专利名称：紫芝种菌株或子实体特异性分子标记及其获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种紫芝种菌株或子实体特异性分子标 记及其获得方法与应用。
背景技术：
据《神农本草经》和《本草纲目》记载，甘温无毒，主治耳聋，利关节、益精气、坚 筋骨，好颜色、疗虚劳、治痔。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌症、脑溢血和 心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、哮喘、过敏 等疾病有显著疗效。
《中国药典》2000年版记载赤芝(G, /"c!'c/函)和紫芝(G.s!'"ewM)可作为药用；卫 生部发布可用于保健食品的真菌菌种名单目录中，公布了灵芝3个种，即紫芝(G.7固Y/柳)、 紫芝(G. 和松杉灵芝(G. "wgae)。
随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越 来越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带 动了中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食 药用菌品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的 现象在栽培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健 品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品 质量难以稳定的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。
传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真 皮菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化， 而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅 依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进 一步发展尤为重要。
近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)分析及同工酶分析 技术方面。
张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的酯酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株 存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某 些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近， 这些说酯酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。
赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了分 析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组第l 乡且包括黑芝(Ga"ocferwfl fl/n/;w)、丰公杉灵芝(Aswgae)、 圆芝(Gamwfenna ra/w/7c 加w附)、灵芝0770 (Gtmocfenwa/wWw附0770)禾口韩国灵芝(Gawofifez-wa/mcWmw HG); 第2组包括密纹灵芝(Gawo(ierma cre6raW/-/a^w)禾口紫灵芝(Gaw cferma s/wem^);第3组为 树舌灵芝(GflmK^maqfip/a朋加w)。这一结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD技术 可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大,可能是 造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。
1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种 知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记 制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本 发明建立了紫芝种的SCAR分子标记，能对紫芝种进行快速鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种紫芝种菌株或子实体特异性分子标记及其 获得方法与应用，通过该分子标记能简便、快速、准确的鉴定和检测紫芝菌种。
本发明的紫芝种菌株或子实体的特异性分子标记，是一种基因SCAR分子标记， 是PCR扩增后为432bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为 5'-tcaagaagcggagacg-3'禾口 5'-gtgacgaccacaagagc-3，。
本发明的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括如下步骤 I.菌株或子实体基因组DNA的提取 (1)菌株基因组DNA的提取
将4-6'C保藏的紫芝菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯 葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA;(2)子实体基因组DNA的提取
将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANaz混 合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS 溶液分装于2ml离心管中，60-7(TC保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l。/。(m/V)CTAB (十六 烷基三甲基溴化铵)、1 mol/L NaCl、 10 m mol/L EDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V) SDS;
II. 紫芝种菌株或子实体特异DNA片段的获得
用ISSR-PCR法，其中ISSR引物为5'GAAGAAGAAGAAGAAGAA3'，得到紫芝种 菌株或子实体特异DNA片段；
III. 特异性PCR引物的获得
以上述得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物对为 5， -tcaagaagcggagacg-3 ， 禾口5， -gtgacgaccacaagagc-3 ，；
IV. 用特异PCR扩增引物对对紫芝种菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩增
V. 琼脂糖凝胶电泳检测
上述PCR扩增产物6-8tiL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上， 于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝 胶成像仪上照相。
所述步骤I (1)中，LETS法步骤包括
① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；
② 向每个管中加入600-80(HiL的苯酚:氯仿异:戊醇(缩写为PCI)(比例为25:24:1)上下 颠倒，充分混匀，4-l(TC 16000g离心8-15分钟；
③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；
④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；
(D取上清，向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95X乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟； 取出，4。Cl6000g离心10-15分钟；
⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L预冷的70。/。 (V/V)乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4。C16000g离心IO分钟；
⑧ 重复步骤⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2jiL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0Q/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其 质量是否满足试验需要。
所述步骤I (2)中，酚/氯仿法，步骤包括
① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；
② 向每个离心管中加入600-800pL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min; (D取上清，重复重复步骤②1-2次；
④ 取上清，加入600-800(_iL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600piL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15 min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30pL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0。/。琼脂糖凝胶电泳、检湖!)，以确定 其质量是否满足试验需要。
所述步骤II中，ISSR-PCR法扩增反应体系(25jal): 10XPCRbuffer (Promega) 2.5pL， 25mmol/LMgC12 (Promega) 2.0|aL， 10mmol/LdNTPs 0.5pL，引物(20nmol/L) 2pL， Taq 酶(5U/nL) (Promega) 0.25pL， DNA模板(10-20ng/^iL)2.0pL，加无菌双蒸水补足25p， PCR 反应条件:94°C 3min; 94°C lmin， 48。C lmin， 72°C lmin， 40个循环;72°C 5min，紫芝 种菌株或子实体特异DNA片段，大小为553bp，其序列
AAGTCGACGCGTTCTTCTTCTTCTT。
8所述步骤III中，特异PCR扩增引物通过下列方法获得以得到的特异的DNA序列为 基础，设计特异PCR扩增引物对，引物对的序列如下5'-tcaagaagcggagacg-3，和 5 ，-gtgacgaccacaagagc-3 ，；
所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， 25mmol/L MgCl22.0pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 20pmol/L特异引物对各0.5pL， 5U4iLTaq酶0.30pL， 10-20ng4iL DNA模板lpL，加无菌双蒸水补足25^1; PCR反应条件为94°C 2 min; 94 °C 15s, 66°C 30s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 5min。
本发明的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测紫芝种菌 株及市售灵芝类产品的真伪。
本发明的有益效果
(1) 只有紫芝种能PCR扩增出分子量为432bp的专一扩增条带，而灵芝属的其它菌种均 未出现该特异性片断；
(2) 采用这种特异性分子标记进行检测，与常规形态学检测、拮抗试验、出恭试验相比， 具有检测时间短，准确性高的优点，该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所 需时间至少需要两周时间，出燕试验则需要5-6个月的时间。
图1是ITS-PCR扩增产物电泳图谱；
图2是紫芝特异引物对PCR扩增产物电泳图谱。
其中，生产用种(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 来自ATCC (24支):121-126， 128-145;
标号中间有断开的，这是因为在菌种保藏过程中失去活力了，但并未因此改变其他菌株的 编号。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例l
菌种收集到来自国内的140支灵芝属生产用菌种以及来自ATCC24支共计164支菌 株，它们分属于赤芝、紫芝、树舌、松杉灵芝、树舌、密纹薄芝、紫光灵芝、近拟鹿角灵 芝、黄灵芝以及无柄灵芝等10余个种。对它们的基因组DNA和紫芝92子实体基因组(编 号190) DNA共计165个样品进行PCR扩增。
一、 基因组DNA的提取
1. 菌丝培养和基因组DNA的提取
将4-6'C保藏的紫芝菌种转接至使DA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯 葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA; DNA 稀释至10-20 ng/pL， -20。〇保存。
2. 子实体基因组DNA的提取
① 将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤；
② 过滤后用灭过菌的双蒸水冲洗，放在灭过菌的研钵中用液氮处理并进行研磨；
③ 向每个离心管中加入600-800nL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min; 取上清，重复重复步骤②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800nL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-60(VL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15 min;⑧ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30pL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑨ DNA稀释至10-20ng/^iL， -2(TC保存。
二、 特异性PCR扩增
扩增的反应体系总体积为25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0pL， dNTP (10 mmol/L) 0单，20pmol/L特异引物对(5， -tcaagaagcggagacg-3，和5， -gtgacgaccacaagagc-3 ，)各0.5nL， Taq酶(5U/pL) 0.30nL， DNA模板(10-20ng/pL) lpL， 无菌双蒸水补足至25pL。
PCR反应条件为94°C 2min;94。C 15s，66。C 30s， 72。C 1 min， 30个循环；72°C 5min。
三、 琼脂糖凝胶电泳检测
取特异性PCR扩增产物8pL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上，于l.OXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色 5-10min，自来水冲洗后在凝胶成像仪上照相。
结果发现，在这些样品中只有紫芝种能扩增出大小为432bp的专一扩增条带，而灵芝属 的其它菌种均未出现该特异性片断。
权利要求
1.一种紫芝种菌株或子实体的特异性分子标记，其特征在于该标记是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为432bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5’-tcaagaagcggagacg-3’和5’-gtgacgaccacaagagc-3’。
2. 紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括步骤I. 菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取将4-6'C的紫芝菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄 糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA;(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中，60-70。C保温1-3小时，10000陽12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 紫芝种菌株或子实体特异DNA片段的获得用ISSR-PCR法，其中ISSR引物为5'GAAGAAGAAGAAGAAGAA3'，得到紫芝种 菌株或子实体特异DNA片段；III. 特异性PCR引物的获得以上述得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物对为 5， -tcaagaagcggagacg-3 ， 禾口5， -gtgacgaccacaagagc-3 ，；IV. 用特异PCR扩增引物对对紫芝种菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 根据权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在于 所述步骤I (1)中，LETS法步骤包括① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；② 向每个管中加入600-800pL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下 颠倒，充分混匀，4-10。C 16000g离心8-15分钟；③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入50(^L的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4。C16000g离心10-15分钟；⑦ 倒去上清，再向管中加入500^iL预冷的70。/。V/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4'C16000g离心lO分钟；⑧ 重复步骤⑦1次；(D倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2nL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；⑩将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0。/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其 质量是否满足试验需要。
4. 根据权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在于: 所述步骤I (2)中，酚/氯仿法，步骤包括① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；② 向每个离心管中加入600-800pL饱和苯船混匀，12000-14000g离心10-15 min;③ 取上清，重复重复步骤②1-2次； 取上清，加入600-80(HiL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-60(^iL49:l V/V氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30pL的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0n/。琼脂糖凝胶电泳、检领!l，以确定 其质量是否满足试验需要。
5. 根据权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在 于所述步骤II中，ISSR-PCR法扩增反应体系25^1: 10XPCR buffer Promega 2.5^L， 25腿ol/LMgC12 Promega 2.0pL， 10mmol/L dNTPs 0.5pL，引物20(imol/L 2pL， Taq酶5U"L Promega 0.25pL， DNA模板10-20ng L 2.0pL，加无菌双蒸水补足25pl， PCR反应条件 94。C 3min; 94。C lmin， 48°C lmin， 72°C lmin， 40个循环；72°C 5min，紫芝种菌株或 子实体特异DNA片段，大小为553bp，其序列AAGTCGACGCGTTCTTCTTCTTCTT 。
6. 如权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在于: 所述步骤III中，特异PCR扩增引物通过下列方法获得以得到的特异的DNA序列为基 础，设计特异PCR扩增引物对，引物对的序列如下5'-tcaagaagcggagacg-3，和 5，-gtgacgaccacaagagc-3 ，。
7. 根据权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异性分子标记的获得方法，其特 征在于所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25^L: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl22.0^L， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 20pmol/L特异引物对各0.5pL， 5U/jiLTaq 酶0.30pL， 10-20ng4iLDNA模板lpL，加无菌双蒸水补足25pl; PCR反应条件为94°C 2 min; 94°C 15s， 66°C 30s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 5min。
8. 根据权利要求2所述的紫芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在于 所述步骤V中，琼脂糖凝胶电泳检测的条件是PCR扩增产物6-8KiL，与0.5pL加样缓冲液混 匀，于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上，在1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳后，用溴化乙 锭溶液染色5-10min，凝胶成像仪上照相。
9. 一种紫芝种菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测紫芝种菌株及市售 灵芝类产品的真伪。
全文摘要
本发明涉及一种紫芝菌株或子实体的特异性分子标记及其获得方法与应用，该标记是PCR扩增后为432bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5’-tcaagaagcggagacg-3’和5’-gtgacgaccacaagagc-3’；获得方法1)菌株或子实体基因组DNA的提取；2)获得特异DNA片段；3)获得特异PCR扩增引物；4)用特异PCR扩增引物对对紫芝种菌株或子实体的基因组DNA进行扩增；5)琼脂糖凝胶电泳检测；应用用于快速鉴定和检测紫芝种菌株及市售灵芝类产品的真伪。本发明的方法常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。
文档编号C12Q1/04GK101514361SQ20081020454
公开日2009年8月26日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者娜 冯, 方 刘, 刘艳芳, 帅 周, 唐传红, 唐庆九, 张劲松, 焱 杨, 薇 贾, 郝瑞霞 申请人:上海市农业科学院