专利名称：印度灵芝128菌株或子实体特异分子标记及获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种印度灵芝128菌株或子实体特异性分 子标记及其获得方法与应用。
背景技术：
据《神农本草经》和《本草纲目》记载，灵芝有益心气、养心生血、助心充脉、安神、 益脾益肺、强筋骨、利关节、治耳聋等功效。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌 症、脑溢血和心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、 哮喘、过敏等疾病有显著疗效。此外灵芝还有强精、消炎、镇痛、抗菌、解毒、利尿、 净血等多种作用和功效。近年来，国际药学界发现灵芝所含有机锗是人参的4-5倍，锗被认 为是"长寿元素"，能促进血液循环，增强血红蛋白携氧能力，提高代谢功能、延缓衰老。 因此，灵芝被誉为"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越 来越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带 动了中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食 药用菌品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的 现象在栽培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健 品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品
质量难以稳定的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。
传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真 皮菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化，
而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅 依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进
一步发展尤为重要。
近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、 RAPD (Random ampl迅ed polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)分析及同工酶分析 技术方面。
张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的酯酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株 存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某 些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的
5特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近， 这些说酯酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。
赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了 分析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组-第1乡且包括黑芝(Ga"ocferwa！ ar//"ww)、 !^杉灵芝(Gawocfer附a &wgae)、 圆芝(Gawot/enwfl n /w/K/aZw 7)、灵芝0770 (G""otferwa /w"V/ww 0770)禾口韩国灵芝(Gflwocferwa /wcz'dw附HG); 第2组包括密纹灵芝(cw6raW〃'a/ww)禾口紫芝(57'"ewe);第3组为 树舌灵芝(Ga"ocferma";^/fl"a^w)。这一结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD技术 可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大，可能 是造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。
1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种 知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记 制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定 基础。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本发 明建立了印度灵芝128的SCAR分子标记，能对印度灵芝128进行快速鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种印度灵芝128菌株或子实体特异性分子标 记及其获得方法与应用，通过该分子标记能简便、快速、准确的鉴定和检测印度灵芝128 菌种。
本发明的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记，是一种基因SCAR分子标 记，是PCR扩增后为465bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为 5'cttcagatcgtaaaacgggt 3'禾口 5'gtcataaagttgtctccaac 3'。
本发明的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括如下步骤 I.菌株或子实体基因组DNA的提取 (1)菌株基因组DNA的提取
将4-6'C的印度灵芝128菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA; (2)子实体基因组DNA的提取
将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分装于2ml离心管中，60-70。C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后,取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;
II. 印度灵芝128及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、测序及比对 用ITS-PCR法，其中ITS引物对为ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，；
ITS4: 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得印度灵芝128及灵芝属其他种的菌株 或子实体ITS片段；然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。
III. 特异性PCR引物的获得
根据ITS序列的比对结果，找到印度灵芝128的ITS序列上特异性的结合位点(见下 面序列的红色加粗部分)，并设计出特异性PCR引物对为5'cttcagatcgtaaaacgggt 3'和 5'gtcataaagttgtctccaac 3';
IV. 用特异PCR扩增引物对对印度灵芝128菌株或子实体的基因组DNA进行PCR 扩增
V. 琼脂糖凝胶电泳检测。
上述PCR扩增产物6-8pL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上， 于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝 胶成像仪上照相。
所述步骤I (l)中所述的LETS提取法
① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；
② 向每个管中加入600-80(^L的苯酚:氯仿异:戊醇(缩写为PCI)(比例为25:24:1)上下 颠倒，充分混匀，4-10°C 16000g离心8-15分钟；
③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500|iL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；
(D重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；
⑤取上清，向上清液中加入2倍体积的已-20"预冷的无水乙醇或95%乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4。C16000g离心10-15分钟；
⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^^预冷的70% (V/V)乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4。C16000g离心10分钟；
⑧ 重复步骤⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0。/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定 其质量是否满足试验需要。
所述步骤I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括
① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；
② 向每个离心管中加入600-800pL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min; (D取上清，重复重复步骤②1-2次；
取上清，加入600-800^L 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30pL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0。/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定
其质量是否满足试验需要。
所述步骤II中，ITS-PCR扩增反应体系(25yl): 10XPCR buffer (Pro鹏ga) 2.5ul, 25咖ol/LMgC12(Promega) 2. OiU， 10醒ol/L dNTPs 0. L，引物ITS1F/ITS4( 10 y mol/L) 各lyl， Taq酶(5U/yl) (Promega) 0.25ul， DNA模板(IO ng/u L) 1 u L，加无菌双蒸 水补足。PCR反应条件为94°C 2 min; 94°C 15s, 62。C30s， 72°C 1 min， 28个循环； 72°C 5min，印度灵芝128菌株或子实体ITS序列，大小为为626bp，其序列如下AAGCGGAGGA 。
所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25pL: 10XPCR buffer 2.5pL, 25mmol/LMgCl22.0fiL， 10 mmol/L dNTP 0.5^L， 1Opmol/L特异引物对各lpL， 5U/pLTaq 酶0.30nL， 10-20ng/tiLDNA模板lpL，无菌双蒸水补足25pL; PCR反应条件为94°C 2 min; 94。C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30个循环;72°C 5min。
所述步骤V中，琼脂糖凝胶电泳检测的条件是PCR扩增产物6-8pL，与0.5pL加样缓冲 液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上，于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电 泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min,凝胶成像仪上照相。
本发明的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测印度 灵艺128菌株及市售灵芝类产品的真伪。 本发明的有益效果
(1) 只有印度灵芝128能PCR扩增出分子量为465bp的专一扩增条带，而灵芝属的其它 菌种均未出现该特异性片断；
(2) 采用这种特异性分子标记进行检测，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比， 具有检测时间短，准确性高的优点，该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所 需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要5-6个月的时间。
图1是ITS-PCR扩增产物电泳图谱；
图2是印度灵芝128特异引物对PCR扩增产物电泳图谱；
其中，生产用种(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 来自ATCC (24支)121-126， 128-145;
标号中间有断开的，这是因为在菌种保藏过程中失去活力了，但并未因此改变其他菌株的 编号。
具体实施例方式
9下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。
实施例1
菌种收集到来自国内的140支灵芝属生产用菌种以及来自ATCC 24支共计164支菌 株，它们分属于赤芝、紫芝、树舌、松杉灵芝、树舌、密纹薄芝、紫光灵芝、近拟鹿角灵 芝、黄灵芝以及无柄灵芝等10余个种。对它们的基因组DNA和印度灵芝128子实体基 因组(编号190) DNA共计165个样品进行PCR扩增。
一、 基因组DNA的提取
1. 菌丝培养和基因组DNA的提取 (1)菌株基因组DNA的提取
将4-6。C的印度灵芝128菌种转接到PDA斜面上，26-2『C培养活化，5-7天后转接到马 铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA， DNA 稀释至10-20 ng4iL， -20。C保存；
2. 子实体基因组DNA的提取
① 将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤；
② 过滤后用灭过菌的双蒸水冲洗，放在灭过菌的研钵中用液氮处理并进行研磨；
③ 向每个离心管中加入600-800)aL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min; 取上清，重复重复步骤②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800nL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-3(HiL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑨ DNA稀释至10-20 ng/nL， -20。C保存。
二、 特异性PCR扩增
扩增的反应体系总体积为25pL: 10XPCRbuffer 2.5^L， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0^L， dNTP (10 mmol/L) 0.5pL ， 10pmol/L特异引物对(5'cttcagatcgtaaaacgggt 3'和5'gtcataaagttgtctccaac 3')各lpL， Taq酶(5U/^iL) 0.30pL， DNA模板(10-20ng4iL) lpL， 无菌双蒸水补足25pL。
PCR反应条件为94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 5min。 三、琼脂糖凝胶电泳检测
取特异性PCR扩增产物6-8pL,与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖 凝胶上，于l.OXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色 5-10min，自来水冲洗后在凝胶成像仪上照相。
结果发现，在这些样品中只有印度灵芝128能扩增出大小为465bp的专一扩增条带，而 灵芝属的其它菌种均未出现该特异性片断。
权利要求
1.一种印度灵芝128菌株或子实体的特异性分子标记，其特征在于该标记是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为465bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′cttcagatcgtaaaacgggt 3′和5′gtcataaagttgtctccaac 3′。
2. 印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括步骤 I.菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取 将4-6'C的印度灵芝128菌种转接到PDA斜面上，26-28。C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA;(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中，60-70。C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1% m/V CTAB、 1 mol,'L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/V SDS;II. 印度灵芝128及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、测序及序列比对用ITS-PCR法，其中ITS引物对为ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，； ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，得印度灵芝128及灵芝属其他种的菌株 或子实体ITS片段；然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。III. 特异性PCR引物的获得根据ITS序列的比对结果，找到印度灵芝128的ITS序列上特异性的结合位点，利用 Primer Premier5.0设计出特异性PCR引物对为5'cttcagatcgtaaaacgggt 3'和 5'gtcataaagttgtctccaac 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对印度灵芝128菌株或子实体的基因组DNA进行PCR 扩增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 根据权利要求2所述的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其 特征在于所述步骤I(1)中所述的LETS提取法① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；② 向每个管中加入600-800pL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下颠倒，充分混匀，4-l(TC 16000g离心8-15分钟；③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤(D，直到两相的界面没有杂质为止； 取上清，向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4'C16000g离心10-15分钟；⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL预冷的70% V/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4'C16000g离心10分钟；⑧ 重复步骤⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0%琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其质量是否满足试验需要。
4. 根据权利要求2所述的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其 特征在于所述步骤I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；② 向每个离心管中加入600-800pL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min;③ 取上清，重复重复步骤②1-2次；@取上清，加入600-800pL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混匀，12000-l4000g离心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600pL49:l V/V氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30pL的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2|iL lmg/ml的DNase-free RNase; 37'C温浴1-2个小时；⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0c/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定 其质量是否满足试验需要。
5. 根据权利要求2所述的印度灵芝128菌株或子实体的特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤II中，ITS-PCR扩增反应体系25ul: 10XPCR buffer Promega 2. 5ul， 25咖ol/LMgC12 Promega 2.0ul， 10國ol/L dNTPs 0, 5pL，引物ITS1F/ITS4 10umol/L各lu 1， Taq酶5U/wl Promega Q.25ul， DNA模板10 ng/uL 1 u L，加无菌双蒸水补足，PCR反应条件为94°C 2 min; 94°C 15s， 62。C30s， 72 °C 1 min， 28个循 环；72°C 5min，印度灵芝128菌株或子实体ITS序列，大小为为626bp，其序列如下AAGCGGAGGA 。
6. 根据权利要求2所述的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其 特征在于所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25ixL: 10XPCRbuffer 2.5pL, 25mmol/L MgCl2 2.0pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 10jamol/L特异引物对各lpL， 5U4tL Taq 酶0.30^L， 10-20ng&LDNA模板1^L，无菌双蒸水补足25pL; PCR反应条件为94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 5min。
7. 根据权利要求2所述的印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特 征在于所述步骤V中，琼脂糖凝胶电泳检测的条件是PCR扩增产物6-8pL，与0.5pL加样 缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上，于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳， 电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝胶成像仪上照相。
8. —种印度灵芝128菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测印度灵芝 128菌株及市售灵芝类产品的真伪。
全文摘要
本发明涉及一种印度灵芝128菌株或子实体特异分子标记及其获得方法与应用，该标记是PCR扩增后为465bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′cttcagatcgtaaaacgggt 3′和5′gtcataaagttgtctccaac 3′；获得方法1)菌株或子实体基因组DNA的提取；2)获得特异DNA片段；3)获得特异PCR扩增引物；4)用特异PCR扩增引物对对菌株或子实体的基因组DNA进行扩增；5)琼脂糖凝胶电泳检测；应用用于快速鉴定和检测印度灵芝128菌株及市售灵芝类产品的真伪。本发明的方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。
文档编号C12Q1/04GK101550442SQ20081020454
公开日2009年10月7日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者娜 冯, 方 刘, 刘艳芳, 帅 周, 唐传红, 唐庆九, 张劲松, 焱 杨, 苏春丽, 薇 贾, 郝瑞霞 申请人:上海市农业科学院