专利名称：赤芝种121菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种赤芝种121菌株或其子实体分子标记 及其获得方法与应用。
背景技术：
据《神农本草经》和《本草纲目》记载，灵芝有益心气、养心生血、助心充脉、安神、 益脾益肺、强筋骨、利关节、治耳聋等功效。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌 症、脑溢血和心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、 哮喘、过敏等疾病有显著疗效。此外灵芝还有强精、消炎、镇痛、抗菌、解毒、利尿、净 血等多种作用和功效。近年来，国际药学界发现灵芝所含有机锗是人参的4一5倍，锗被认 为是"长寿元素"，能促进血液循环，增强血红蛋白携氧能力，提高代谢功能、延缓衰老。 因此，灵芝被誉为"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
20世纪80年代开始的大量药理研究证明，灵芝水提取物或所含多糖对多种动物移植性 肿瘤具有抑制作用，并推测其体内抗肿瘤作用可能是宿主中介性的。灵芝多糖参与诱导的 CIK细胞在荷瘤小鼠体内具有良好的抗肿瘤效应。并证实灵芝多糖可通过多糖特异受体补 体m型受体(CR3)结合途径介导其免疫活性。认为灵芝多糖具有确切的免疫活性，能够 作为免疫效应细胞良好的生物反应调节剂和免疫增强剂。
灵芝(Ga朋Ar附a/wc/^m)是重要的药用真菌，《中国药典》2000年版记载赤芝
(G. /wd血w)和紫芝(G.w'加"M)可作为药用；卫生部发布可用于保健食品的真菌菌种 名单目录中，公布了灵芝3个种，即赤芝(G. hcW"w)、紫芝(G. 和松杉灵芝
(G, 。
随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越 来越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带 动了中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食 药用菌品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的 现象在栽培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健 品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品 质量难以稳定的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。
传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真 皮菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化，而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅 依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进 一步发展尤为重要。
近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)分析及同工酶分析 技术方面c
张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的酯酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株 存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某 些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的 特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近， 这些说酯酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。
赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了 分析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组 第1纟且包 舌黑芝(Ga"otiferma crfnwz)、丰公杉灵芝(Gcmocfenr a towgae)、 圆芝(Gflwo^/erw" ra加"cfo/ww)、灵芝0770 (Ga wtfenna /wczWwm 0770)禾口韩国灵芝(Gawo^femw /wczWw/w HG); 第2组包括密纹灵芝(Gflf"ocfenrw cre/)roWn'a/i/w)禾口紫灵芝(Gflwotferm" w'we""); 第3 组为树舌灵芝(Gcmo&rmaa;^/朋加湖)。这一结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD 技术可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大， 可能是造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。
1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种 知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记 制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定
基础o
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，但 目前尚未有对赤芝种121的SCAR分子标记，以快速鉴定赤芝种121。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标 记及其获得方法与应用，以便对赤芝菌种121进行简便、快速、准确的鉴定和检测。
6本发明的一种赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记，是一种基因SCAR分 子标记，是PCR扩增后为774bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为 5'TCCCACGACTGTTGAAATACG 3'禾口 5'TGTTGTGAGCTTCGACCAT 3'。
本发明的一种赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下列
步骤
I. 菌株或子实体基因组DNA的提取
(1) 菌株基因组DNA的提取 将4-6'C的赤芝121菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯
葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA将4-6。C 的赤芝菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中， 26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA， DNA稀释至10-20ng4iL， 保存备用；
(2) 子实体基因组DNA的提取
将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分装于2ml离心管中，60-70'C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS。
II. 赤芝种121菌株或子实体特异DNA片段的获得
采用ISSR-PCR法，其中ISSR引物为5'TTCCCTTCCCTTCCC3'，经大量筛选试验， 得赤芝种121菌株或子实体特异DNA片段；
III. 特异性PCR引物的获得
以得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列 5TCCCACGACTGTTGAAATACG 3'禾口 5'TGTTGTGAGCTTCGACCAT 3';
IV. 用特异PCR扩增引物对对赤芝种121菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩 增
V. 琼脂糖凝胶电泳检测
上述PCR扩增产物6-8pL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上， 于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝 胶成像仪上照相。所述步骤I U)中，LETS法，
① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；
② 向每个管中加入600-800nL的苯酚:氯仿异:戊醇(缩写为PCI)(比例为25:24:1)上下 颠倒，充分混匀，4-10°C 16000g离心8-15分钟；
③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入50(HiL的PCI, 4°C 16000g离心8-15分钟；
④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；
⑥ 取出，4'C16000g离心10-15分钟；
⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L预冷的70y。 (V/V)乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4'C16000g离心10分钟；
⑧ 重复步骤⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0y。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其 质量是否满足试验需要。
所述步骤I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括
① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；
② 向每个离心管中加入600-80(HiL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min;
③ 取上清，重复重复步骤②1-2次；
取上清，加入600-800pL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70°/。 (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30nL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2nL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0yQ琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定 其质量是否满足试验需要。
所述步骤II中，ISSR-PCR法扩增反应体系(25pl): 10XPCRbuffer (Promega) 2.5^L，25mmol/LMgC12 (Promega) 2.0pL， 10mmol/L dNTPs 0.5pL，引物(20pmol/L) 2pL， Taq 酶(5U4iL) (P醒ega) 0.25pL， DNA模板(10-20ng/nL)2.0pL，加无菌双蒸水补足25pl， PCR反应条件94°C 3min; 94°C lmin， 52°C lmin， 72°C lmin， 40个循环；72°C 5min, 赤芝种121菌株或子实体特异DNA片段，大小为809bp，其序列
TAACTATCGTATTTCAACAGTCGTGGGAAGGGAAGGGAA。
所述步骤IV中，10XPCR buffer 2.5|iL， 25mmol/LMgCl2 1.5^L， 10 mmol/LdNTP0.5nL, 20pmol/L特异引物对各0.5pL， 5U/pL Taq酶0.20pL， 10-20ng4iL DNA模板2.0pL，加无 菌双蒸水补足25pL; PCR反应条件为94°C 3 min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30个循环;72°C 10min。
本发明的赤芝种121菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测赤芝 种121菌株及市售灵芝类产品的真伪。
有益效果
(1) 只有赤芝种121能PCR扩增出分子量为774bp的专一扩增条带，而灵芝属的其它 菌种均未出现该特异性片断；
(2) 采用这种特异性分子标记进行检测，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比， 具有检测时间短，准确性高的优点，该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所 需时间至少需要两周时间，出燕试验则需要5-6个月的时间。
图1是ISSR-PCR扩增产物电泳图2是赤芝种121特异引物对PCR扩增产物电泳图。其中，生产用种(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 来自ATCC (24支):121-126， 128-145;
标号中间有断开的，这是因为在菌种保藏过程中失去活力了，但并未因此改变其他菌株的 编号。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。
实施例1
菌种收集到来自国内的140支灵芝属生产用菌种以及来自ATCC24支共计164支菌 株，它们分属于赤芝、紫芝、树舌、松杉灵芝、树舌、密纹薄芝、紫光灵芝、近拟鹿角灵 芝、黄灵芝以及无柄灵芝等10余个种。对它们的基因组DNA和121号的子实体基因组(编 号190) DNA共计165个样品进行PCR扩增。 一、基因组DNA的提取
1. 菌丝培养和基因组DNA的提取
将4-6'C保藏的赤芝121菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马 铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA; DNA 稀释至10-20ng4iL， .2(TC保存。
2. 子实体基因组DNA的提取
① 将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 moI/L EDTANa2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤；
② 过滤后用灭过菌的双蒸水冲洗，放在灭过菌的研钵中用液氮处理并进行研磨；
③ 向每个离心管中加入600-800pL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min; 取上清，重复重复步骤②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800[iL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600nL49:l (V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;⑧ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30nL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；
⑨ DNA稀释至10-20 ng/nL， -20°C保存。
二、 特异性PCR扩增
10XPCRbuffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl2 1.5pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 20nmol/L特异引 物对各0.5pL， 5U/pLTaq酶0.20pL， 10-20ng/pL DNA模板2.0pL，加无菌双蒸水补足25^1; PCR反应条件为94°C 3min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 10 min。
三、 琼脂糖凝胶电泳检测
取特异性PCR扩增产物6-8piL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5%的琼脂糖 凝胶上，于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色 5-10min，自来水冲洗后在凝胶成像仪上照相。
结果发现，在这些样品中只有赤芝种121能扩增出分子量为774bp的专一扩增条带，而 灵芝属的其它菌种均未出现该特异性片断。
权利要求
1.一种赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记，其特征在于该标记是是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为774bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′TCCCACGACTGTTGAAATACG 3′和5′TGTTGTGAGCTTCGACCAT 3′。
2. —种赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下列步骤I. 菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取 将4-6'C的赤芝121菌种转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA将4-6。C 的赤芝菌种转接到PDA斜面上，26-28"C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中， 26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA， DNA稀释至10-20ng4iL， 保存备用；(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1 OOOpL pH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中，60-70。C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1% m/V CTAB、 1 mol/L NaCI、 10mmol/LEDTA、 20 m moI/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 赤芝种121菌株或子实体特异DNA片段的获得采用ISSR-PCR法，其中ISSR引物为5'TTCCCTTCCCTTCCC 3'，得赤芝种121菌 株或子实体特异DNA片段；III. 特异性PCR引物的获得以得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列 5'TCCCACGACTGTTGAAATACG 3'和5'TGTTGTGAGCTTCGACCAT 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对赤芝种121菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩 增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 根据权利要求2所述的赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤I (l)中所述的LETS提取法①将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；②向每个管中加入600-80(HiL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下 颠倒，充分混匀，4-10°C 16000g离心8-15分钟；(D轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍体积的己-20匸预冷的无水乙醇或95%乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4'C16000g离心10-15分钟；⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL预冷的70yQV/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4。C16000g离心IO分钟；⑧ 重复步骤⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0Q/。琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其 质量是否满足试验需要。
4. 根据权利要求2所述的赤芝种121菌株或子实体的特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括① 将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0 ml的离心管中；② 向每个离心管中加入600-80(^L饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15 min;③ 取上清，重复重复步骤②1-2次； 取上清，加入600-800nL 1:1V/V苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-60(^iL 49:1 V/V氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。/V的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-3(VL的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2pL 1 mg/ml的DNase-free RNase; 37°C温浴1 -2个小时；⑧ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0n/c琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其质量是否满足试验需要。
5. 根据权利要求2所述的赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤II中，ISSR-PCR法扩增反应体系25^1: 10XPCR buffer romega 2.5^L， 25mmol/LMgC12Promega2.0^tL， 10mmol/L dNTPs 0.5jxL，引物20pmol/L2pL， Taq酶5U尔L Promega 0.25(xL， DNA模板10-20ng4iL 2.0nL，加无菌双蒸水补足25^1， PCR反 应条件94°C 3min; 94°C hnin， 52°C lmin， 72。C lmin， 40个循环；72。C 5min，赤芝 种121菌株或子实体特异DNA片段，大小为809bp，其序列-TAACTATCGTATTTCAACAGTCGTGGGAAGGGAAGGGAA 。
6. 根据权利要求2所述的赤芝种121菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl2 1.5pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 20nmol/L特异引物对各0.5^L， 5U/pLTaq 酶0.20pL， 10-20ng4iL DNA模板2.0nL，加无菌双蒸水补足25^L; PCR反应条件为94 。C 3min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 10min。
7. 根据权利要求2所述的赤芝种菌株或子实体的特异性分子标记的获得方法，其特征 在于所述步骤V中，琼脂糖凝胶电泳检测的条件是PCR扩增产物6-8pL，与0.5pL加样缓 冲液混匀，于1.2-1.5%的琼脂糖凝胶上，在1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳后，用 溴化乙锭溶液染色5-10min，凝胶成像仪上照相。
8. 赤芝种121菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测赤芝种121菌株 及市售灵芝类产品的真伪。
全文摘要
本发明涉及一种赤芝种121菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用，该标记是PCR扩增后为774bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′TCCCACGACTGTTGAAATACG 3′和5′TGTTGTGAGCTTCGACCAT 3′；获得方法1)菌株或子实体基因组DNA的提取；2)获得特异DNA片段；3)获得特异PCR扩增引物；4)用特异PCR扩增引物对对赤芝种121菌株或子实体的基因组DNA进行扩增；5)琼脂糖凝胶电泳检测；应用用于快速鉴定和检测赤芝种121菌株及市售灵芝类产品的真伪。本方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。
文档编号C12Q1/04GK101514359SQ20081020454
公开日2009年8月26日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者娜 冯, 方 刘, 刘艳芳, 帅 周, 唐传红, 唐庆九, 张劲松, 焱 杨, 许美燕, 薇 贾, 郝瑞霞 申请人:上海市农业科学院