Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用的制作方法

专利名称：Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片，具体涉及与Leber氏遗传性视神经病变相关的检测基因芯片及 其制备与应用。
背景技术：
Leber氏遗传性视神经病变(Leber， s hereditary optic neuropathy, L,)是一 种最常见的遗传性视神经萎縮疾病，以两侧急性或亚急性中央视力丧失为特征，主要累及 青少年男性。1871年，Theodor Leber首次报道了一个LHON家系，并详尽描述了 LHON的 临床特征。随后一段时期内，人们认为LHON的遗传学模式与X染色体相关联(X-linked), 直到1972年Erickson提议LHON的遗传方式更倾向于母系遗传，他认为可能存在某个潜在 的线粒体DNA(mtDNA)突变与LHON相关。1988年，Wallace及其同事首次报道LHON与MTND4 基因11778G〉A突变相关，至今已有30多种mtDNA点突变被报道与LHON相关，它们广泛地 分布在世界各地不同种族和人群中。从MITOMAP数据库(http:〃w丽.mitomap.org)可以检 索到与LHON相关的基因突变位点，其中90%以上的LHON患者与三大原发性mtDNA突变 (11778G〉A, 3460G〉A及14484T〉C)有关，一些罕见的rotDNA突变也能引发LH0N，如14459G〉A, 10663T〉C, 14568C>T， 14482T〉A/G, 14495A>G, 4171C〉A， 3733G〉A等。虽然LHON的发病机 制至今没有被完全阐明，毋庸置疑，原发性突变是LHON的发病基础。但仅存在原发性突变 还不足以致病，如携带11778G〉A, 3460G〉A或14484T〉C的部分家系成员可不表现出任何临 床症状，其他遗传学因素(如继发性mtDNA突变、核调节基因)和环境因素亦可能在LHON 的病理生理学进程中发挥关键作用。此外，携带相同原发性突变位点的不同家系可表现出 不同的外显率、发病年龄、严重程度以及视力丧失过程。因而，有必要对原发性突变以外 的致病因素(如罕见突变和继发性突变)进行筛査，以进一步阐明mtDNA突变与LHON的关 系，为诊断和治疗提供指导。
基因诊断技术的出现，改变了过去临床上仅依靠典型家族史和临床特征为判断依据，提 高了对散发LHON病的确诊率。至今LHON病仍无十分有效的疗法，婚前遗传咨询和分子遗 传学检测是预防和降低本病发生率的有效措施。己经建立了不少mtDNA突变检测方法，如
4限制性酶切片段长度多态性(Restriction fragment length poly morphism， RFLP)、单链 构象多态性(Single- strand conformation polymorphism, SSCP)、等位基因特异性寡核 苷酸斑点印记(Allele-specific oligonucleotide dot blot)、温度梯度电泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)、 瞬时温度梯度电泳(Temporal temperature gradient gel electrophoresis, TTGE)、变性梯度凝胶电泳(Denaturant gradient gel electrophoresis, DGGE)禾口变性高效液相色谱(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等，但在实际运用中这些技术仍存在一定的局限性，如RFLP花费 高、工作量大，且有些重要突变位点因不在所用限制性内切核酸酶的识别范围而不能被检 测到，其他方法相对于RFLP要复杂，更主要的是，这些方法大多一次只能针对一个或几个 突变位点进行检测，检测结果常需DNA测序验证。全长mtDNA测序技术是目前LHON病最可 靠的基因诊断方法，但该方法工作量大、费用昂贵，难以在常规临床诊断实验室普及运用。
目前，与本发明相关的中国发明专利共有三个，发明名称分别是Leber氏遗传性视 神经病变检测方法及其试剂盒(申请号96116296.1)， Leber' s遗传性视神经病病人的线 粒体DNA突变定量检测方法(申请号200410027623.4)和Leber氏遗传性视神经病变的 基因诊断试剂盒及其检测方法(申请号200510006097.8)。这些专利都只针对LH0N三种 原发性突变(11778G〉A， 3460G〉A及14484T〉C)中的部分或全部进行检测，而不针对罕见 突变或继发性突变进行检测，在运用上仍有一定的局限性。
基因芯片是近年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一体的高新 技术，利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊序列 的生物样品有序地固化在玻璃片和硅片等基质表面，并利用微量反应体积， 一次杂交就可 以对许多基因表达水平、突变和多态性进行特异、快速、精确检测，己经在基因表达、基 因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。由于基因芯片具有这些独特的 优点使其在线粒体基因检测方面得到一定的运用，如利用表达谱微阵列对线粒体基因的表 达状况进行检测，来探讨线粒体病的发病机制，或利用寡核苷酸微阵列上的引物延伸反应 或直接核酸杂交检测线粒体单核苷酸多肽性(SNP)等。
由于与LH0N相关的mtDNA突变位点数量较多，常规基因诊断方法已经难以满足要求， 因而，研发一种新型基因芯片，用于对LHON相关mtDNA突变位点的集成检测，无疑具有潜 在的社会效益和临床价值。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检 测基因芯片及其制作方法。
本发明的另一个目的在于提供一种上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点 集成检测基因芯片的使用方法。
本发明的构思如下
建立一种检测Leber氏遗传性视神经病变相关32个突变位点的基因芯片。该基因芯片 包括检测系统和监控系统。检测系统根据MITOMAP数据库(hUp:〃丽w.mitomap.org)报道 的32个与Leber氏遗传性视神经病变相关的线粒体DNA (mtDNA)突变位点，设计相应的位点 特异性寡核苷酸探针，利用氨基与醛基的共价结合将寡核苷酸探针固定在芯片表面，探针 与荧光标记的样本PCR扩增产物杂交，根据杂交信号可判断有无突变发生及突变类型。监 测系统与检测系统位于同一阵列，包括阳性对照、阴性对照和平行对照，阳性对照为检测 系统各探针的等量混合物，阴性探针为点样液，平行对照为东亚人常见的mtDNA U719G〉A 单核苷酸多态性位点探针，可以根据监控系统来判断杂交的质量。
具体来说，根据修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)和MITOMAP数据库(http:〃www. mitomap. org)报道的32种与Leber氏遗传性视神经 病变相关的mtDNA点突变(分别为:T3394C、 G3460A、 G3635A、 G3733A、 A4136G、 T4160C、 C4171A、 T4216C、 A4435G、 C4640A、 A4917G、 G5244A、 G7444A、 G9738T、 G9804A、 T10663C、 G11696A、 G11778A、 G13708A、 G13730A、 G14459A、 C14484A、 A14495G、 T14498C、 A14495G、 T14498C、 C14568T、 A14596T、 A14693G、 G15257A、 G15812A、 A15951G)和东亚人常见的mtDNA 11719G〉A多态性位点，共设计了 33对探针(其中32对探针针对32个Leber氏遗传性视神 经病变相关突变位点，1对探针针对11719G〉A多态性位点)和11对PCR引物。11对引物 分成三组在同一热循环下进行多重PCR扩增，能特异地扩增出包含上述32个Leber氏遗传 性视神经病变相关mtDNA突变位点和11719G〉A多态性位点的目的DNA片段。在一张芯片上 固定上述33对探针，只用一次PCR和一次杂交反应，就可以在6—8小时及时准确地确认 被检者是否存在上述突变位点，.从而为治疗和遗传学咨询提供确凿证据，并可以进一步阐 明这些突变位点在中国人群中的分布及其对病因、发病机理、临床治疗及预后的影响。
本发明一方面公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因 芯片，在基因芯片载体表面点阵固定有与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位 点的特异性寡核苷酸探针和mtDNA 11719G〉A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针。
6上述特异性寡核苷酸探针的设计原则为根据MITOMAP数据库报道的32种LHON相关 mtDNA突变位点和11719G〉A多态性位点，参考修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5) °C，使探 针长度位于14-20 bp，使每对探针所检测的基因位点位于探针序列中部或中部附近，使探 针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5'端至中部区域之间以保障杂交 效率。特异性寡核苷酸探针可特异性识别Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位 点和11719G〉A多态性位点。
上述特异性寡核苷酸探针选自序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探针中的一个或多个。
较佳的，基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探针，该 芯片可用于特异检测LHON相关的mtDNA突变和11719G〉A多态性位点。
优选的，上述寡核苷酸探针的5'端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合，探 针5'端加上一段15聚的Poly T，以减少杂交时的空间位阻。
上述基因芯片还可固定有阴性对照及阳性对照。阴性对照为点样液，阳性对照为所选的 各寡核苷酸探针的等量混合液。
上述基因芯片载体可以为载玻片，优选醛基修饰的载玻片。
本发明第二方面，公开了上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测 基因芯片的制备方法，包括下列步骤
将选自序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探针5'端加上一段15聚的Poly T,并对 5'端进行氨基修饰，用去离子水将各探针分别稀释，并分别与点样液等体积混合，获得终 浓度为12.5 50 uM的寡核苷酸探针溶液，采用常规的方法将寡核苷酸探针溶液与阴性对 照和阳性对照一起点阵于载玻片表面并固定。
上述点样液的作用在于优化芯片制作的质量，可选用各种市售或自行配置的点样液。
本发明的第三方面，公开了上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检 测基因芯片的使用方法，包括下列步骤
1) 收集患者外周血，抽取样本DNA;
2) 样本DNA的PCR扩增和标记以样本DNA为模板，选择合适引物PCR扩增并标记待 测的突变相关序列；
3) 采用前述基因芯片于样本PCR产物变性后进行杂交检测将样本PCR扩增产物等体
7积混合后，与适量体积杂交液混合(如将样本PCR扩增产物与杂交液以1: 2 1: l的体积 比混合)，将与杂交液混匀后的PCR产物变性，取适量体积滴在芯片的点阵区进行杂交，杂 交后用洗液洗涤，再检测标记信号的强度。通过检测标记信号的强度比对，可判断是否发 生相应突变。
上述杂交液为常规用于核酸杂交反应的杂交液，可选用各种市售或自行配置的杂交液。
上述杂交液溶解后的PCR扩增产物变性可采用常规的变性方法，如95'C变性。 洗液用于将未完全匹配的PCR扩增产物从芯片上除去，可选用本领域常规的用于核酸杂 交的洗液。
较佳的，上述步骤3中，杂交温度为35-40。C;杂交时间为30-60分钟。
洗液洗涤时，先用一次洗液洗5-15分钟，再用二次洗液洗5-15分钟。优选的， 一次洗 液为2xSSC+0. lw%SDS (以洗液总重量为基础计)；二次洗液为0. 2xSSC+0. lw%SDS ; —次 洗脱条件为30'C洗涤IO分钟；二次洗脱条件为3(TC洗涤5分钟。
改进的，上述步骤2中的引物选自序列为SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。每对正反 引物中，至少有一个被标记，标记可采用常规的标记，如荧光标记等，本发明实施例中使 用了 Cy5荧光分子标记，并使用激光共聚集扫描仪扫描荧光信号强度。
更佳的，上述步骤2中的PCR扩增为多重PCR扩增将序列为ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 IDN0.80 87的核苷酸序列分别作为三组多重PCR的引物，在同一热循环下以样本DNA 为模板进行PCR扩增。
本发明的第四方面，公开了上述检测Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集 成检测基因芯片在制备Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试剂盒中的 应用。
本发明第五方面，公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试 剂盒，包括上述基因芯片，及Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增 引物。
较佳的，上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物为选自序 列为SEQ ID NO. 66 87的核苷酸序列中的一个或多个。
优选的，上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物为SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。各引物可分别独立包装。
试剂盒中还可包括其他在试剂盒使用过程中需用到的常规试剂，如杂交液、核酸杂交洗 液等。较佳的，上述洗液包括一次洗液和二次洗液，其中一次洗液为2xSSC+0. lw%SDS; 二次洗液为0. 2xSSC + 0. lw%xSDS。
本发明的基因芯片可用于检测Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点，可一 次同时检测32种mtDNA突变位点。优选方案仅需1次PCR扩增和1次杂交反应，即可特异 性检测临床样本中32种与Leber氏遗传性视神经病变相关的突变位点。本发明的基因芯片 具有省时、费用低廉和操作简便等优点，从样本制备到PCR扩增，得到检测结果，可在6 一8小时内完成，大大縮短了对患者的诊断时间，可以对临床上疑似Leber氏遗传性视神经 病变患者的mtDNA进行初步筛查，以确定有无已知突变体，从而为疾病的治疗或遗传学咨 询提供一定的线索，具有较好的临床推广价值。本发明的基因芯片还具有很高的灵敏度和 特异性，与传统分子生物学方法相比，检测时间大大缩短，达到LHON临床诊断与鉴别诊断 的目的。


图l芯片点样布阵图，P为阳性对照，成份为SEQ ID NO. 1 65探针的等量混合物，N为 阴性对照，成份为点样液。
图2 P卜11778G〉A均质性突变体芯片检测与DM测序结果
图3 P2-11778G〉A异质性突变体芯片检测与DNA测序结果
图4 P3-3460G〉A和3394T>C均质性突变体芯片检测与DNA测序结果
图5 P4-14484T>C均质性突变体芯片检测与DNA测序结果
具体实施例方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常 规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1 探针设计和芯片的制备 (1)芯片上探针的设计 根据MIT0MAP数据库报道的32种LHON相关mtDNA突变位点和11719G〉A多态性位点， 参考修正版剑桥ratDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，设计并筛选获得33对寡核苷酸探针，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5) 'C，使探针长度位 于14-20 bp，使每对探针所检测的基因位点位于探针序列中部或中部附近，使探针与相应 单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5'端至中部区域之间以保障杂交效率。探针 的5'端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合；不同探针的综合参数(探针长度、 GCX及Tm值)尽量接近，为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在33对探针的寡核苷酸 5'端加上一段15聚的Poly T (连接臂)。阳性对照探针选取各个探针的等量混合物，阴性 对照探针选取点样液。检测系统和平行对照的33对探针如表1所列
表1检测系统和平行对照氨基修饰探针
探针名称 SEQ ID NO.探针序列(5， 一3')
3394T1ATTCTAGGCTATATACAACT
3394C2ATTCTAGGCCATATACAAC
3460G3GTTTTATGGCGTCAGCG
3460A4AGTTTTATGGTGTCAGCGA
3635G5ACCTCTAGCCTAGCC
3635A6ACCTCTAACCTAGCC
3733G7TCTCATATGAAGTCACC
3733A8TCTCATATAAAGTCACC
4136A9TCGGGGGTATGCTGT
4136G10TCGGGGGCATGCTG
4160T11GGTGTATGAGTTGGTC
4160C12GGTGTATGGGTTGGT
4171C13TTTTTCATAGGAGGTG
4171A14TTTTTCATATGAGGTG
4216T15TGGAGACATATCATATAAG
4216C16TGGAGACATGTCATATAAG
4435A17TTCGGGGTATGGGC
4435G18TTCGGGGCATGGGC
4640C19GCTGCCATCAAGTATT
4640A20GCTGCCATAAAGTATT4917 A21CCTCACTAAACGTAAG
4917 G22CCTCACTAGACGTAAG
5244 G23GCTAACCGGCTT
5244 A24GCTAACCAGCTTTTT
7444 G25CTTTTTTGTCTAGATTT
7444 A26CTTTGTTTAGATTT
9738 G27CCTACAAGCCTCAGA
9738 T28CCTACAATCCTCAGA
9804 G29TTTTGTAGCCACAGG
9804 A30TTTTGTAACCACAGG
10663 T31CGGCAAAGACTAGTAT
10663 C32CGGCAAAGGCTAGTA
11696 G33TGAGAATGACTGCGC
11696 A34TGAGAATGATTGCGC
11719 G35GATGTAAGCCCGTGG
11719 A36GATGTAAGTCCGTGG
11778 G37TATGATGCGACTGTG
11778 A38TTATGATGTGACTGTG
13708 G39AACGCCTGGCAGCC
13708 A40AACGCCTGACAGCC
13730 G41TCGCAGGATTTCTCA
13730 A42TCGCAGAATTTCTCA
14459 G43TACTACAGCGATGGC
14459 A44TACTACAGTGATGGC
14482 C45GGAATGATGGTTGTCT
14482 A46GGAATGATTGTTGTCT
14482 G47GGAATGATCGTTGTC T14484 T48GGGAATGATGGTTGT
14484 C49GGGAATGGTGGTTG
1114495A50AATTTATTTAGGGGGA
14495G51AATTTATTCAGGGGGA
14498T52TTTAATTTATTTAGGGG
14498C53TTTAATTTGTTTAGGGG
14568C54TGTTAGCGGTGTGGT
14568T55TGTTAGCAGTGTGGT
14596A56CCTTCTCCTATTTATGGG
14596T57CCTTCTCCTATATATGGG
14693A58GTCGTGGTTGTAGTC
14693G59GTCGTGGCTGTAGTC
15257G60ACTCAGTAGACAGTCCC
15257A61ACTCAGTAAACAGTCCC
15812G62TAGCATCCGTACTATAC
15812A63TAGCATCCATACTATAC
15951A64TTCCAAGGACAAATC
15951G65TTCCAAGGGCAAATC
(2)芯片的制备
点样液为Micro-Spotting Solution (2X)，购自TeleChem Internation公司，室 温保存。
探针由Takara公司负责合成，用去离子水将探针稀释，并与点样液等体积混合，使探 针终浓度为12.5uM，通过Cartesian Tech. ， PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰 的载玻片表面，检测系统和平行对照的每个探针平行点3个点，置于70%的相对湿度、室 温条件下48-72小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4'C保存，即 制成了检测Leber氏遗传性视神经病变32种相关突变的基因芯片，芯片点样布阵图见图1。
实施例2 样本的突变检测 (1)样本的制备、标记和处理 用Qiagen公司DNA抽提试剂盒提取Leber氏遗传性视神经病变患者或疑似患者样本
12DNA，备用。
样本的PCR扩增和标记处理在同一热循环下，通过三组多重PCR(将序列为ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分别作为三组多重PCR的引物)来扩增11 条靶基因，这11条靶基因涵盖与Leber氏遗传性视神经病变相关的32个rnt潔A突变位点 和11719G〉A多态性位点。在25ul PCR反应体系中(扩增体系包括2. 5 ul 10*PCR buffer, 各200 uM的dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP， 1. 5mM MgCl" 1. 5U DNA TagE (Takara),和介于 0.05-0. 5 uM之间不等的引物，每个反应中加入100 ng样本DNA，通过以下热循环过程制 备11条荧光标记的样本DNA目的片段首先在94。C变性5min，以94。C， 35s， 61°C, 55s ， 72°C， 90s循环35次，最后在72。C延伸10min。上述PCR引物由Takara公司合成，其中， 每对正向引物和反向引物中至少有一条引物的5'端加cy5荧光分子标记，引物序列如表2 所列。
表2 PCR引物
引物名称 SEQ ID NO.引物序列(5， 一3')
PI--F66CAG CCGCTATTA AAGGTTCGT
PI--R67TGG CAGGAGTAA TCAGAGGTG
P2--F68TCT TCAATCAGC CACATAGCC
P2--R69TCT CGGTAAATA AGGGGTCGT
P3--F70ACC AATCCTACC TCCATCG
PS--R71CCA AGGAGTGAG CCGAAGT
PI-F72TAG AAGAACCCT CCATAAACCTG
P4--R73TA GCG TCT TGT AGA CCT ACT TGCP5--F74ACA CCCACTCCC TCTTAGCC
P5--R75GTT GGGACGATT AGTTTTAGCA
P6--F76CGT CCTTGCCCT ATTACTATCC
P6--R77TTG GGTGCTAAT GGTGGAGT
P7--F78GAC CCTACTTCT AACCTCCCTG
P7--R79CAC CTCAACTGC CTGCTATG
P8--F80GCA CCACGACCC TACTACTATC
13P8-R 81 GGG ATG ATG AGG CTA TTG TTT
P9-F 82 CGA AAC CAA ATA ATT CAA GCA C
P9-R 83 GAA AGT TGA GCC AAT AAT GAC G
P10-F 84 CAA ACG CCT GAG CCC TAT C
PIO-R 85 GAA TCC GAG TAT GTT GGA GAA AT
Pll-F 86 CAT CGG CAT TAT CCT CCT G
Pll-R 87 GTT GTT TGA TCC CGT TTC G
注F表示正向引物，R表示反向引物。
从三组多重PCR扩增产物中分别取10yl，与30ul杂交液混匀，作为芯片杂交用靶基因。
(2)杂交反应和信号检测 取实施例2步骤(l)的芯片杂交用靶基因15ul， 95。C变性10min，迅速冰浴3-5 min， 取lOul变性后的芯片杂交靶基因滴于实施例1制备的检测Leber氏遗传性视神经病变32 种相关突变的基因芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于37。C湿盒中杂交45min，然后 30。C于洗液l (2XSSC， 0. P/。SDS)中荡洗10min，再于洗液2 (0.2XSSC， 0.1°/。SDS)中荡洗 5min，氮气吹干。用激光共聚集扫描仪(GenePix4000B，Axon Instruments, Inc.)在635咖处 扫描前述洗脱并干燥后的杂交芯片，扫描强度设为700 (最大为920);通过圈点过滤背景 信号，提取各点平均荧光信号强度值。配合其配套软件分析，最终获得芯片检测结果。以 诊断比值(野生型探针信号强度平均值与相应位点突变型探针信号强度平均值的比值)作 为分析突变是否存在的标准，如果诊断比值在3以上为野生型，在0.3以下为均质性突变， 介于0.3和3之间为异质性突变。(比值衡量标准参考Du W， Marsac C， Kruschina M, Ortigao F， Florentz C. Functionalized self-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations. Anal Biochem， 2003， 322(1): 14-25获得)
用实施例1制备的检测Leber氏遗传性视神经病变32种相关突变的基因芯片分别对20 例健康对照和12例Leber氏遗传性视神经病变患者按上述方法进行检测各健康对照均未 检测到32种相关突变；12例患孝中8例检测到11W8G〉A均质性突变，1例检测到11"8G〉A 异质性突变，1例同时检测到3460G〉A和3394T〉C均质性突变，1例检测到14484T>C均质 性突变；所有健康对照和患者均检测到11719G〉A单核苷酸多态性。芯片检测结果与DNA测 序结果完全吻合。
144例含不同突变体患者样本芯片扫描图示例和相应突变位点DNA测序结果如图2-5所 示，对应位点的芯片诊断比值如表3所列
表3突变诊断比值
mtDNA突变位点Pl (w/m)P2(w/m)P3(w/m)P4(w/m)
3394T>C4. 23. 4。.763. 2
3460G〉A3. 74. 3。J3. 5
3635G>A18341114
3733G>A66452455
4136A>G12145. 613
4160T〉C8. 57. 75.47. 5
4171C>A33361724
4216T〉C9.5117.49.2
4435A〉G9. 5265. 67. 7
4640OA14234. 09. 3
4917A〉G13186. 148
5244G〉A49482048
7444G〉A11104.332
9738G〉T62331964
9804G>A614813147
10663T>C8.98.74,411
11696G〉A17161029
11719G〉A0. 060. 040. 120. 06
11778G〉Aft "7. 77. 513
13708G〉A9. 1101315
13730G〉A786629132
14459G〉A28191647
144820A63482311
144820G13883339. 5
14484T〉C138.47.3。.似
14495A〉G4. 47.73.913
14498T>C3. 58.33.210
14568C〉T463915156
14596A〉T12141619
151柳3A〉G 21 24 9.7 128
15257G>A 64 34 22 394
15812G>A 26 26 13 94
15951A>G 5.9 6.4 5.0 20
w/m指野生型探针荧光信号强度平均值与相应位点突变。 实施例3试剂盒的组装
按实施例1制备基因芯片，将实施例2记载的SEQ ID NO. 66 87的PCR引物分装，与制得 的基因芯片、杂交液、核酸杂交洗液组配后包装制得试剂盒。序列表
<110〉安徽医科大学中国科学院上海微系统与信息技术研究所
<120〉 Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用
<130> PCNWX081297
<160> 87
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211〉 20
〈212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
<223>探针
<■> 1
attctaggct atatacaact 20
<210〉 2
<211> 19
<212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
〈223>探针
〈400> 2
attctaggcc atatacaac 19
<210> 3
〈211〉 17
<212> DNA
<213> artificial sequence〈220〉
〈223〉 探针 〈400> 3
gttttatggc gtcagcg 17
<210> 4
〈211〉 19
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探针
〈400> 4
agttttatgg tgtcagcga 18
〈210〉 5
〈211〉 15
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉探针
<400> 5
acctctagcc tagcc 15
〈210〉 6
〈211〉 15
<212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 6
18tagcc 15
〈210〉 7
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探针
〈400> 7
tctcatatga agtcacc 17
〈210〉 8
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探针
〈400〉 8
tctcatataa agtcacc 17
〈210〉 9
<211> 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 9
tcgggggtat gctgt 15
〈210〉 10〈211> 14
〈212> DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400> 10
tcgggggcat gctg 14
<210〉 11
<211> 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉 探针
〈400〉 11 ggtgtatgag ttggtc
〈210〉 12
〈211〉 15
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探针
〈400〉 12 ggtgtatggg ttggt
<210> 13
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence<220>
<223> 探针 <400〉 13
tttttcatag gaggtg 16
〈210> 14
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 14
tttttcatat gaggtg 16
〈210> 15
〈211> 19
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉探针
<400> 15
tggagacata tcatataag 19
〈210〉 16
〈211〉 19
〈212> 腿
<213> artificial sequence 〈220>
<223〉 探针
〈400〉 16
21tggagacatg tcatataag 19
<210〉 17
<211〉 14
〈212〉 ■
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探针
〈400〉 17
ttcggggtat gggc 14
〈210〉 18
〈211〉 14
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
<400〉 18
ttcggggcat gggc 14
〈210〉 19
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
<400> 19
gctgccatca agtatt 16
〈210〉 20
22<formula>formula see original document page 23</formula>〈220>
〈223> 探针 〈400〉 23
gctaaccggc ttttt 15
<210〉 24
〈211> 15
〈212〉 廳
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
〈400〉 24
gctaaccagc ttttt 15
〈210〉 25
〈211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223>探针
〈400> 25
cttttttgtc tagattt 17
〈210〉 26
<211> 17
<212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220>
<223〉 探针
〈400〉 26
24cttttttgtt tagattt 17
〈210> 27
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
〈400〉 27
cctacaagcc tcaga 15
〈210〉 28
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220>
〈223>探针
<400〉 28
cctacaatcc tcaga 15
〈210〉 29
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
<223>探针
〈400〉 29
ttttgtagcc acagg 15
〈210〉 30
25<211> 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探针
〈400〉 30
ttttgtaacc acagg 15
〈210〉 31
〈211> 16
<212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探针
〈400〉 31 cggcaaagac tagtat
〈210> 32
<211〉 15
<212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
< 32 cggcaaaggc tagta
<210〉 33
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence
26<220〉
〈223> 探针
<400〉 33 tgagaatgac tgcgc
<210〉 34
〈211> 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400> 34 tgagaatgat tgcgc
〈210〉 35
<211> 15
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220>
<223〉 探针
<400> 35 gatgtaagcc cgtgg
<210> 36
〈211〉 15
<212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220>
<223〉 探针
<400> 36
15
15
15
27〈210> 37
<211> 15
〈212> 纖
<213> artificial sequence <220〉
<223> 探针
<400> 37 tatgatgcga ctgtg
〈210〉 38
〈211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 38 ttatgatgtg actgtg
〈210〉 39
<211> 14
〈212> 廳
〈213〉 artificial sequence <220>
<223> 探针
〈400〉 39 aacgcctggc agcc
〈210〉 40
15
15
16
14
28<211> 14
<212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220>
〈223〉 探针
<400> 40
aacgcctgac agcc 14
〈210〉 41
〈211〉 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探针
〈400〉 41
tcgcaggatt tctca 15
〈210〉 42
<211〉 15
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探针
〈400> 42
tcgcagaatt tctca 15
〈210〉 43
〈211> 15
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence<220〉
〈223〉 探针 〈400〉 43
tactacagcg atggc 15
〈210〉 44
〈211> 15
<212> ■
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
〈400〉 44
tactacagtg atggc 15
〈210〉 45
〈211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223>探针
〈400〉 45
ggaatgatgg ttgtct 16
<210> 46
〈211〉 16
〈212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223> 探针
〈400〉 46ggaatgattg ttgtct
〈210〉 47
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探针
〈400〉 47 ggaatgatcg ttgtct
〈210〉 48
〈211〉 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
<223〉探针
〈400〉 48 gggaatgatg gttgt
〈210> 49
〈211〉 14
<212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
〈400〉 49 gggaatggtg gttg
〈210〉 50
16
16
15
14
31<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400> 50
aatttattta ggggga 16
<210〉 51
<211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 探针
〈400〉 51 aatttattca ggggga
〈210> 52
<211〉 17
<212> 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
<400〉 52
tttaatttat ttagggg
<210> 53 <211> 17 〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence<220〉
〈223〉 探针 〈400〉 53
tttaatttgt ttagggg 17
〈210〉 54
〈211〉 15
〈212> 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 54
tgttagcggt gtggt 15
〈210〉 55
〈211〉 15
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉探针
〈400〉 55
tgttagcagt gtggt 15
〈210〉 56
〈211〉 19
〈212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
<223〉 探针
<400> 56
33<formula>formula see original document page 34</formula><211> 17
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 60
actcagtaga cagtccc 17
<210> 61
<211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence <220>
<223〉 探针
〈400〉 61
actcagtaaa cagtccc
〈210〉 62
<211〉 17
<212> DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223> 探针
<400> 62
tagcatccgt actatac
〈210〉 63
<211> 17
〈212〉 ■
<213> artificial sequence〈220〉 ' 〈223〉 探针 〈400〉 63
tagcatccat actatac 17
〈210〉 64
〈211> 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探针
〈400〉 64 ttccaaggac aaatc
〈210〉 65
〈211〉 15
<212> 腾
〈213> artificial sequence <220〉
<223> 探针
〈400〉 65 ttccaagggc aaatc
〈210〉 66
<211〉 21
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 66
36cagccgctat taaaggttcg t 21
〈210〉 67
<211〉 21
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220>
〈223〉 引物
<400> 67
tggcaggagt aatc卿ggt g 21
〈210〉 68
〈211> 21
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 68
tcttcaatca gccacatagc c 21
〈210〉 69
〈211〉 21
〈212〉 廳
<213> artificial sequence <220〉
<223> 引物
〈400〉 69
tctcggtaaa taaggggtcg t 21
<210〉 70〈211〉 19
〈212〉 腿
<213> artificial sequence <220>
〈223〉 引物
〈400〉 70
accaatccta cctccatcg 19
〈210〉 71
〈211〉 19
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223> 引物
〈400〉 71
ccaaggagtg agccgaagt
〈210〉 72
<211〉 23
〈212〉 DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 72
tagaagaacc ctccataaac ctg
<210〉 73
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
38〈220〉
<223〉 引物 〈400> 73
tagcgtcttg tagacctact tgc 23
〈210〉 74
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400> 74
acacccactc cctcttagcc 20
〈210〉 75
〈211> 22
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 引物
〈400〉 75
gttgggacga ttagttttag ca 22
〈210〉 76
〈211〉 22
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
<400〉 76
39cgtccttgcc ctattactat cc 22
〈210〉 77
〈211> 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉 引物
〈400〉 77
ttgggtgcta atggtggagt 20
〈210〉 78
〈211> 22
〈212〉 画
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 78
gaccctactt ctaacctccc tg 22
〈210〉 79
〈211〉 20
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223〉 引物
<400> 79
cacctcaact gcctgctatg 20
〈210〉 80
40说明书第38/40页
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 80
gcaccacgac cctactacta tc 22
〈210〉 81
<211〉 21
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 81
gggatgatga ggctattgtt t 21
<210〉 82
〈211〉 22
<212> DNA
<213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 82
cgaaaccaaa taattcaagc ac 22
〈210〉 83
〈211〉 22
〈212〉 画
<213> artificial sequence
41<formula>formula see original document page 42</formula>catcggcatt atcctcctg 19
<210> 87
〈211〉 19
<212> DNA
<213〉 artificial sequence <220>
<223> 引物
〈400〉 87
gttgtttgat cccgtttcg 19
权利要求
1. 一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片，其特征在于，在基因芯片载体表面点阵固定有与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针和mtDNA 11719G>A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针。
2. 如权利要求1所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片， 其特征在于，所述与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷 酸探针和mtDNA 11719G〉A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针选自序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探针中的一个或多个，且所述基因芯片上还固定有阴性对照及 阳性对照，其中，阳性对照为所选的各寡核苷酸探针的等量混合液。
3. 如权利要求1所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片， 其特征在于，所述基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸 探针。
4. 如权利要求1-3中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集 成检测基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针的5'端有氨基修饰基团，且探针5' 端有一段15聚的Poly T。
5. 如权利要求1-4中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集 成检测基因芯片的制备方法，包括下列步骤将选自序列为SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探针5，端加上一段15聚的Poly T，并对 5'端进行氨基修饰，用去离子水将各探针分别稀释，并分别与点样液等体积混合，获 得终浓度为12. 5 50 uM的寡核苷酸探针溶液，将寡核苷酸探针溶液与阴性对照和阳性 对照一起点阵于载玻片表面并固定。
6. 如权利要求1-4中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集 成检测基因芯片的使用方法，包括下列步骤a) 收集患者外周血，抽取样本DNA;b) 样本DNA的PCR扩增和标记以样本DNA为模板，PCR扩增并标记待测的突变相关 序列；c) 采用如权利要求1-4中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突 变位点集成检测基因芯片于样本PCR产物变性后进行杂交检测将样本PCR扩增产 物等体积混合后，与适量体积杂交液混合，将与杂交液混匀后的PCR产物变性，滴 在芯片的点阵区进行杂交，杂交后用洗液洗涤，再检测标记信号的强度。
7. 如权利要求6所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的 使用方法，其特征在于，所述步骤b中PCR扩增引物选自序列为SEQ ID NO. 66 87的 核苷酸序列中的一个或多个，且每对正反引物中至少有一个被标记。
8. 如权利要求7所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的 使用方法，其特征在于，所述步骤b的PCR扩增为多重PCR扩增将序列为IDN0.66 71、 ID N0.72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分别作为三组多重PCR的引物，在同 一热循环下以样本DNA为模板进行PCR扩增。
9. 如权利要求1-4中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集 成检测基因芯片在制备Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试剂盒中 的应用。
10. —种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试剂盒，包括权利要求1_4 中任一权利要求所述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯 片，和Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物。
全文摘要
本发明涉及基因芯片，公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用，该基因芯片的载体表面点阵固定有与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针和mtDNA 11719G＞A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针。本发明的基因芯片具有省时、费用低廉和操作简便等优点，仅需1次PCR扩增和1次杂交反应，即可特异性检测临床样本中32种与Leber氏遗传性视神经病变相关的突变位点。适用于Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断。
文档编号C12Q1/68GK101497925SQ20081020477
公开日2009年8月5日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者张学军, 曹慧敏, 杜卫东, 赵建龙, 金庆辉, 刚 陈 申请人:安徽医科大学;中国科学院上海微系统与信息技术研究所