一种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及到一种芸薹属植物细胞质类型的分 子检测试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 杂种优势利用是目前国内外油菜增产的主要方法。目前，油菜杂种优势利用的主 要途径主要有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和、化学杀雄和转基因等方法 (傅廷栋，2000 ;官春云等，2012)。细胞质雄性不育作为杂种优势利用的主要途径之一，在 油菜生产上得到了很大的应用。目前生产上使用的品种中60%以上是由细胞质雄性不育 育成的杂交种。P〇lCMS不育系统在我国三系和温敏型两系法杂交制种中应用很广，ogura CMS(简写oguCMS)在国外的油菜育种中应用较多（傅廷栋，2000)。在油菜种子生产过程 中细胞质雄性不育的利用可以降低育种成本，杂种优势强，育种程序简单易行。
[0003] 随着油菜杂交育种的研究，在油菜中发现了很多不同的胞质类型，包括同源胞质 和异源胞质。其中同源胞质有，P〇lCMS胞质、nap胞质、cam胞质、ole胞质（傅廷栋，2000); 异源胞质有：〇guCMS胞质、hauCMS胞质、TourCMS胞质、kosCMS胞质，NcaCMS胞质、 NsaCMS胞质等（傅廷栋，2000;Huetal, 2002 ;万正杰等，2006;Weietal, 2007;Wanet al, 2008)。随着测序技术的发展，油菜中polCMS胞质、nap胞质、cam胞质、ole胞质、ogu CMS胞质、hauCMS胞质的线粒体基因组都已经测序完成（Handa，2003;Changetal，20011; Chenetal, 2011;Tanakaetal, 2012;Wangetal, 2012;Hengetal, 2014)。为了能够 在分子水平更有效的将这些胞质区分开来，通过线粒体基因组对比，开发了不同胞质特异 的线粒体DNA分子标记，用以快速准确地鉴定甘蓝型油菜不同胞质类型。这些胞质特异的 标记不仅可以用来指导甘蓝型油菜胞质分类分析、指导细胞质雄性不育系和保持系以及恢 复系的选育，而且也可以用于区分新型胞质类型、以及细胞质雄性不育系纯度鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒，该试剂 盒包括引物MSS-2、MSS-4、MSS-6、MSS-7、MSS-8、MSS-9、MSS-13、MSS-14、MSS-21、MSS-26、 MSS-6UMSS-67中的1种或2种或3种或4种或5种或6种或多种的组合。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了一种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒 的应用，该试剂盒在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中用于胞质类型的鉴定，区分polCMS胞质、 nap胞质、cam胞质、ole胞质、oguCMS胞质、hauCMS胞质的胞质类型，用于鉴定不同的胞 质类型和不育系纯度，以加快芸薹属植物不同胞质类型的区分和新胞质的发现以及新品种 的培育，特别适用于甘蓝型油菜细胞质类型的分子检测。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] 本发明的发明思路为：
[0008] 根据已经测序的polCMS、nap、oguCMS和hauCMS等4种甘蓝型油菜胞质及甘蓝 型油菜两个祖先种白菜型油菜cam胞质与甘蓝ole胞质的线粒体基因组，通过序列对比提 取出90条不同胞质类型特异的线粒体基因组序列（mitotypespecificsequences。MSSs) (图I)，基于这些特异的线粒体基因组序列序列设计引物，开发得到一套用于芸薹属植物 胞质区分的SCAR分子标记组合，共包括12对SCAR引物。12对SCAR标记的名称为：MSS-2、 MSS-4、MSS-6、MSS-7、MSS-8、MSS-9、MSS-13、MSS-14、MSS-21、MSS-26、MSS-61 和MSS-67。 利用这12对SCAR标记，可从polCMS、nap、oguCMS、hauCMS、cam、ole等6种不同胞质的 甘蓝型油菜中分离出特异序列片段，扩增出的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1~N0:12所 不。
[0009] -种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒，该试剂盒包括表1所示引物对中 的1种或2种或3种或4种或5种或6种或多种的组合。
[0010] 表1用于芸薹属植物细胞质类型分子检测的SCAR标记引物序列
[0013] 所述的芸薹属植物优选：甘蓝型油菜，白菜型油菜，甘蓝。
[0014] -种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒的应用，包括在鉴定材料polCMS 胞质、nap胞质、cam胞质、ole胞质、oguCMS胞质或hauCMS胞质中的应用；包括在胞质分 类上的应用；甘蓝型油菜细胞质雄性不育系、保持系和恢复系选育上的应用和甘蓝型油菜 胞质雄性不育系纯度鉴定上的应用等。
[0015] 应用过程包括，利用试剂盒中的引物对待鉴定材料的DNA进行PCR，用以判定该材 料polCMS胞质、nap胞质、cam胞质、ole胞质、oguCMS胞质或hauCMS胞质的胞质类型， 判定方式如下：
[0016] MSS-2在nap和oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0017] MSS-4在nap和oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0018] MSS-6在cam和poICMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0019] MSS-7仅在ole胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0020] MSS-8仅在polCMS胞质类型的材料中可扩增出条带
[0021] MSS-9仅在polCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0022] MSS-13仅在oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0023] MSS-14仅在oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带
[0024] MSS-21仅在oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0025] MSS-26仅在hauCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0026] MSS-61在nap、cam、ole、polCMS和oguCMS胞质类型的材料中可扩增出条带；
[0027] MSS-67在nap胞质、polCMS和oguCMS胞质材料中可扩增出条带。
[0028] 其余的的结果则为其他类型胞质。
[0029] 本领域技术人员可根据具体需要鉴定材料的胞质类型，有效选择上述的引物或引 物组合进行鉴定。
[0030] 用以上标记可以快速的鉴定未知芸薹属植物材料的胞质类型。
[0031] 更详细的技术方案如《【具体实施方式】》所述。
[0032] 本发明的积极效果
[0033] 1?基于已经测序的polCMS、nap、cam、ole、oguCMS和hauCMS等6种不同甘蓝 型油菜及其祖先种白菜型油菜与甘蓝的胞质特异线粒体基因组序列，设计开发得到用于甘 蓝型油菜胞质区分、鉴别的12对SCAR标记组合。
[0034] 2.本发明提供的12对特异MSS相关的SCAR标记组合可用于甘蓝型油菜胞质分 类、甘蓝型油菜细胞质雄性不育系、保持系和恢复系选育，以及甘蓝型油菜胞质雄性不育系 纯度鉴定。
【附图说明】
[0035] 图1为6种不同胞质类型的甘蓝型油菜中胞质特异的MSS序列的可视化图。
[0036] 图2实施例1中的12对引物对甘蓝型油菜中6种不同胞质类型PCR扩增情况示 意图。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合具体实施例子，进一步阐明本发明。这些实施例子仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例子中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如《分子克隆：实验室指南》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory, 1989)中所述 的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。本发明所述实验材料，如未特别说 明，均为市售。
[0038] 实施例1 :
[0039] 芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒引物的开发及验证：
[0040] 1. 1不同胞质类型特异标记的开发
[0041] 1)首先在GeneBank、EMBL和DDBJ三大数据库中将已经测序完成的polCMS胞 质线粒体基因组序列（序列号：FR715249)，oguCMS胞质线粒体基因组序列（序列号： AB694744)，hauCMS胞质线粒体基因组序列（序列号：KF736092)，nap胞质线粒体基因组 序列（序列号：AP006444)，cam胞质线粒体基因组序列（序列号：JF920285)，ole胞质线粒 体基因组序列（序列号：JF920286)提取出来。
[0042] 2)利用ProgressiveMauve和BLASTN本地化软件对这6个线粒体基因组的序列 进行对比分析（e-value:le_5)，将这六种胞质类型的线粒体基因组中共线性的以及不同 胞质类型特异的序列位点信息进行分析。根据序列位点信息将各个胞质特异的线粒体基因 组序列进行提取。从这六种不同的胞质线粒体中，总共获得90条不同胞质类型特异的序列 MSSs(MitotypeSpecisicSequences) :5 条nap胞质特异的序列（从MSSl到MSS5) ;1 条 ole胞质特异的序列（MSS7) ;2条polCMS胞质特异的序列（MSS8和MSS9) ;13条oguCMS 胞质特异的序列（从MSSlO到