摇床振荡培养，转速160rpm，温度为37℃，振荡培养36h；液体种子培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，定容至1L；

(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为1％，温度设定为37℃，获得浓度为10⁶cfu/mL的发酵液(原液)；液体发酵培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L。

将发酵液及其10倍、100倍稀释液分别处理根结线虫(Meloidogyne spp.)，测定短短芽孢杆菌发酵产物对根结线虫的杀死效果。

2、制备试验用线虫

采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。将辣椒根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下卵块，放在1％的次氯酸钠中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，每24h收集一次孵化的根结线虫J2幼虫。

3、试验方法

在无菌的细胞培养板上，分别向孔内加入不同浓度的发酵液各1mL，并以无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中加入100μL线虫悬浮液(100条根结线虫J2幼虫)，放在室温下24h，观察根结线虫的死亡情况，计算校正死亡率，即为杀线虫效果，每个处理24个孔(样本)，每个试验重复3次。

校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率－对照线虫死亡率)/(1－对照线虫死亡率)×100％

4、试验结果：

通过上述试验，测定不同倍数发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果，结果表明不同发酵液倍数对线虫的作用效果不同，发酵液原液的作用根结线虫的校正死亡率为100％，发酵液稀释后防治效果明显降低在10倍稀释液中杀线虫过只有77.8％，而在100倍稀释液中线虫死亡率很低(<10％)，与对照的差异很小。试验说明发酵液在高浓度下具有良好的防治根结线虫效果。

表1不同浓度的Bb-1菌株发酵液杀线虫效果

实施例3

1、Bb-1菌株发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将短短芽孢杆菌Bb-1划线接种在LB培养基上，在恒温培养箱中平板培养60h，培养温度为37℃，得到单株菌落；

(2)将短短芽孢杆菌Bb-1的单株菌落接种在种子培养基中，在恒温摇床振荡培养，转速160rpm，温度为37℃，振荡培养36h；液体种子培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；

(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为1％，温度设定为37℃，获得浓度为10⁶cfu/mL的发酵液；液体发酵培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L。

在西瓜幼苗上接种10ml该菌培养液，2天后，接种南方根结线虫J2幼虫，每株接种500条，并在5周后检测根结数量，计算防治效果。每个处理30株西瓜苗，每个处理重复3次。并以清水处理作为对照。

根结线虫病情分级标准为：

表2西瓜根结线虫病病情级别划分

根结指数计算：

调查每份鉴定材料根部发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行调查，记载病情级别，计算出根结指数(RKI)。

根结指数按下列公式计算：

根结指数(％)＝∑(s×n)/N×M×100

式中：

∑—各病情级别代表数值与其相对应病情级别病株数乘积的总和；

S—各病情级别代表数值；

n—各病情级别病株数；

N—调查总株数；

M—最高病情指数。

防治效果计算公式：

防治效果(％)＝(1－处理根结数/对照根结数)×100

2、试验结果

处理结果见表2，通过试验可以看出在生防菌处理后西瓜植株上的根结数量显著降低，在对照处理中根结数量平均为44.42个/株，而在Bb-1菌株处理的西瓜中的根结数量平均为8.17个/株，Bb-1菌株对根结线虫的防治效果达到了81.6％，说明生防菌剂可以有效的防治西瓜根结线虫。在农业生产，特别是设施西瓜栽培中防治根结线虫病具有重要价值。

表2不同处理根结数量及防治效果

实施例4

一种Bb-1菌株生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将短短芽孢杆菌Bb-1划线接种在LB培养基上，在恒温培养箱中平板培养48h，培养温度设定为35℃，得到单株菌落；

(2)将短短芽孢杆菌Bb-1的单株菌落接种在种子培养基(LB培养基)中，在恒温摇床振荡培养，转速160rpm，温度为35℃，振荡培养24h；液体种子培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，定容至1L；

(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为1％，温度设定为35℃，获得浓度为10⁶cfu/mL的发酵液(原液)，液体发酵培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L；然后将得到的发酵液直接分装成液体剂型。

实施例5

一种Bb-1菌株生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将短短芽孢杆菌Bb-1划线接种在LB培养基上，在恒温培养箱中平板培养72h，培养温度为40℃，得到单株菌落；

(2)将短短芽孢杆菌Bb-1的单株菌落接种在种子培养基中，在恒温摇床振荡培养，转速160rpm，温度为40℃，振荡培养48h；液体种子培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L；

(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为2％，温度设定为40℃，获得浓度为10⁸cfu/mL的发酵液；液体发酵培养基配方为LB培养基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；然后将得到的发酵液直接分装成液体剂型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。