专利名称：用于体外和体内软骨发生的方法和组合物的制作方法
用于体外和体内软骨发生的方法和组合物交叉引用本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求下列临时专利申请的优先权2009年7月
16日提交的标题为 “Methods and Compositions Useful for In Vitro and In VivoChondrogenesis Using Embryonic Progenitor Cell Lines，，的第 61/226，237 号申请；2009年9月 18 日提交的标题为“Improved Methods of Screening Embryonic ProgenitorCell Lines”的第 61/243，939 号申请；2010 年 5 月 27 日提交的标题为“Improved Methodsof Screening Embryonic Progenitor Cell Lines” 的第 61/349,088 申请；和 2010年 7 月 16 日提交的标题为 “Methods and Compositions for In Vitro and In VivoChondrogenesis”的第61/365，308号申请。这些申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
软骨的有限再生能力限制了身体的修复因创伤或退行性疾病引起的损伤的天然能力。例如，骨关节炎(OA)折磨高达70%的65岁以上的个体(2100万美国人)。对半月板或前交叉韧带的损伤通常让患者处于增加患关节炎的风险中。骨关节炎的特征在于关节表面上软骨的逐渐丢失，从而导致疼痛的软骨下骨暴露。在对关节软骨的该损伤后，人组织几乎不显示修复能力。作为固有修复反应的结果出现的新生软骨本质上通常是纤维状的，从而不适合用于修复。已开发了多种治疗方案用于治疗患有软骨损伤的受试者。此类治疗的实例包括意欲使用机械手段(例如，摩擦和微小骨折手术例如钻孔、微小骨折手术、软骨成形术和海绵化(spongialization);激光辅助治疗,其将患病软骨的去除与软骨矫形结合)触发受试者的软骨产生的治疗和依赖于组织至损伤部位的移植(或嫁接(grafting))(例如，骨膜移植、骨软骨移植(软骨镶嵌术)和关节软骨糊移植(articular cartilage pastegrafting))的治疗。此类治疗的成功率可变化并且某些治疗具有潜在的有害副作用，包括组织坏死、反应性滑膜炎(reactive synovitis)、软骨溶解和关节软骨退变的加速。称为自体软骨细胞治疗(ACT)的基于细胞的软骨治疗方案包括从软骨取出软骨细胞、体外扩增细胞和利用或不利用支持基质(或其它蛋白质或蛋白聚糖)将这些扩增的细胞施用至患者内。ACT治疗因人关节软骨细胞的去分化(当在体外培养时)以及再分化细胞(以便它们在移植位置产生丰富的软骨基质)的相对困难而变得复杂。此外，只有少量软骨可从人收集，从而只有少量软骨细胞可被用于起始培养。因此，实践中在将分离的人软骨细胞应用于移植治疗中一直存在困难。另一个治疗策略是利用源自骨髓的间充质干细胞(hbmMSC)。利用单次剂量的hbmMSC(软骨素原(Chondrogen))的临床研究显示与透明质酸(HA)对照相比的疼痛的减轻。然而，间充质干细胞(MSC)在它们用于再生软骨的方面具有两个障碍。第一，因成体MSC的有限的增殖能力的原因导致细胞作为同种异体移植物的用途是有问题的，即使细胞能够进行一定量的扩增，它们通常也相对快速地失去它们形成软骨的能力。第二个障碍是MSC例如源自骨髓的MSC形成肥大软骨细胞，其特征在于高水平的C0L10A1和IHH表达。这些软骨细胞在发育中的作用是补充血管和成骨细胞，然后死亡。在例如长骨的生长面区域观察到肥大软骨细胞。也在骨折位置观察到它们，在所述位置中它们类似地在骨形成中起着重要作用。因此，在软骨的创伤和退变疾病例如骨关节炎的治疗中使用MSC已产生混合结果。此外，在体内存在许多软骨类型。耳的弹性软骨具有与鼻、胸骨、气管和承重关节的分子组成不同的分子组成。因此，再生医学领域，特别是在软骨再生和修复领域内，急需要产生商业量的多种类型的永久性软骨细胞(与肥大软骨细胞相反)的新型细胞制剂。概要本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用相关的方法和组合物。公开了许多示例性源自原始干细胞的软骨形成细胞系。本文中描述的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度(site-specificpurity)，从而提供了产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的多种软骨类型的组合物
和方法。
图I :在软骨形成微团条件下的14天之前和之后通过qPCR测定的细胞系中C0L2A1的诱导的水平。图2 :显示处于未分化和分化条件下的MSC对照连同本发明的细胞系中的软骨相关基因 C0L2A1、CRTAC1、CD74、(2A) LECT1、IHH 和 LHX8 (2B)的相对表达。图3 :显示脂肪组织干细胞与第14代的细胞系4D20. 8相比较，与第6代的MSC相比较的番红O染色(全部细胞系都处于以沉淀形式进行的分化的第21天)和第14天的细胞系4D20. 8和MSC的沉淀的免疫染色(以同种型为对照)的实例。图4 :显示4D20. 8RGD-藻酸盐(图4A)、E15RGD-藻酸盐和SM30RGD-藻酸盐(图4B)的体内植入的结果。图5 :显示示例性组织学图像，该图像显示4D20.8和E15的与透明软骨中的软骨细胞的外观相似的软骨细胞样外观。缩写AFP -甲胎蛋白BMP -骨形态发生蛋白BRL -水牛大鼠肝BSA -牛血清白蛋白CD -集群名称(Cluster Designation)cGMP -现行良好操作规范(Current Good Manufacturing Processes)CNS -中枢神经系统DMEM -达尔伯克改良伊格尔培养基DMSO -二甲基亚砜DPBS -达尔伯克憐酸盐缓冲盐水(Dulbecco，s Phosphate Buffered Saline)EC -胚胎性癌EC细胞-胚胎性癌细胞；hEC细胞是人胚胎性癌细胞
ECM -细胞外基质ED细胞-源自胚胎的细胞(Embryo-derived cell) ;hED细胞是人ED细胞EDTA -乙二胺四乙酸EG细胞-胚胎生殖细胞；hEG细胞是人EG细胞EP细胞-胚胎祖细胞是来源于原始干细胞的细胞，其比原始干细胞更加分化，因为它们在人物种的情况下不再展现标志例如SSEA4、TRAl-60或TRA-1-81血清阳性，但仍未完全分化。胚胎祖细胞对应于胚胎期，与发育的出生后期相反。ES细胞-胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞FACS -荧光激活细胞分选术FBS -胎牛血清GMP -药品生产和质量管理hED细胞-人胚胎来源的细胞hEG细胞-人胚胎生殖细胞是源自胎儿组织的原始生殖细胞的干细胞。hEP细胞-人胚胎祖细胞是来自人物种的胚胎祖细胞hiPS细胞-人诱导多能干细胞是具有与在暴露于hES-特异性转录因子例如S0X2、KLF4、0CT4、MYC或NANOG、LIN28、0CT4和S0X2后获自体细胞的hES细胞相似的性质的细胞。HSE -人皮肤等同物是细胞与被制造用于测试目的或用于促进创伤修复治疗性应用的生物或合成基质的混合物。ICM -哺乳动物胚泡期胚胎的内细胞团。iPS细胞-诱导多能干细胞是具有与在暴露于ES-特异性转录因子例如S0X2、KLF4、0CT4、MYC或NANOG、LIN28、0CT4和S0X2后获自体细胞的hES细胞相似的性质的细胞。LOH -杂合性丢失MEM -最低必需培养基NT -核移植PBS -磷酸盐缓冲盐水PS成纤维细胞-瘢痕形成前(Pre-scarring)成纤维细胞是源自早期妊娠皮肤的皮肤或源自展示出生前基因表达模式的ED细胞的成纤维细胞，因为它们促进真皮创伤的快速愈合而无瘢痕形成。RA -视黄酸RFU -相对荧光单位SCNT -体细胞核移植SFM -无血清培养基SPF -无特异病原体SV40 -猿猴病毒 40Tag -大 T-抗原T-EDTA -胰蛋白酶 EDTA定义
术语“分析重编程技术(analyticalreprogramming technology) ” 是指将体细胞的基因表达模式重编程成更具多能性状态的细胞的基因表达模式，例如iPS、ES、ED、EC或EG细胞的基因表达模式的多种方法，其中重编程在多个分开的步骤中发生，并且不简单地依赖于体细胞至卵母细胞的转移和该卵母细胞的活化(参见2001年11月26日提交的第60/332，510号美国申请；2002年11月26日提交的第10/304，020号美国申请；2003年11月26日提交的第PCT/US02/37899号PCT申请；2005年8月3日提交的第60/705625号美国申请；2005年8月20日提交的第60/729173号美国申请；2006年7月5日提交的第60/818813号美国申请；2006年8月3日提交的第PCT/US06/30632号美国申请，将所述每一个申请的公开内容通过引用并入本文)。术语“卵裂球/桑椹胚细胞”是指哺乳动物胚胎中的卵裂球或桑椹胚细胞或在另外的细胞(包括这些细胞的已分化的衍生物)存在或不存在的情况下体外培养的卵裂球或椹胚细胞。术语“表达基因X的细胞”、“在细胞中表达基因X”(或细胞群)或其等同物意指使用专门的测定平台对细胞的分析提供了阳性结果。反之亦然(即，不表达基因X的细胞或等同物意指使用专门测定平台对细胞的分析提供了阴性结果)。因此，本文中描述的任何基因表达结果与测定平台中所用的对所指示基因特异的探针密切相关。术语“细胞系”是指能够体外繁殖和扩增的一群非永生细胞或永生细胞。术语“细胞重建”是指将一个细胞核的染色质转移至细胞的细胞质以获得功能细胞。术语“克隆的”是指获自单一细胞至一群细胞(所有细胞全都来自该原始单一细胞并且不包含其它细胞)的扩增的一群细胞。术语“集落原位分化(colonyin situ differentiation) ”是指细胞(例如，hES、hEG、hiPS、hEC或hED)的集落原位分化而无需将集落从其培养容器取出或结集，在所述培养容器中集落被繁殖为未分化的干细胞系。集落原位分化不利用形成类胚体(embryoidbody)的中间步骤，虽然类胚体形成或其它聚集技术例如旋动培养的使用仍然可进行一段时间的集落原位分化。术语“胞质泡(cytoplasmic bleb) ”是指受完整无损的或经渗透化处理但仍完整的质膜限制但缺少细胞核的细胞的细胞质。术语“分化细胞”，当用于指通过本发明的方法从多能干细胞产生的细胞时，是指当与亲代多能干细胞相比较具有减少的分化的潜能的细胞。本发明的分化细胞包括可进一步分化(即，它们可以是不是最终分化的)的细胞。术语“直接分化”是指这样的分化过程使卵裂球细胞、桑椹胚细胞、ICM细胞、ED细胞或体细胞直接重编程至未分化的状态(例如在使产生iPS细胞的过程中但在此类细胞以未分化状态被纯化出来之前)而无需将分离的未分化干细胞例如hES细胞繁殖为未分化细胞系的中间状态。直接分化的非限定性实例可以是将完整人胚泡培养成培养物以及衍生ED细胞而无需产生人ES细胞系，如所描述的(Bongso等人，1994. Human Reproduction 9 2110)。术语“胚胎干细胞”(ES细胞)是指源自胚泡、卵裂球或桑椹胚的内细胞团的细胞，其已被连续传代为细胞系同时维持未分化状态(例如，表达特异于该物种的ES细胞的TERT、0CT4以及SSEA和TRA抗原)。ES细胞可通过卵细胞与精子或DNA的受精、核转移、孤雌生殖，或通过在MHC区域中产生具有半合子性或纯合性的hES细胞来产生。虽然ES细胞在历史上已被定义为能够分化成所有体细胞类型以及生殖系(当被移植入植入前胚胎时)的细胞，但来自许多物种(包括人)的候选ES培养物在培养中具有更平整的外观，并且通常不引起生殖系分化，从而被称为“ES-样细胞”。通常认为人ES细胞实际上是“ES-样”的，然而，在本申请中，我们将使用术语ES细胞来指ES和ES-样细胞系。术语“组织型培养”是指被聚集在一起产生具有组织样细胞密度的三维结构(例如在某些细胞于一层琼脂上的培养中发生的或例如当将细胞以三维形式在胶原凝胶、海绵或其它聚合物例如通常用于组织工程的聚合物中培养时发生的)的培养细胞。术语“源自人胚胎的”(“hED”)细胞是指源自卵裂球的细胞、源自桑椹胚的干细胞(morula-derived cell)、源自胚泡的细胞(blastocyst-derived cell)(包括内细胞团、
胚盾或上胚层的细胞)或早期胚胎的其它全能或多能干细胞(包括原始内胚层、外胚层、中胚层和神经嵴以及它们的达到与正常人发育的前8周等同物相关的分化的状态的衍生物)，但不包括来源于hES细胞的已被传代为细胞系的细胞(参见，例如，属于Thomson的第7，582，479 号；第 7，217，569 号；第 6，887，706 号；第 6，602，711 号；第 6，280，718 号和第5，843，780号美国专利)。hED细胞可源自附植前胚胎(preimplantation embryo),所述胚胎可通过卵细胞与精子或DNA的受精、核转移或染色质转移、通过孤雌生殖、分析重编程技术诱导卵细胞形成单性生殖生物，或通过在HLA区域产生具有半合子性或纯合性的hES细胞的方法来产生。术语“人胚胎生殖细胞”(hEG细胞)是指源自胎儿组织的原始生殖细胞或将要成熟或成熟的生殖细胞例如卵母细胞和精原细胞的多能干细胞，其可在体内分化成不同组织。hEG细胞也可源自通过产雌(gynogenetic)或产雄(androgenetic)方法(即其中多能细胞源自只包含雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞从而将包含所有源自雌性的或源自雄性的DNA的方法)产生的多能干细胞(1999年10月28日提交的第60/161，987号美国申请；2000年10月27日提交的09/697，297 ；2001年11月29日提交的09/995，659 ；2003 年 2 月 27 日提交的 10/374，512 ；2000 年 10 月 27 日提交的第 PCT/US/00/29551 号 PCT申请；将所述申请的公开内容通过引用整体并入本文)。术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)是指人ES细胞。术语“人iPS细胞”是指具有与hES细胞相似的性质的细胞，所述性质包括当在暴露于去分化因子例如hES细胞特异性转录因子组合KLF4、S0X2、MYC和0CT4或S0X2、0CT4、NANOG和LIN28之后移植入免疫受损小鼠(其中所述iPS细胞来源于不同体细胞谱系的细胞)时，形成所有3个胚层的能力。去分化因子的任何方便组合可用于产生iPS细胞。所述iPS细胞可通过这些基因的表达(通过载体例如本领域内已知的逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体，或通过例如利用透化或其它技术引入因子如蛋白质)产生。关于此类示例性方法的描述参见2006年8月3日提交的第PCT/US2006/030632号PCT申请；第11/989，988号美国申请；2000年6月30日提交的第PCT/US2000/018063号PCT申请；2000年12月15日提交的第09，736，268号美国申请；2004年4月23日提交的第10/831，599号美国申请；和第20020142397号美国专利公布(第10/015，824号申请，标题为“Methods for AlteringCell Fate”);第20050014258号美国专利公布(第10/910，156号申请，标题为“Methodsfor Altering Cell Fate”);第 20030046722 号美国专利公布(第 10/032，191 号申请，标题为“Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donorcells”);和第20060212952号美国专利公布(第11/439，788号申请，标题为“Methods forcloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells”)，将所有所述专利申请通过引用整体并入本文。术语“ ICM细胞”是指哺乳动物胚胎的内细胞团的细胞或在存在或不存在周围滋养外胚层细胞的情况下体外培养的内细胞团的细胞。术语“寡克隆(oligoclonal)”是指源自一小群细胞(通常2-1000个细胞)的一群细胞，所述细胞表现出共有相似特征例如形态或分化标志的存在或不存在，所述特征与相同培养物中其它细胞的特征不同。将寡克隆细胞与不共有这些共同特征的细胞分离，并且使其增殖，产生一群基本上完全源自相似细胞的原始群体的细胞。术语“器官型培养”是指经聚集以产生具有组织样细胞密度的三维结构的培养的细胞，所述三维结构例如在某些细胞在一层琼脂上的培养中发生，在动物中被培养为畸胎
瘤的培养细胞，或者生长在三维结构系统中的培养细胞，但其中所述聚集的细胞包含不同细胞谱系的细胞，例如，以非限定性实例为例，表皮角蛋白细胞与真皮成纤维细胞的组合，或主质细胞与它们对应的组织间质(tissue stroma)或者上皮细胞与间充质细胞的组合。术语“多能性干细胞”与下文中定义的术语“原始干细胞(primordial stemcell)”同义地使用。术语“混合克隆(pooled clonal)”是指通过将两个或更多个克隆群体组合以产生一群具有统一标志例如基因表达的标志的细胞来获得的一群细胞，该细胞群体与克隆群体相似，但并非其中所有细胞都来源于相同原始克隆的群体。所述混合克隆系可包括单一基因型或混合基因型的细胞。混合克隆系在其中克隆系相对早地分化或在它们的增殖寿命(proliferative lifespan)的早期以不期望的方式改变的情况下是特别有用的。术语“原始干细胞”是指能够分化成超过一种已分化的细胞类型的动物细胞。此类细胞包括hES细胞、卵裂球/桑椹胚细胞和它们的衍生hED细胞、hiPS细胞、hEG细胞、hEC细胞和成体衍生细胞(adult-derived cell)(包括间充质干细胞、神经元干细胞和源自骨髓的干细胞)。原始干细胞可来自非人动物。原始干细胞可进行遗传修饰或不进行遗传修饰。遗传修饰的细胞可包含标志例如荧光蛋白以有助于它们的体外或体内识别。详述如上文中概述的，本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞的产生、识别和使用相关的方法和组合物。在更详细地描述本发明的之前，应理解，本发明不限定于所描述的特定实施方案，这样其当然可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，并且不旨在是限定性的，因为本发明的范围只受所附权利要求的限制。当提供数值范围时，要理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。本文中提供了某些在数值之前加有术语“约”的范围。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字以及与所述术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否与明确引用的数字接近或近似时，接近或近似的未引用的数字可以是在其出现的上下文中提供明确引用的数字的基本等同物的数字。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述代表性举例说明的方法和材料。本说明书中引用的所有公布和专利通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表明各个公布或专利通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与公布一起被引用的方法和/或材料。任何公布的引用是针对其提交日期之前的公开内容，并且不应当解释为本发明无权因先前发明而先于这些公布。此外，提供的公布的日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立确认。应指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文明确地另有说明，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。还应指出，权利要求可以被撰写成排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative) ”限定的在先基础。在阅读本公开内容后对于本领域技术人员明显的是，本文中描述的和举例说明的单个实施方案的每一个具有分立的组分和特征，在不背离本发明的范围或精神的情况下可这些组分和特征可以容易地与其它若干实施方案的任一个的特征分开或组合。可以以所引用事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序实施任何引用的方法。胚胎软骨形成祖细胞和使用方法本发明的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞的产生、识别和使用相关的方法和组合物。已描述了与四肢和关节的细胞系例如表达MSX1、MSX2和S0X9的细胞系(具有表达闻水平的关节特异性标志GDF5的细胞系的亚组)相关的多组表达间充质的中心调节因子的克隆细胞系(参见West等人,2008, Regenerative Medicine第3卷(3)pp. 287-308，其通过引用并入本文，包括补充信息；和2009年7月16日提交的并且标题为“Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from PluripotentStem Cells and Cells Obtained Thereby”的第 12/504，630号美国专利申请,其通过引用整体并入本文)。这些克隆纯化的品系是强健的，能够扩增超过40代，同时保持它们的基因表达模式，未曾显示致肿瘤性，并且具有基因表达的胚胎模式。这些细胞系从而提供了用于产生多种用于研究和治疗的具有独特分子组成的软骨类型的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明的未分化胚胎软骨祖细胞或细胞系的基因表达模式未提供它们在适当的培养条件下具有成为软骨细胞的潜能的迹象。换句话说，细胞不具有显示软骨细胞发育潜能的基因表达模式。本发明的某些软骨形成胚胎祖细胞系，当在软骨形成条件下诱导时，能够产生软骨而不表达C0L10A1或IHH基因，这两种基因在这样的条件下于MSC中表达并且为肥大软骨细胞的标志。肥大软骨细胞提供了以后被成骨细胞侵入以产生骨的临时基质，从而不适合用于某些治疗目的(例如，当注射入关节中或移植入关节软骨中以试图再生该组织以治疗关节软骨创伤、关节炎或相关用途时)。因此，本发明的细胞系具有与其它发育成肥大软骨细胞的软骨细胞祖细胞(例如，源自骨髓的MSC)不同的重要治疗差异。
根据本发明的示例性胚胎软骨细胞祖细胞对于下列基因中的任合I个、2个、3个、4个或全部的表达是阴性的瓜74、^90、^166、几6八2和1^爾2。这些基因中的每一个都是存在于间充质干细胞(MSC)中的标志，所述MSC目前用于软骨替代疗法(在下文中进一步描述)。因此，本发明的软骨形成胚胎祖细胞系具有与其它已知软骨形成祖细胞不同的基因表达模式。在某些实施方案中，软骨形成胚胎祖细胞还对HOX基因和PITXl的表达呈阴性。下面是一组根据本发明的方面的示例性人胚胎软骨细胞祖细胞系和某些所关注的基因表达标志(阳性和阴性标志)。此类人胚胎软骨细胞祖细胞系，当它们在从人ES或源自相似的人原始干细胞的细胞分离后已经历18-21次倍增的克隆扩增时，能够分化成成软骨细胞，接着分化成与正常早期传代培养的人关节软骨细胞(NHAC)相比较表达更高水平的C0L2A1的软骨细胞。P22-28范围内的细胞系MEL2的基因表达标志可通过比较如表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因PIP、ENPP2、DLX5、CXADR、NPTX2、CLDN23、SFRP2、HSPB3、HAND2、HSD17B2、RCAN2、EBF3、GPM6B、RNF175、PPARGC1A、RGS16、GPM6B、S0X17、EPHB6 和 BAPX1。在 P22-28 的范围内的细胞系MEL2中表达的这些标志中最特异的是PIP (Illumina探针ID 4010519)、S0X17 (Illumina 探针 ID 3610193)、DLX5 (Illumina 探针 ID 3370767)、GPM6B (Illumina 探针 ID 2630279)、RGS16 (Illumina 探针 ID 1030102)、EPHB6 (Illumina 探针 ID 7400017)和 HAND2 (Illumina 探针 ID 4640563)并且对于TBX15 (Illumina 探针 ID 6060113)、H0XA2 (Illumina 探针 ID 2060471)、AJAPl (Illumina ID 1300647)和 H0XB2 (Illumina 探针ID 3460097)的表达呈阴性。P13-15的范围内的细胞系SM30的基因表达标志可通过比较如表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因:C0L15A1、DYSF、FST、ITGB4、TMEMl 19, MSXU NDST3、NTRKl和ZIC2。在P13-15的范围内的细胞系SM30中表达的这些基因表达标志中最特异的是NTRKldllumina 探针 ID 7050113)、NDST3 (Illumina 探针 ID 670537)、ZIC2 (Illumina探针 ID 510368)、ITGB4 (Illumina 探针 ID 3940132)，并且对于 PIP (Illumina 探针ID 4010519)、NNAT(Illumina 探针 ID 4010709)、H0XA2 (Illumina 探针 ID 2060471)、TBX15 (Illumina 探针 ID 6060113)和 HAND2 (Illumina 探针 ID 4640563)的表达呈阴性。P11-18的范围内的细胞系7SM0032的基因表达标志可通过比较如表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态的细胞的基因表达模式来测定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因EGFL6、FGF13、BEX2、CHRNA3、NCAM2、BBOXl和DLKl。在7SM0032中表达的这些基因表达标志中最特异的是EGFL6 (Illumina探针ID6330079)、FGF13 (Illumina 探针 ID 7380239)、CHRNA3 (Illumina 探针 ID 4280180)、BBOXl (Illumina探针 ID 3400386)，并且对于基因:TBX15 (Illumina 探针 ID 6060113)、NNAT (Illumina 探针 ID 4010709)、NTRK1 (Illumina 探针 ID 7050113)、HAND2 (Illumina 探针 ID 4640563)和H0XA2 (Illumina 探针 ID 2060471)的表达呈阴性。P12-17范围内的细胞系SKll的基因表达标志可通过比较表I中显示的处于未分化(对照或Ctrrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因ΡΙΤΧ1、ΤΒΧ15、NCAMl、C0L21A1、CYYRl、LAMI3, MEGFlO, RNF165和⑶F10。在SKll中表达的这些基因表达标志中最特异的是TBX15 (Illumina探针ID 6060113)、COL21A1 (Illumina 探针 ID 3440747)、GDFlO (Illumina 探针 ID5690095)、PITXKlllumina 探针 ID 2000373)，并且对基因NNAT(Illumina 探针 ID4010709)、HAND2 (Illumina 探针 ID 4640563)、FOXF2 (Illumina 探针 ID 1660470)、FOXGl (Illumina探针 ID 4200458)、H0XA2 (Illumina 探针 ID 2060471) H0XB2 (Illumina 探针 ID 3460097)和 AJAPiailumina ID 1300647)的表达呈阴性。P15-26范围内的细胞系7PEND24的基因表达标志可通过比较表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因TBX15、CA9、SPAG16、SUSD2、TBXASl、AIFl、SLITRK5、F0XF2、AADAC和F0XG1。在7PEND24中表达的这些基因表达标志中最特异的是AADAC(Illumina探针ID 6200619)、TBX15 (Illumina 探针 ID 6060113)、SPAG16 (Illumina 探针 ID 4390537)、AIFKlllumina 探针 ID 3800047),并且对基因NNAT(Illumina 探针 ID 4010709)、
PITXl (Illumina 探针 ID 2000373)、S0X17 (Illumina 探针 ID 3610193)和 AJAPl (IlluminaID 1300647)的表达呈阴性。P14-15范围内的细胞系E15的基因表达标志可通过比较表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因ENPP2、ABCA6、TBX15、BAI3, CNTN3、TSPYL5、GAP43、AJAPl、CYFIP2、H0XA2(Illumina 探针 ID 2060471) H0XB2 (Illumina 探针 ID 3460097)和 NNAT。在 E15 中表达的这些基因表达标志中最特异的是AJAP1 (Illumina探针ID 1300647)、BAI3 (Illumina探针 ID 5690301)、NNAT (Illumina 探针 ID 4010709)、ABCA6 (Illumina 探针 ID 5810209)，并且对于基因PITX1 (Illumina探针ID 2000373)的表达呈阴性，以及对于基因表达标志HAND2 (Illumina 探针 ID 4640563)和 S0X17 (Illumina 探针 ID3610193)呈阴性。P12-17范围内的细胞系4D20. 8的基因表达标志可通过比较表I中显示的处于未分化(对照或Ctrl))状态中的细胞的基因表达模式来确定。由所述细胞系表达的特异性基因表达标志包括基因LHX8、HAPLNl、LING02、FGF18、GPR126、BBOXl、ITGA4、SHISA3 和BARXl并且对于基因表达标志NNAT和HAND2呈阴性。在4D20. 8中表达的这些基因表达标志中最特异的是:SHISA3 (Illumina 探针 ID 5670286)、LHX8 (Illumina 探针 ID 2900343)、BARXl (Illumina 探针 ID 6450040)、LING02 (Illumina 探针 ID1110291)，并且对于基因PITXl (Illumina 探针 ID 2000373)、SOX17 (Illumina 探针 ID3610193)和 AJAPl (IlluminaID 1300647)的表达呈阴性。如上所指出的，本发明的胚胎软骨祖细胞用于体外或体内产生软骨的方法(有时在本文中称为软骨细胞诱导方法)。可使用任何方便的软骨细胞诱导方法，包括适合用于治疗用途的那些方法(许多示例性软骨诱导/软骨产生方法描述于下文中和实施例部分中)。因此，通过例如在治疗可接受的载体中给受试者施用，本发明的胚胎软骨祖细胞可用于修复软骨组织的治疗性应用。施用所述祖细胞的受试者可具有软骨置换/再生可为其提供治疗益处的任何病症、损伤或疾病。例如，如果受试者在特定的位置具有软骨损伤，例如关节软骨损伤，那么可对软骨损伤的位置施用胚胎祖细胞系。用于此类治疗的药学上可接受的载体包括众多种用作用于细胞移植的治疗性载体的支架、基质等中的任一种。非限定性实例包括包含下列成分的任一种或其组合的载体人造血浆溶液(Hextend);透明质酸(hyaluronan)和其聚合物；硫酸软骨素；1型胶原；11型胶原；111型胶原、聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物；藻酸盐；琼脂糖；泊洛沙姆(polaxomer);纤维蛋白；壳多糖和壳聚糖。示例性支架/基质和它们在软骨细胞分化和治疗中的用途更详细地描述于下文中。在某些治疗性应用中，可在将所使用的软骨细胞胚胎祖细胞系给受试者施用之前，在软骨细胞诱导条件下培养所述细胞，例如以在移植前诱导软骨产生。例如，可将包含从本发明的细胞系产生的软骨的形式或其它结构(例如，模制结构)移植至受试者的例如在软骨丧失、损伤或退变的位置。可在此类实施方案中使用任何方便的软骨产生条件，包括如下条件中任一种或其组合软骨细胞培养条件；将胚胎祖细胞系浸入合成基质或生物可吸收的固定媒介物；和将胚胎祖细胞系置于模制结构中。根据本发明的治疗方法还可包括在移植后在一个或多个时间点上在期望的位置测量软骨的产生速度(例如，测量受损软骨的修复或替换)以及获得关于在受试者中最新形成的软骨的性能的信息。测量的参数可包括存在于患者的移植位置上的施用的细胞的存活、定位和数量。可使用多种扫描技术的任一种测定细胞移植物植入或重建的程度，所述扫描技术是例如计算机轴向体层摄影术(computerized axial tomography) (CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子成象术(PET)扫描。根据本发明的移植的细胞至受试者的功能性整合可通过检查被损伤或患病的功能的恢复例如关节的恢复或功能的增强来评估。细胞移植的移植物植入、定位和存活可通过取出目标组织，并且目视或经显微镜对其检查(例如，在死后分析中)来进行。组织工程软骨3种类型的软骨存在于哺乳动物中，包括透明软骨；纤维软骨和弹性软骨。透明软骨由具有坚硬、弹性稠度的软骨质团块组成，其为透明的并且颜色呈珍珠蓝。透明软骨主要发现于关节接合(articulating joint)的关节表面。它也在骨飯板、肋软骨、气管软骨、支气管软骨和鼻软骨中被发现。纤维软骨基本上与透明软骨相同，除了其包含为软骨增加拉伸强度的I型胶原的纤维外。胶原纤维成束排列，软骨细胞位于束之间。纤维软骨通常发现于无脊椎椎间盘(invertebral disc)的纤维环、腱附着端(tendonous insertion)和韧带附着端(ligamentous insertion)、半月板、耻骨联合(symphysis pubis)和关节囊的附着端中。弹性软骨也与透明软骨相似，除了其包含弹性蛋白的纤维外。其不如透明软骨透明，并且更柔软和更易弯曲。这些特征部分由植入软骨基质的弹性纤维限定。通常，弹性软骨存在于耳的耳郭、会厌和喉中。在某些实施方案中，本发明的软骨产生性细胞被用于修复、替换或增强受试者(例如，哺乳动物，例如人患者)的软骨组织的治疗性应用。可在体外产生软骨，然后将其移植至患病位置或，在某些实施方案中，可将软骨细胞移植(例如，在基质或支架中)以在受试者的期望的位置上产生软骨。已描述了使用软骨产生性细胞(或软骨细胞)的许多疗法，在下文中概述了其中的少数几个疗法。在某些实施方案中，可用本发明的软骨产生性细胞浸溃合成基质或生物可吸收固定媒介物(有时称为“支架”或“基质”)。迄今为止，已使用许多种合成载体基质，其包括三维胶原凝胶(美国专利第 4，846, 835 号；Nishimoto (1990)Med. J. Kinki University15 ；75-86 ；Nixon 等人(1993)Am. J. Vet. Res. 54:349-356 ；ffakitani 等人(1989)J. BoneJoint Surg. 71B :74-80 ;Yasui (1989) J. Jpn. Ortho. Assoc. 63 :529-538);重建的纤维蛋白-凝血酶凝胶(reconstituted fibrin-thrombin gel)(美国专利第 4，642, 120 号；第5，053，050和4，904，259号)；含聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物的合成聚合物基质(美国专利第5，041，138号)；和基于透明质酸的聚合物(Robinson等人.(1990)Calcif. Tissue Int. 46 :246-253)。此类支架和基质中的某些被用于治疗性软骨修复(或针对该修复正接受测试)，包括I型胶原基质(例如，来自Koken Co Ltd, Tokyo Japan的端胶原(Atelocollagen)) ；1型和III型胶双层支架(例如，来自Verigen, Leverkusen,Germany);胶原支架(例如,来自Matricel,Hezoenrath,Germany的隐蔽自体软骨细胞植入(covered Autologous Chondrocyte Implantation) (CACI)和基质诱导的自体软骨细胞植入(matrix-induced autologous chondrocyte implantation) (MACI)系统(ACI-Maix ))；猪 I 型/III 型胶原双层(例如，ChondroGide (Geistlich Biomaterials, ffolhusen,
Switzerland) ;3D-胶原-凝胶-基质(例如，用于来自 BioRegioSTERN, Friedrichstra β e,Stuttgart and Arthro Kinetics Inc,Boston,MA的 CaReS );透明质酸(hyaluruanan)支架，例如，基于透明质酸的生物可降解聚合物的酯化(苄酯)衍生物(例如，来自FidaAdvanced Biopolymers Laboratories, Abano Terme, Italy 的 Hyaff -ll) ;PGA/PLA 共聚物和聚二n惡烧酮支架，例如，凝胶-装载的多孔生物可降解羊毛(gel-loaded porousbiodegradable fleece)(例如，如在来自 Biotissue Technologies,Freiburg,Germany 的Bio-Seed-C中所使用的)；具有琼脂糖-藻酸盐基质的固体支架(例如，来自TBF TissueEngineering, MIONS, FRANCE的Cartipatch ) ;二相性三维胶原-硫酸软骨素支架(例如，来自 TETEC，Reutlingen, Germany 的 N0V0CART 3D)。本发明的软骨产生性细胞可用于软骨重建，如由Anthony Atala和Robert P. Lanza 编著并且由 Academic Press (London)出版的 Methods of TissueEngineering(2002)中所描述的，其通过引用将该著作中关于软骨重建的描述(参见例如，第1027至1039页)并入本文。如其中所描述的，可将软骨产生性细胞置于模制结构中(例如,通过注射成型)，然后移植入动物。随着时间过去，由软骨产生性细胞产生的软骨将替代模制结构，从而产生成形的软骨结构(即，以初始模制结构的形状)。用于模制结构的示例性制模材料包括水凝胶(例如，藻酸盐、琼脂糖、泊洛沙姆(Pluronics))和天然材料(例如，I型胶原、II型胶原和纤维蛋白)。在某些实施方案中，可在体外培养本发明的软骨产生性细胞以形成合成软骨(或软骨样)材料。随后可将所得的软骨在软骨缺损位置植入受试者。该种方法的优点在于可在植入之前监控合成软骨材料的发育。此外，可在植入之前在生物化学和形态学上表征所得的软骨。已开发了两种通用方法以用于体外生长合成软骨。这些方法包括以依赖贴壁或不依赖贴壁的方式生长软骨产生性细胞。在依赖贴壁的方式中，可将软骨产生性细胞在琼脂糖内培养为集落。参见例如Benya 等人(1982)Cell 30 :215-224 ;Aydlotte 等人(1990) in Methods and CartilageResearch Chapter 23 :pp. 90-92 ;Aulthouse 等人(1989)In Vitro Cellular andDevelopmental Biology25 :659-668 ;Delbruck 等人(1986) Connective Tissue Res. 15 1550-172 和 Bohme 等人(1992) J. Cell Biol. 116 :1035_1042。可选择地，在另一个依赖贴壁的方法中，可在悬浮培养中将软骨产生性细胞培养为集落。参见，例如，Franchimont等人.(1989) J. Rheumatol. 16 :5_9 和 Bassleer 等人.(1990) in “Methods and CartilageResearch，，，Academic Press Ltd.,第 24 章。在依赖贴壁的方法中，可将软骨产生性细胞的原代培养物生长为粘附至细胞培养瓶表面的单层。参见例如Yoshihashi (1983) J. Jpn. Ortho. Assoc. 58 :629-641 ;和美国专利第4，356，261号，将所述文献和专利通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，本发明的软骨疗法包括美国专利第5，723，331和5, 786, 217 (标题 为“Methods and compositions for the repair of articularcartilage defects in mammals”,将这两个专利通过引用整体并入本文)中描述的那些方法。这些专利描述了用于体外制备用于软骨缺损修复的合成软骨贴剂的方法。当使用本发明的软骨产生性细胞时，所述方法包括如下步骤(I)将本发明的软骨产生性细胞接种至
具有细胞接触、细胞粘着表面的预成形的孔中；和(2)将本发明的软骨产生性细胞在孔中培养足够的时间以允许细胞分泌细胞外基质，从而形成合成软骨的三维多细胞层贴剂。所得的合成软骨(例如，合成关节软骨)，包含分散在内源产生和分泌的细胞外基质内的本发明的软骨产生性细胞。随后可将所得的合成软骨贴剂用于修复(或替换)受试者(例如，哺乳动物)的软骨缺损。作为另一个实例，可将本发明的软骨形成细胞封装在三维基质例如水凝胶中。不例性水凝胶封装法可见于 “Directed Differentiation of Embryonic Stem Cellsin Three-Dimensional Hydrogel Culture”，Nathaniel S. Hwang, Shyni Varghese 和Jennifer Elisseeff,Methods in Molecular Biology,第407卷p 351 Stem Cell Assays中，其通过引用并入本文。本文中描述的示例性方法概述于下文中。A.将软骨细胞祖细胞光封装(Photo-Encapsulation)在PEGDA或RGD-修饰的PEGDA水凝胶中I.通过将大分子单体以10% (w/v)混合在无菌PBS中来制备PEGDA聚合物聚(乙二醇)_二丙烯酸酯(PEGDA ;目录号 01010F12，Nektar，Huntsville，AL，USA)溶液或RGD-修饰的PEGDA聚合物溶液。保护聚合物溶液免受光照并且可将其在_20°C下贮存3个月。2.将 IOOmg 光引发剂 Igracure 2959(产品编号 1706673，Ciba SpecialtyChemicals, Tarrytown, NY, USA)溶解在 Iml 70%过滤灭菌的乙醇中。3.将PEGDA溶液和光敏引发剂溶液置于碎冰上方直至使用它们。5.将光引发剂加入PEGDA溶液，然后充分混合以产生O. 05% (w/v)的终浓度。确保引发剂与大分子单体溶液充分混合(5ul光引发剂溶液/ml聚合物溶液)。6.通过将含光引发剂的PEGDA溶液加入到细胞颗粒沉淀中并且使用移液器充分混合(但不产生气泡)来将细胞(2000万-3000万个/ml)悬浮在前体(具有光引发剂的聚合物)溶液中。7.将100_1祖细胞-聚合物溶液转移至圆柱形模具中，使其在4. 4mff/cm2的长波长 365nm 的光(Glowmark System, Upper Saddle River, NJ, USA)下暴露 5 分钟以完成凝胶形成。8.将负载“固化的”软骨细胞祖细胞的水凝胶从它们的模具中取出，并将它们转移至装有含10ng/ml TGF-β I的软骨形成培养基的12孔板，在37°C和5% CO2下温育，每隔
2-3天更换培养基。B.将软骨细胞祖细胞封装在藻酸盐水凝胶中I.将软骨形成细胞收集在50-ml锥形管中，以145g离心5分钟。除去上清液，力口入藻酸盐聚合物或RGD-修饰的藻酸盐聚合物溶液,使用(P-IOOO)Pipetteman轻轻悬浮细胞。避免在液体中产生气泡。2.取出Transwell组织培养插入皿之一，用Iml氯化钙溶液充满孔。3.使用PipcttemanJf IOOul细胞悬浮液加入组织培养插入皿。在充满所有插入皿后，使用无菌摄子将插入皿转移至装有氯化钙溶液的孔中。将它们在37°C下于5% CO2中
温育20分钟。4.使用薄而弯曲的刮铲(spatula)利用轻轻的撬开动作从插入皿取出构建体。在每一个孔中放置一个构建体，在37°C、5% CO2下温育。可体外培养水凝胶封装的软骨细胞祖细胞，或将其体内移植至期望产生软骨例如以替换受损软骨或正在丢失的软骨的位置。Glycosan Biosystems也提供了用于三维细胞培养的水凝胶,其可用于培养、组织工程支架和细胞治疗。该公司提供了例如用于体外和体内细胞生长和分化的基于透明质酸的、基于PEG的和基于胶原的水凝胶。来自Glycosan Biosystems的一个示例性水凝胶系统是HyStem-CSS ,其允许在
3-D培养物中温和且快速地回收被封装的细胞。HyStem-CSS使用新型交联剂PEGSSDA，其允许只使用少量还原剂液化HyStem-C水凝胶。重建的HyStem-CSS 组分在15至37°C下保持液体状态。当将交联剂PEGSSDA加入GlycosiI (硫氢基修饰的透明质酸)和Gelin-S (硫氢基修饰的明胶)的混合物时，水凝胶形成。胶凝作用在所有3种成分混合后约20分钟发生。所有步骤都不依赖低温或低pH。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)或细胞培养基稀释组分可增加胶凝时间。所得的水凝胶可以在2小时内于37°C下溶解于40ml乙酰-L-半胱氨酸(还原剂)中。根据制造方案，如下制备HyStem-CSS水凝胶(3X2. 5ml = 7. 5mL)使HyStem、Gelin-S、PEGSSDA 和 DG 水小瓶回至室温。在无菌条件下，使用注射器和针头，将I. OmL DG水加入HyStem小瓶。对于Gelin-S
小瓶，重复操作。将两个小瓶都水平地放置在振荡器或摇床上。将在30分钟内完全溶解所述固体。加温至不超过37°C和/或轻轻涡旋将加速溶解，溶液将是澄清的并且具有微弱粘性的。在无菌条件下，使用注射器和针头，将O. 5mL DG水加入PEGSSDA小瓶。颠倒数次以进行溶解。尽可能快地(但在制备溶液的2小时内)无菌地混合等体积的HyStem和Gelin-S 。为了混合，缓慢地来回用移液器抽吸以避免捕获气泡。将细胞颗粒沉淀重悬浮于2. OmL HyStem+Gelin_S中。用移液器来回抽吸以混合。为了形成水凝胶，以I : 4 的体积比(O. 5mL PEGSSDA 对 2. OmL HyStem+Gelin-S)将PEGSSDA加入HyStem+GeIin-S混合物，然后利用移液器混合。使溶液反应10分钟，随后再次通过移液器抽吸混合以确保细胞均匀分布。胶凝作用将在约10至20分钟内发生。用于软骨发生应用的另一种示例性支架是脱细胞的组织(例如来自尸体来源，例如尸体组织)(参见，例如，Minehara 等人,“A new technique for seeding chondrocytesonto solvent-preserved human meniscus using the chemokinetic effect ofrecombinant human bone morphogenetic protein-2·，，Cell Tissue Bank. 2010 年 6 月
17日.[印刷前的电子版(Epub ahead of print) ] ;Yang 等人“A cartilage ECM-derived3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineeringwith PKH26_labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stemcells.，，Biomaterials· 2008 年 5 月；29 (15) :2378-87 ;和 Stapleton 等人，“Developmentand characterization of an acellular porcine medial meniscus for use in tissueengineering. ”Tissue Eng Part A. 2008 Apr ； 14(4) :505-18 ;将所述文献的每一个通过引用并入本文)。例如,Minehara等人描述了使用溶剂保存(solvent-preserved)的来自尸体的人半月板和软骨细胞趋化药剂的趋化性细胞接种技术。Minehara证明rhBMP-2(以10ng/ml)能够诱导软骨细胞迁移至脱细胞的人半月板中。Minehara等人显示在3周温育后，新形成的软骨细胞外基质由遍布半月板(下至3mm的深度)的迁移的软骨细胞合成。直接注射细胞以赋予原位软骨发生细胞例如细胞系4D20. 8、MEL2、7SM0032、SM30、SK1U7PEND24 或 E15 或具有相同或类似标志的人或动物细胞或本发明的其它细胞的直接注射也具有与先前对于成体源自骨髓的MSC(软骨素原)报导的治疗效用相似的治疗效用。患者经历半月板切除术，然后单次注射透明质酸(HA)或低剂量(5000万个细胞)或高剂量(I亿5000万个细胞)的MSC。针对安全性和另外的初步功效例如疼痛、软骨损伤和组织修复对患者进行监控2年。将非侵入性MRI (Non-invasive MRI)用于检查半月板和软骨状态。在进行手术的骨关节炎(OA)患者中，在一年时，在接受MSC的单次注射的患者中相对于接受对照HA的注射的患者观察到统计上显著的20mm的疼痛的减轻(如通过视觉模拟评分法(VAS)测量的)(MSC 48mmvs.对照28mm, p = 0. 05)。对于患者关节的更严重的骨关节炎变化,疼痛的减轻甚至进一步增加至37mm(p = 0. 004，MSC 56mm vs.对照19mm)。为作比较，目前可获得的OA的治疗例如HA基于超过安慰剂9-23mm的改善而获得食品和药物管理局(FDA)批准。MRI体积分析法因读数之间看到的高水平变化性而被认为不适合于计算分析。因此，不能产生有意义的半月板再生的评估。在关节状态的身体计量中也看到成体MSC的有益效应。在21%的接受对照的患者中，但仅在6%的MSC治疗的患者中报导了与骨关节炎相关的骨质改变例如软骨下硬化和骨赘形成。也存在阳性剂量-响应效应。在一年时，在进行手术以除去受损的半月板之前，疼痛相对于基线的改善为56mm (对于高剂量MSC)、26mm (对于低剂量)和19mm(对于对照)。关节的细胞疗法可从产生关节特异性和患者特异性干细胞、具有改善的再生关节组织的能力的细胞、具有改善的用于放大和低温保存的能力的细胞的技术中受益。本发明提供了表达适合用于工业放大的表达S0X9、MSX1和MSX2的细胞系。用于产生胚胎祖细胞系的方法除了下文中描述的方法外，用于产生和使用本文中描述的细胞系的方法可见于下列专利申请中第20080070303号美国专利公布,标题为“Methods to accelerate theisolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtainedthereby”；2009年7月16日提交的第12/504，630号美国专利申请，标题为“Methods toAccelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells andCells Obtained Thereby，，；2009年7月16日提交的第61/226，237号美国临时专利申请，标题为“Methods and Compositions Useful for In Vitro and In Vivo ChondrogenesisUsing Embryonic Progenitor Cell Lines”；和 2006 年 4 月 11 日提交的第 PCT/US2006/013519 号 PCT 申请，标题为 “NOVEL USES OF CELLS WITH PRENATAL PATTERNS OFGENE EXPRESSION”，将所述每一个专利申请通过引用整体并入本文。虽然下面的方法描述了从hES细胞产生胚胎祖细胞系，但也可使用其它原始干细胞，例如来自人或非人动物的原始干细胞。hES细胞培养和候选培养物的产生
先前描述了所使用的hES细胞系H9(国立卫生研究院-登记为WA09)和从 Advanced Cell Technology 获得的细胞系(MA03) (West 等人，2008, RegenerativeMedicine第3卷(3) pp. 287-308)。将hES细胞常规地培养在hES培养基(K0~DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)、1X 非必需氨基酸(Invitrogen, Carlsbad, CA) >IXGlutamax-I (Invitrogen, Carlsbad, CA)、55uM β -疏基乙酉享(Invitrogen, Carlsbad, CA)、8% 敲除血清替代物(Knock-Out Serum Replacement) (Invitrogen, Carlsbad, CA) > 8 %人血衆 Plasmanate、lOng/ml LIF(Millipore, Billerica, MA)、4ng/ml bFGF(Millipore,Billerica,MA) >50 个单位 /ml 青霉素-50 个单位 /ml 链霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA))中。在丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上将hES细胞系在10% CO2和5% O2的气氛中维持在37°C，通过胰蛋白酶消化或定期人工选择集落传代。为了产生克隆胚胎祖细胞，将hES细胞以500-10，000个细胞/15cm培养皿涂板，随后在两步骤方案下分化，第一步骤是在一系列条件下分化hES细胞以产生称为“候选培养物”的不同细胞异质培养物。利用生长在MEF上的粘附hES细胞(集落原位分化)或利用源自hES的类胚体(EB)进行候选培养物的产生。为了进行集落原位分化实验，将hES细胞生长至汇合并且通过多种方法(如来自 West 等人,2008, Regenerative Medicine 第 3 卷(3) pp. 287-308 (其通过引用整体并入本文)的补充表I中所描述的)使细胞分化。以非限定性实例为例，在于含有10%FCS的DMEM中集落原位分化的情况下,从小鼠饲养细胞(mouse feeder)上的hES细胞集落的培养物抽吸培养基，将培养基替换为含有10% FBS的DMEM培养基以进行分化，进行不同的时间段(1、2、3、4、5、7和9天，于分化培养基中)。随后用0. 25%胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad, CA)分离细胞，将其涂板在150cm2瓶中以进行扩增。如下所述将150cm2瓶中来自各时间点的候选细胞取出涂板(plated out)以进行克隆和扩增。为了进行EB分化实验，用 lmg/ml 胶原酶 IV(于 DMEM 中，Invitrogen, Carlsbad, CA)在 37°C下处理汇合的 hES 培养物15分钟以释放集落。刮取所分离的完整的集落，通过离心(150xg，进行5分钟)收集集落，将其重悬浮于补充表I (来自West等人,2008, Regenerative Medicine第3卷(3)pp. 287-308，将其通过引用整体并入本文)中描述的分化培养基中，然后转移至装有相同分化培养基的 6-孔 Ultra-Low Binding 板(Corning,由 Fisher Scientif ic, Pittsburgh,PA分配的)的单个孔中。根据实验的不同，将EB分化4-7天，用0.25%胰蛋白酶分离分化的EB，将其涂板在含有不同扩增培养基的6孔板中。将6孔板中的候选培养物生长至汇合，然后如下所述，将其取出涂板以进行克隆和扩增。克隆细胞系的分离和扩增用O. 25%胰蛋白酶将上述部分分化的候选细胞培养物分离成单细胞，将其以约500和/或1，000和/或2，000和/或5，000个细胞/板的克隆密度一式两份地涂板在15cm明胶包覆的平板上，以在补充表I (来自West等人,2008, Regenerative Medicine第3卷(3)pp. 287-308，将其通过引用整体并入本文)中显示的多种生长培养基中进行进一步分化和扩增。将克隆密度细胞不受扰动地生长10-14天，使用标准技术利用克隆柱(cloningcylinder)和胰蛋白酶识别和收集产生的集落。将克隆的集落转移至明胶包覆的24孔板中以进行扩增。当克隆在24孔板中汇合(但不将细胞保持汇合超过2天)时，顺序地将它们扩增至12孔、6孔、T-25瓶、T-75瓶、T-150或T-225瓶，最后，扩增至转瓶。扩增至转瓶阶段的克隆细胞系被赋予唯一的ACTC识别号码、拍照并以等分冷冻保存以待以后使用。一旦细胞达到汇合的6孔皿，将它们传代至T-25瓶，取出一部分细胞(5X105)以涂板在凝 胶化的6cm培养皿中，进行基因表达特征谱分析。可选择地，首先将某些细胞传代至T-225瓶，然后取出一部分细胞(5X105)用于涂板在凝胶化的6cm培养皿中以进行基因表达特征谱分析。从而将细胞已经历的群体倍增数测定为18-21PD。在从克隆板取出细胞克隆后，按照制造商的说明书，通过100%乙醇中的结晶紫染色(Sigma HT9132-1L)来使剩余集落可见。实验中使用的细胞培养基包括平滑肌细胞基础培养基(Cat#C-22062B)和生长补充剂(Cat#C-39267)、骨骼肌基础培养基(Cat#C_22060B)和生长补充剂(Cat#C_39365)、内皮细胞基础培养基(Cat#C-22221)和生长补充剂(Cat#C_39221)、黑素细胞基础培养基(Cat#C-24010B)和生长补充剂(Cat#C_39415)获自 PromoCell GmbH (Heidelberg,Germany)。Epi-Life，无钙/无酚红培养基(Cat#M-EPIcf/PRF_500)和低血清生长补充剂(Cat#S-003-10)购自 Cascade Biologies (Portland, Oregon)。Mesencult 基础培养基(Cat#05041)和补充剂(Cat#5402)获自 Stem Cell Technologies (Vancouver, BC)。达尔伯克改良伊格尔培养基(Cat#l 1960-069)和胎牛血清(Cat#SH30070_03)分别购自Invitrogen (Carlsbad, CA)和Hyclone (Logan, UT)。按照制造商的说明书对培养基和补充剂进行组合。克隆胚胎祖细胞系命名法本发明的细胞系以及它们的可选择的名称列于表4中，包括代表因由生物信息学分析而引起的名称的篡改而导致的较小改动的异名，所述改动包括用替换”和用”替换在始于阿拉伯数字的细胞系名称前加“X”，以及后缀例如“biol”或“bio2”和“R印I”或“R印2”，“biol”或“bio2”表示相同细胞系的生物复制物，其冷冻安瓿的相同细胞系被解冻、繁殖并且用于平行研究的情况的实例，“Repl”或“Rep2”表示技术重复，其中第二次使用分离自给定细胞系的RNA进行重复分析而不解冻或始于新的细胞培养。细胞系的传代数(其为细胞已经历胰蛋白酶作用和再涂板的次数)通常利用字母“P”后跟阿拉伯数字来标明，相比而言，群体倍增数(其是指在从一个细胞的克隆扩增中细胞已经历的估算倍增数)通过字母“H)”后跟阿拉伯数字来标明。传代的H)数视实验而变化，但通常每一次胰蛋白酶化和再涂板为处于I : 3至I : 4的比率(分别对应于为I. 5和2的H)的增加)。在克隆的扩增中，如上所述，用克隆柱从组织培养板中取出原始集落，然后转移至24孔板，然后12孔，然后6孔。第一个汇合24孔命名为Pl，第一个汇合12孔培养物为P2，第一个6孔培养物为P3，随后将6孔培养物分成第二 6孔板(P4)和T25 (P4)。将P4时的第二 6孔用于RNA提取(参见2009年7月16日提交第12/504，630号美国专利申请，名称为“Methodsto Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cellsand Cells Obtained Thereby”,其通过引用整体并入本文)并且代表约18-21PD的克隆扩增。通常估计的随后的代和H)是随后分至T75瓶(19. 5-22. 5H))，P6代的细胞分至T225瓶(21-24PD)，随后P7为细胞至转瓶(850cm2，23-26TO)的转移，P8为分入4个转瓶(25-28PD)。括弧中上面显示的范围代表因细胞大小、附着效率和计数误差而引起的细胞计数的估计范围。克隆、混合克隆、寡克隆和混合寡克隆细胞系的扩增本发明的方面提供了用于识别和区分来源于单个细胞(克隆)或细胞系(其为“混合克隆”，意指克隆的细胞系具有不能区别的标志例如基因表达标志并且通常为了在培养中增加细胞的数量而被组合以产生单细胞培养物，或为寡克隆，其中细胞系产生自少量 (通常2-1，000个相似的细胞并且作为细胞系来进行扩增,或为“混合寡克隆”细胞系,其为通过组合两个或更多个具有不能区别的标志例如基因表达模式的寡克隆细胞系产生的细胞系)的胚胎祖细胞系的方法。所述克隆、混合克隆、寡克隆或混合寡克隆细胞系随后通过从它们所附着的基质取出细胞，将所述细胞以通常为细胞的原始数量的1/3至1/4的减小的密度再涂板(以有利于进一步增殖)来进行体外扩增。所述细胞系和它们的相关细胞培养基的实例公开于2009年7月16提交的名称为“Methods to Accelerate the Isolationof Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby，，的第 12/504, 630 号美国专利申请；和 West 等人，2008, Regenerative Medicine 第 3 卷(3)pp. 287-308中，将两者(包括补充信息)通过引用并入本文。本发明的组合物和方法涉及按所描述方式培养的但超过21次倍增的克隆扩增的所述细胞系。基因表达分析为了减小因细胞周期假像(cell cycle artifact)引起的基因表达的变异,和为了捕获细胞的早期基因表达特征谱，在扩增至6孔板时，在细胞达到汇合的当天，将细胞置于血清减少至0.5% (在原始血清浓度超过5%的情况下)的培养基中。在所有其它情况下，将血清和/或其它生长因子减少至它们的原始值的10%。将这些静止条件强制进行5天，在收获前再给所有培养物给料2天以减小给料差异假象。因此，通过举例说明，如果原始培养基为含有10% FCS的DMEM培养基，那么静止同步培养基为含有0. 5% FCS的DMEM0按照制造商的说明书，使用Qiagen RNeasy小试剂盒直接从生长在6孔或6cm组织培养板中的细胞提取总RNA。使用Beckman DU530或Nanodrop分光光度计测量RNA浓度，利用变性琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100生物分析仪测定RNA质量。使用AfTymetrixHuman Genome U133 Plus 2. O GeneChip 系统、Illumina Human-6 vl 和 HumanRef_8 vlBeadchips (Illumina I)以及 Illumina Human-6 v2 Beadchips (Illumina 2)进行全基因组表达分析，并且通过定量PCR确认某些基因的RNA水平。对于Illumina BeadArrays,使用Illumina TotalPrep试剂盒(Ambion)线性扩增并生物素标记总RNA,使用Agilent 2100生物分析仪对cDNA进行质量控制。将cRNA与Illumina BeadChips杂交，处理，然后按照制造商的说明书(Illumina)使用BeadStation阵列读数器读数。将使用共同探针组的所有细胞系的相对荧光单位(RFU)值进行分位数归一化。
上述基因表达分析的数据可见于West等人，2008, Regenerative Medicine第3卷(3)pp. 287-308的补充表中，将其(包括所有补充表)通过引用整体并入本文。在补充表II-IV中，按(对于整个组的细胞系的基因观察到的最高RFU值-平均RFU值)/Ave RFU值的比率的等级次序(最高至最低)显示基因。在补充表V中，针对(对于单个细胞系的基因观察到的最高RFU值)/所有细胞系的Ave RFU值的比率对前45个差异表达的基因按等级次序(最高至最低)排列。在补充表VI中，分别按(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最高RFU值)/Ave RFU值和(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最低RFU值)/AveRFU值的比率的等级次序((最高至最低)以及(最低至最高))显示对应于被识别的⑶抗原的基因。在补充表VII中，按(对于整个组的细胞系中的基因观察到的最高RFU值)/AveRFU值的比率的等级次序(最高至最低)显示对应于分泌的蛋白质的基因。用于诱导软骨细胞分化的示例性条件注意，使用本文中描述祖细胞系的诱导软骨发生(或软骨产生)的任何方便方法可用于(体内或体外)研究或治疗目，这样，预期在这方面不存在限制。因此下文中描述的 测定法代表了用于软骨发生的条件的示例性非限定性实例。微团分化方案I下列分化方案简称为“dl4MM”(例如，在本文中描述的微阵列表中)。I.将细胞培养在明胶(O. 1% )包覆的Corning组织培养物处理的细胞培养皿(cultureware)中，用PBS(Gibco,不含Ca、Mg)以I : 3稀释的.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco)分离细胞。在分离和加入生长培养基后，使用库尔特计数器计数细胞，将进行实验所需的适当数量的细胞(例如，IOX IO6或更多个)以20X IO6个细胞/ml的细胞密度重悬浮于生长培养基中。2.将IOul等分以堆积物(mound)或“微团”形式接种在Corning组织培养物处理的聚苯乙烯板或培养皿上。接种25个或更多个微团等分(200，000个细胞/IOul等分)。3.将接种的微团在37°C以及5% O2和10% CO2下在湿润的培养箱中放置90分钟至2小时，以进行附着。4.加入生长培养基，第二天早上在抽吸和用PBS (不含Ca、Mg)洗涤后，用完全软骨形成培养基(按照下文中对于颗粒微团所描述的方式制备)替换所述生长培养基。例如加入6ml完全软骨形成培养基/IOcm培养皿。将细胞在37°C以及5% O2UO% CO2下维持在湿润的培养箱中，每2-3天用新鲜配制的培养基更换软骨形成培养基。5.在于软骨形成培养基中进行不同的时期后，按Qiagen手册中所述的方式使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen目录号74104)提取RNA。在RNA提取之前，通过在用RLT缓冲液(其由RNeasy小试剂盒提供)裂解微团后使用Qiagen’s QiaShredder (Cat. #79654)匀浆化样品来使RNA收率最大化。对Lonza软骨形成培养基的替代选择是来自Media Tech的CellGro (目录号15-013-CV)。向每一个500ml中加入下列补充剂5. Oml青霉素/链霉素(Gibco目录号 15140)、5· Oml Glutamax (Gibco 目录号 35050)、地塞米松(Sigma, St. Louis,MO, Cat. No. D1756-100)-500ul 0. ImM(终浓度 0. IuM) ；L-脯氨酸(Sigma 目录号D49752)-500ul0. 35M(终浓度 0. 35mM);抗坏血酸 _2_ 磷酸盐(Sigma，目录号 49792，Fluka)-500ul0. 17M(终浓度 0. 17mM) ；ITS Premix(BD, Franklin Lakes, NJ,无菌目录号47743-628)-500ul 1000X浓缩物(终浓度6. 25ug/ml胰岛素、6. 25ug/ml转铁蛋白、6. 25ng/ml 硒酸、血清白蛋白 I. 25mg/ml、5. 35ug/ml 亚油酸)。在加入上述成分后,通过500ml Corning O. 2微米过滤器单元过滤培养基。微团分化方案2下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“dl4MM”。作为对上述Lonza TGFP 3的替代选择，我们使用TGFP 3 (R&D系统，MinneapolisMN，目录号243-B3-010)。其制备、等分以及贮存和使用与购自Lonza的系统类的方式相似。微团分化方案3
下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“dl4CS”。作为对微团方案I的另外的选择，可将细胞直接涂板在完全软骨形成培养基中而非在含有血清的培养基存在的情况下使微团附着。所述分化的微团在本发明中命名为“软骨 _ 接种的(Chondro-seeded)，，或 “CS”。颗粒分化方案下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“dl4Pel”。I.将细胞培养在明胶(O. 1% )包覆的Corning组织培养物的处理细胞培养皿(cultureware)中，然后用PBS(不含Ca、Mg)以I : 3稀释的· 25 %的胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA,Gibco)分离。在分离和加入生长培养基后，使用库尔特计数器计数细胞，将实验所需的适当数量的细胞(例如，IOXlO6或更多个)转移至无菌聚丙烯管中，然后在室温下以150g离心5分钟。2.吸出上清液并弃去。通过加入已向其中加入了补充剂(Lonza, Basel,Switzerland, Poietics Single-Quots, Cat. #PT-4121)的不完全软骨形成培养基(由 hMSCChondro Bullet试剂盒(PT-3925)组成)来洗涤细胞。为制备完全软骨形成培养基而添加的补充剂是地塞米松(PT-4130G)、抗坏血酸盐(PT-4131G)、ITS+补充剂(4113G)、丙酮酸盐(4114G)、脯氨酸(4115G)、庆大霉素(4505G)、谷氨酰胺(PT-4140G)。3.在室温下以150g离心细胞，吸出上清液，以1.0ml不完全软骨形成培养基/7. 5X 105个细胞重悬浮(再一次)细胞颗粒，以150Xg离心5分钟。吸出上清液并弃去。然后对由Lonza描述的软骨发生培养方案进行某些改变(如下文中描写的)。4.将细胞颗粒重悬浮于完全软骨发生培养基至5. OX 105个/ml的浓度。完全软骨形成培养基由Lonza不完全培养基+TGFb3 (Lonza, PT-4124)组成。通过加入含lmg/mlBSA的无菌4mM HCl至20ug/ml的浓度而重建无菌冷冻的TGFb3，在等分后将其于_80°C下贮存。在即将使用前通过对每份2ml的不完全软骨形成培养基加入Iul TGFb3来制备完全软骨形成培养基(终TGFb3浓度为10ng/ml)。5.将O. 5ml (2. 5 X IO5个细胞)细胞悬浮液的等分置于无菌15ml聚丙烯培养管中。在室温下以150 Xg离心细胞5分钟。6.离心后，拧松管盖半圈以允许气体交换。将管在37°C、10% CO2和5% O2的潮湿气氛下置于培养箱中。使颗粒静置24小时。7.通过每2-3天完全更换每个管中的培养基(通过用无菌l-200ul移液管尖头吸出旧培养基，然后向每个管中加入O. 5ml新配制的完全软骨形成培养基)来给细胞颗粒给料。
8.在更换培养基和确保颗粒自由漂浮后，拧松盖子，将管放回培养箱。9.在于软骨形成培养基中进行不同的时间点后收获颗粒，通过用中性缓冲福尔马林固定将其制备用于组织学，和/或将颗粒组合，并制备用于利用RNeasy小试剂盒(Qiagen，Germantown, MD，目录号 74104)提取 RNA。按照Qiagen手册所描述的方式进行RNA提取的方案。通过在RNA提取之前，在用RLT缓冲液(RNeasy小试剂盒中提供的)裂解细胞颗粒后，利用Qiagen’ sQiaShredder (Cat. #79654)匀浆化样品来使RNA收率最大化。藻酸盐珠粒分化方案下列分化方案在本文中描述的微阵列表中简称为“dl4藻酸盐”。
通过低速离心使本发明的细胞形成颗粒，用NaCl (155mM)洗涤，再离心，然后将颗粒以20X 106重悬浮于I. 2%藻酸盐(Lonza)中。将细胞悬浮液抽入Iml注射器中，通过22g针逐滴分配至CaCl2浴液(102mM)中。胶凝化立即发生。用NaCl(155mM)洗涤珠泣3-5次，在浸入软骨形成培养基后，然后用软骨形成培养基(不含TGF)再洗涤一次。将珠粒置于6孔板的多个孔中，一周给料3天，进行14天。随后用NaCl洗涤珠粒多次，然后通过暴露于柠檬酸钠(55mM)20分钟进行解聚。离心后，用RLT(Qiagen)裂解细胞颗粒，在使用QiaShredder的破碎步骤(shredding step)后利用Rneasy微试剂盒(Qiagen)提取总RNA以提高收率。如上所述利用qPCR测定C0L2A1表达。软骨细胞分化的基因表达标志可利用本文中描述的微阵列分析或利用qPCR测定软骨细胞基因表达。可利用本领域内已知的方法选择qPCR引物序列，其非限定性实例可以是
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权利要求
1.一种在受试者中产生软骨的方法，所述方法包括 给所述受试者施用有效量的胚胎祖细胞系组合物，其包括 (a)对于选自由⑶74、⑶90、⑶166、ITGA2、KCNK2及其组合组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的胚胎祖细胞系；和 (b)药学上可接受的载体。
2.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。
3.权利要求2所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系还对于选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。
4.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。
5.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24和7SM007及其组合组成的组。
6.权利要求I所述的方法，其中所述受试者具有软骨损伤并且所述方法包括给所述软骨损伤的位置施用所述胚胎祖细胞系组合物。
7.权利要求6所述的方法，其中所述软骨损伤是关节软骨损伤。
8.权利要求I所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括选自由羟乙基淀粉；透明质酸及其聚合物；硫酸软骨素；1型胶原；11型胶原；ΙΠ型胶原、聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物；藻酸盐；琼脂糖；泊洛沙姆；纤维蛋白；壳多糖和壳聚糖及其组合组成的组的组合物。
9.权利要求I所述的方法，其中在给所述受试者施用之前在软骨细胞诱导条件下培养所述胚胎祖细胞系。
10.权利要求I所述的方法，还包括随时间测量受损的软骨的修复速率。
11.一种产生软骨的方法，所述方法包括在软骨产生性条件下，培养对于选自由CD74、⑶90、⑶166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的克隆性纯化的胚胎祖细胞系。
12.权利要求11所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。
13.权利要求12所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系还对选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。
14.权利要求13所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。
15.权利要求11所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24 和 7SM007 及其组合组成的组。
16.权利要求11所述的方法，其中所述软骨产生性条件选自由软骨细胞培养条件；将胚胎祖细胞系浸入合成基质或生物可吸收的固定媒介物；和将胚胎祖细胞系置于模制结构组成的组中的一个或多个条件。
17.权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括将由所述胚胎祖细胞系产生的软骨移植至受试者。
18.—种试剂盒，其包括 (a)对于选自由⑶74、⑶90、⑶166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的胚胎祖细胞系；和 (b)用于由所述细胞系诱导软骨产生的试剂。
19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24 和 7SM007 及其组合组成的组。
20.权利要求18所述的试剂盒，其中所述用于诱导软骨产生的试剂包含软骨细胞培养试剂。
21.一种组合物，其包含 对于选自由⑶74、⑶90、⑶166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的软骨细胞祖细胞系；和 药学上可接受的载体。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系对于⑶74的表达呈阴性。
23.权利要求21所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系还对选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。
24.权利要求21所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。
25.权利要求21所述的组合物，其中所述软骨细胞祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24 和 7SM007 及其组合组成的组。
26.一种软骨细胞祖细胞系，其对于选自⑶74、⑶90、⑶166、ITGA2和KCNK2中的一个或多个基因的表达呈阴性。
27.权利要求26所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。
28.权利要求26所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系还对选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。
29.权利要求26所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。
30.权利要求26所述的细胞系，其中所述软骨细胞祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24 和 7SM007 组成的组。
全文摘要
本发明的方面包括涉及能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用的方法和组合物。公开了来源于原始干细胞的许多示例性软骨形成细胞系。本文中公开的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度，从而提供了用于产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的不同软骨类型的组合物和方法。
文档编号A61K47/30GK102844036SQ201080041322
公开日2012年12月26日 申请日期2010年7月16日 优先权日2009年7月16日
发明者迈克尔·D··韦斯特, 哈尔·斯滕伯格, 克伦·B··查普曼 申请人:生物时代股份有限公司