3天变得更大，细胞分叉出现足突样的结构，形态类似条件 性永生化的足细胞，在1、2培养基中培养9天的细胞见图3。
[0062] (2)实时定量PCR分析
[0063] 取步骤二中培养6天的细胞（将第3代间充质干细胞作为对照），提取总RNA并 反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定肾脏足细胞特异性标志基因N印hrin基因、Podocin 基因和WTl基因的表达情况。其中Nephrin基因编码的蛋白，定位在足细胞的滤过裂隙膜 上，参与构成肾小球滤过屏障；Podocin基因产物蛋白定位于肾小球裂孔隔膜区，作为支架 蛋白对于维持裂孔隔膜的结构和功能起着重要作用。WTl在后肾脏发育过程中发挥重要的 调节作用，在成体肾脏，WTl基因编码的蛋白持续表达并限定在肾小球足细胞上。
[0064] 采用人P-actin作为各基因的对照，所用的引物如下：
[0065] 用于扩增Nephrin基因的引物为：
[0077] 采用AACT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的N印hrin基 因（或P〇d〇cin、WTl基因）的表达量为1，计算采用培养基1诱导培养后的细胞中各个基因 的相对表达量。采用培养基1诱导培养后的细胞中，N印hrin基因的相对表达量为15. 96， Podocin基因的相对表达量为31.65,WTl基因的相对表达量为2.11。结果见图4。
[0078] (3)免疫荧光染色鉴定
[0079] 将步骤二中培养9天的细胞（将第3代间充质干细胞作为对照）进行免疫荧光染 色，检测足细胞标志物Nephrin、Podocin和WTl的表达情况。
[0080] 检测Nephrin的具体方法如下：细胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗后以含1% BSA 的PBST缓冲液封闭；然后用绵羊鼠抗人N印hrin单克隆抗体（工作浓度为1 :50稀释）作 为4°C孵育8小时；用PBS缓冲液清洗后，再AlexaFluor555 (红色荧光）驴抗绵羊IgG作 为二抗室温孵育30分钟；用PBS缓冲液清洗后用Hoechst33342染色液（Sigma)复染细胞 核（蓝色荧光），在荧光显微镜下观察（OlympusDP72)。第3代间充质干细胞均不显示红 色荧光，为阴性结果（图5A)。采用培养基1、2诱导培养后的细胞80%以上显示红色荧光 (图 5B)。
[0081] 检测Podocin的具体方法同Nephrin的具体方法，差别仅在于采用兔抗人Podocin 单克隆抗体（工作浓度为1:50稀释）作为一抗，采用异硫氰酸标记（绿色荧光）的鸡抗兔 IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果（图5C)。采用培养基 1、2诱导培养后的细胞80%以上显示绿色荧光（图f5D)。
[0082] 检测WTl的具体方法同N印hrin的具体方法，差别仅在于采用山羊抗人WTl单克 隆抗体（工作浓度为1:50稀释）作为一抗，采用AlexaFluor555 (红色荧光）驴抗山羊 IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果（图5E)。采用培养基 1、2诱导培养后的细胞80%以上显示红色荧光（图5F)。
[0083] 结果见图5A-F(图5A、图5C和图5E为第3代间充质干细胞，图5B、图和图5F 为采用培养基1、2诱导培养后的细胞）。结果表明，采用培养基1、2诱导培养后大部分细胞 为Nephrin阳性（图5B)、Podocin(图5D)阳性和WTl阳性（图5F)。
[0084] 以上鉴定结果表明，采用培养基诱导培养后的细胞主要为肾脏足细胞（表达肾脏 足细胞的特异性标志基因，并显示肾脏足细胞的形态）。
【主权项】
1. 一种将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括： 1) 将间充质干细胞接种于培养基1中；以及 2) 将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏足细胞， 其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1. 9% -2. 1%的 胎牛血清、9. 75ng/mL_10. 25ng/mL activin A 以及 0? 95X 10 5mol/L_l. 05X 10 5mol/L 维甲 酸； 其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1. 9% -2. 1%的 胎牛血清、9. 75ng/mL_10. 25ng/mL activin A、0. 95X 10 7mol/L_l. 05X 10 7mol/L维甲酸以 及 19ng/ml_21ng/ml BMP7。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤I)中培养2-4天，以及在所述 步骤2)中培养5-7天，优选在所述步骤1)中培养3天，以及在所述步骤2)中培养6天。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述动物细胞基础培养基是DMEM/F12培养 基， 在培养基1中包括2%的胎牛血清、lOng/mL的activin A和10 5mol/L的维甲酸；以及 在培养基2中包括2%的胎牛血清、lOng/mL的activin A、10 7mol/L的维甲酸和20ng/ ml 的 BMP7〇4. 根据权利要求1-3所述的方法，其中在步骤1)中所述间充质干细胞的浓度为3 X 105 个 /ml_6X IO5个 /ml，优选为 5X 10 5个 /ml。5. 根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞为脂肪间充质干细 胞；优选地，所述间充质干细胞为人间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为第三代间 充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脂肪第三代间充质干细胞。6. 根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞的细胞因子CD29、 ⑶44、⑶105和Flk-I均为阳性，细胞因子⑶31、⑶34、⑶106和HLA-DR均为阴性的细胞。7. -种试剂盒，其包含培养基1和培养基2， 其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1. 9% -2. 1%的 胎牛血清、9. 75ng/mL_10. 25ng/mL activin A 以及 0? 95X 10 5mol/L_l. 05X 10 5mol/L 维甲 酸； 其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1. 9% -2. 1%的 胎牛血清、9. 75ng/mL_10. 25ng/mL activin A、0. 95X 10 7mol/L_l. 05X 10 7mol/L维甲酸以 及 19ng/ml_21ng/ml BMP7。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述动物细胞基础培养基是DMEM/F12培养基， 在所述培养基1中的溶质包括2%的胎牛血清、10]^/1]11的&〇1:;[￥；[1^和10 51]1〇1/1的维 甲酸；以及 在所述培养基2中的溶质包括2%的胎牛血清、10]^/1]11的3〇1:;[￥；[1^、1071]1〇1/1的维甲 酸和 20ng/ml 的 BMP7。9. 一种根据权利要求1-6所述的方法所获得的肾脏足细胞，优选地所述肾脏足细胞中 Nephrin、Podocin和WTl表达量高于所来源的间充质干细胞。10. 根据权利要求9所述的肾脏足细胞在制备用于治疗肾脏足细胞相关疾病、以及在 细胞移植治疗的药物中的用途，优选地所述肾脏足细胞相关疾病为微小病变性肾小球肾 炎、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病、糖尿病肾病。
【专利摘要】本发明涉及肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基。具体地本发明提供将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：1)将间充质干细胞接种于培养基1中；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2中以得到肾脏足细胞，其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mL？activin？A以及0.95×10-5mol/L-1.05×10-5mol/L维甲酸；其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质包括：1.9％-2.1％的胎牛血清、9.75ng/mL-10.25ng/mL？activin？A、0.95×10-7mol/L-1.05×10-7mol/L维甲酸以及19ng/ml-21ng/ml？BMP7。本发明的诱导培养方法，适合于各种脂肪来源的间充质干细胞，该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。
【IPC分类】A61P13/12, C12N5/071, A61K35/22
【公开号】CN105087467
【申请号】CN201510544162
【发明人】赵春华, 张丽娜, 李康华
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月30日