一种自体软骨细胞的原代分离方法与流程

本发明涉及细胞领域，具体涉及一种软骨细胞的分离方法，尤其是一种自体软骨细胞的原代分离方法。
背景技术：
：软骨由软骨组织及其周围的软骨膜构成，软骨组织是由胶原组织、少许细胞、以及60-80％的水份等成份所构成。根据软骨组织内所含纤维成分的不同，可将软骨分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨三种，其中以透明软骨的分布较广，结构也较典型。每根骨的末端，都有一层软骨组织包裹着。这些软骨组织可使骨骼之间避免摩擦及冲击。成人的软骨组织中并没有血管或神经，因此软骨组织受伤后自行修补的能力有限。软骨组织工程学是工程学与生物医学尤其是细胞生物学相结合的边缘科学，它涉及细胞、支架材料和包括多种生长因子在内的发育环境3种基本要素。1988年Vacanti等将聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)作为支架，复合软骨细胞后植入裸鼠皮下进行体内培养，28天后发现有软骨样组织出现。1997年Cao等以一个3岁儿童耳廓作模型，用涂有PLA的PGA无纺网制成人耳形状的支架，接种软骨细胞，体外培养1周后植入裸鼠皮下，12周后取出的标本呈人耳状软骨，组织形态学检查证实为软骨组织。这一实验的成功，标志着预制人工软骨的组织工程技术正在走向成熟。尽管目前软骨组织工程的研究仍处在体外和动物体内实验阶段，距离有效的临床应用尚有艰巨的道路要走，但其发展速度和临床应用前景已受到广泛关注。软骨组织工程是将软骨种子细胞种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。在软骨组织工程研究中对软骨种子细胞的数量要求巨大、生物学功能活性要求高，软骨种子细胞的来源仍是未很好解决的问题。虽然体外传代培养可以扩增细胞数量，但软骨细胞增殖能力有限，扩增达一定量后细胞出现复制衰老和产生去分化及生物学功能衰退。因此，以有限的供体活组织收获尽可能多而功能活性高的原代软骨细胞，以降低体外扩增倍数，无论是在软骨组织工程的研究中还是在临床应用中，都显得非常重要。而目前常用的原代软骨细胞分离方法收获效率低，造成了供体活组织的浪费。且软骨细胞得率低，活力较差，继续扩增培养就仍然很难满足自体软骨细胞或组织移植的要求。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种自体软骨细胞的原代分离方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种自体软骨细胞的原代分离方法，自体软骨组织预处理后，剪碎，先用胰蛋白酶-EDTA处理，然后用Ⅱ型胶原酶溶液消化，待大部分细胞游离时，细胞筛网过滤，离心弃上清，收集细胞用DMEM高糖完全培养基重悬后培养3天，收集贴壁细胞即得原代软骨细胞。其中，所述预处理为用含有双抗的PBS溶液进行清洗，以清除自体软骨组织表面的血污及附着的其他组织。所述预处理优选在无菌条件下进行。按照本发明，所述含有双抗的PBS溶液中所述双抗为青霉素和链霉素的混合物。其中所述青霉素终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml。预处理后的自体软骨组织需要先剪碎。优选剪碎为剪成1mm3的大小。本发明所述自体软骨细胞的原代分离方法，先用胰蛋白酶-EDTA溶液处理。本领域技术人员可以理解，所述胰蛋白酶-EDTA溶液为含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液。优选的，按g/ml计，所述胰蛋白酶的终浓度为0.25％，所述EDTA的终浓度为0.02％。本发明所述自体软骨细胞的原代分离方法中所述胰蛋白酶-EDTA溶液处理时间优选为5～10min。在胰蛋白酶-EDTA溶液处理后还包括用PBS溶液清洗软骨组织的步骤。优选PBS溶液清洗软骨组织3-5次。进一步，本发明所述原代分离方法在胰蛋白酶-EDTA溶液处理后采用Ⅱ型胶原酶溶液消化。优选的，所述Ⅱ型胶原酶的终浓度为0.1v/v％～0.2v/v％。本领域技术人员可以理解，所述Ⅱ型胶原酶消化优选为4℃消化过夜。在一些实施例中，消化时间为12小时左右。优选的，所述细胞筛网为200目不锈钢细胞筛网。优选的，所述离心为1500rpm离心2次，每次5min。本发明所述自体软骨细胞的原代分离方法在离心后收集细胞用DMEM高糖完全培养基培养。其中，重悬后细胞密度为2×105个/ml。优选的，所述DMEM高糖完全培养基为含10v/v％的胎牛血清、1v/v％的双抗和10ng/ml的bFGF溶液的DMEM高糖基础培养基。本发明采用甲苯胺蓝进行染色，鉴定分离的原代软骨细胞。结果显示分离的细胞呈蓝紫色，细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒。表明分离的细胞为软骨细胞。由上述技术方案可知，本发明提供了一种自体软骨细胞的原代分离方法。本发明所述原代分离方法为自体软骨组织预处理后，剪碎，先用胰蛋白酶-EDTA溶液处理，然后用Ⅱ型胶原酶溶液消化，待大部分细胞游离时，细胞筛网过滤，离心弃上清，收集细胞用DMEM高糖完全培养基重悬后培养3天，收集贴壁细胞即得原代软骨细胞。本发明所述原代分离方法可以提高软骨细胞的得率，同时保证软骨细胞活力较好，分离获得的原代软骨细胞扩增培养后可以满足临床上自体软骨细胞或组织移植的要求。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示接种48h后的细胞形态；图2示达到80％融合后细胞的甲苯胺蓝染色结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1取3g膝关节软骨组织，用含有双抗的PBS溶液进行清洗后，剪碎成1mm3的大小后用0.25％的胰蛋白酶溶液-0.02％的EDTA溶液重悬软骨组织5分钟，吸出胰蛋白酶溶液后采用0.1％～0.2％的Ⅱ型胶原酶在4℃条件下消化过夜(12小时左右)，待大部分细胞游离时，经200目不锈钢细胞筛网过滤；1500rpm离心2次，弃上清，收集软骨细胞，用DMEM高糖完全培养基重悬细胞，并用台盼蓝溶液进行计数，以2×105/ml的密度接种于新的T25培养瓶中。3天后换液，弃去未贴壁细胞，所得细胞为原代细胞。对比例1取3g膝关节软骨组织，用含有双抗的PBS溶液进行清洗后，剪碎成1mm3的大小后采用0.1％的Ⅰ型胶原酶消化4～6小时，待大部分细胞游离时，经200目不锈钢细胞筛网过滤；1500rpm离心2次，弃上清，收集软骨细胞，用DMEM高糖完全培养基重悬细胞，并用台盼蓝溶液进行计数，细胞的总量为以2×105/ml的密度接种于新的T25培养瓶中。3天后换液，弃去未贴壁细胞，所得细胞为原代细胞。实施例2分别统计实施例1和对比例1的方法分离后的软骨细胞得率和活力，结果见表1。表1两种方法进行分离后软骨细胞的得率和活力对比例1实施例1细胞得率(个)2.2×1066.46×106细胞活力89％96％结果显示，实施例1所述方法分离后的软骨细胞得率和活力均高于对比例1。实施例3分别培养实施例1和对比例1的方法分离后的细胞，待细胞达80％～90％融合时，弃去原培养基，用0.25％的胰蛋白酶消化1～2分钟1000rpm离心5分钟后加入新的培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中继续培养并观察细胞形态及生长情况，结果见图1。用甲苯胺蓝进行染色，鉴定软骨细胞结果见图2。图1结果显示实施例1和对比例1分离的细胞在培养瓶中培养48小时后的大部分细胞形态均为三角形、多角形或铺路石状，实施例1分离的细胞比对比例1分离的细胞得率高。图2结果显示实施例1和对比例1分离的细胞均呈蓝紫色，细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒，但实施例1分离的细胞比对比例1分离的细胞得率高。当前第1页1 2 3