序列特异设计化qMan探针及引物一对，当遇到Bim基 因缺失相应变体特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全结合，PCR扩增时，巧光报告基团 因酶解分离而发出巧光，能够实时检测相应巧光信号的积累，从而实现检测Bim基因缺失的 目的。
[0012] 首先，对于Bim基因缺失巧光定量PCR检测引物的设计，现有技术中巧光定量PCR引 物的设计往往需要考虑众多因素，包括:采用保守区序列进行引物设计、引物自身或引物之 间不能形成互补、扩增产物避免形成二级结构、G+C含量的控制(40%~60%)、引物长度的 控制(通常在17-25碱基之间）、巧光定量PCR扩增产物长度限制(80-150bp，最长300bp)等。
[0013] 发明人设计引物过程当中，在满足上述基本条件的基础上，进一步通过设计提升 引物及探针的特异性和扩增效率。通常，引物越长，其特异性越高(每增加一个核巧酸引物 特异性提高4倍），然而由于引物越长，它退火结合到祀DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定 双链模板的速率越小，即扩增效率越低。发明人经过多组引物对比筛选，最终筛选到本发明 所述上游引物和下游引物，其同时具备较高的特异性和良好的扩增效率;此外，发明人设计 下游引物为Bim缺失序列（2903bp)上游化P和缺失序列（2903bp)下游20bp序列的组合，其有 效的避免了单纯采用Bim缺失序列下游基因组序列作为引物扩增时基因组碎片或mRNA造成 干扰的问题，同时下游引物中仅包括Bim缺失序列（2903bp)上游化P碱基，不会产生化P碱基 配对引起的扩增，极大的提高了巧光定量PCR扩增的特异性和准确性。
[0014] 尤其是，临床样本多样化，尤其对于样本组织蜡块，对引物和探针的特异性和适用 性要求较高。本发明所述检测引物及探针采用巧光定量PCR扩增，具有极高的特异性和准确 性。
[001引本发明所获得的上游引物时161.1°(：、6+(：含量为45.8%，么6为-41.化。31/11101，下 游引物I'm 60.7 °C、G+C 含量为44.0%，A G为-43.化 cal/mol。
[0016] 其次，对于Bim基因缺失巧光定量PCR检测探针的设计，为了进一步增加巧光定量 PCR扩增的特异性，本发明采用的^qMan-MGB探针，与传统的^qMan-TAMRA探针相比较，MGB 探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；同时提 高信噪比，与特异性和引物配合使用，进一步提高检测的准确性和特异性，使实验结果更精 确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性 大大提高等优势。
[0017] 同时发明人对于巧光报告基团也进行了选择性优化，现有的巧光报告基团包括6-簇基巧光素（G-carboxyfluorescein ,FAM )、六氯-6-甲基巧光素（Hexachloro-G-methylfluorescein，肥X)、VIC巧光染料、四氯-6-簇基巧光素 （te trachloro-G- carboxyfluoresceinJET)、簇基-X-罗丹明 Karbo巧-x-;rhodamine，ROX)、6-簇基四甲基罗 丹明（G-carbo巧tehamethylrhodamine,TAMRA)、横酷罗丹明（Sulforhodamine 101 ,Texas Red)、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基巧光素班巧酷亚胺醋（6-〔3扣〇义7-4'，5'-dichlor〇-2'，7'-dimethoxyfluorescein，J0E)、花菁3 (cyanineS，CyS )、花菁3.5 ((：yanine3.5，切3.5)、花菁5(巧anineS，切5)和花菁5.5((：yanine5.5，切5.5)等多种，发明 人通过对探针5 '端报告基团的选择，发现5 '端标记FAM巧光报告基团与MGB型探针，其泽灭 过程中巧光共振能量转移更好，巧光定量PCR过程中，巧光曲线效果更明显。
[0018] 本发明提供的两端都标有巧光发光基团的特异性巧光探针，在探针完整时，两基 团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的巧光因为巧光共振能量转移(FRET)而 被3'端泽灭基团泽灭，所W体系中没有巧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其 结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相 结合的探针，其5 ' -3 '外切酶活性就会将探针切断，巧光报告基团远离巧光泽灭基团，运样 就破坏了两巧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的巧光就可W被内置在定量检测仪 内的巧光计检测到。PCR每经过一个循环，巧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增 长的过程，巧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单 的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
[0019] 本发明的另一目的包括上述引物及探针在制备针对Bim基因缺失突变检测的试剂 盒、忍片或其他检测试剂中的应用。
[0020] 本发明的另一目的是提供一种Bim基因缺失巧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包 括上述检测引物及探针。
[0021] 优选的，本发明所述试剂盒进一步包括阳性对照样品A:包含所检测Bim基因缺失 的基因组片断DNA质粒。
[002引更优选的，本发明提供一种快速、准确检测Bim基因缺失的巧光定量PCR试剂盒，该 试剂盒包括巧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、巧光定量反应液A、阳性对照样品A;
[0023] 巧光定量反应液A:检测的是Bim基因缺失，反应体系包括:检测Bim基因缺失的引 物和探针序列：正向引物序列为化rward Primer: 5 ' -CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3 '、反向 引物序列为Reverse Primer : 5 ' -ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3 '、巧光探针序列为 Taqman-Probe: 5 ' -FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3 '，巧光探针的5 ' 端标记FAM巧光报告基 团，3 '端标记MGB巧光泽灭基团；
[0024] 阳性对照样品A:包含所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒。
[002引所检测Bim基因缺失的基因组片断DNA质粒
[0026] 本发明的另一目的是提供一种Bim基因缺失突变的检测方法，包括：
[0027] 从样品组织中提取基因组DNA;
[0028] 利用上述引物及探针进行巧光定量PCR反应；
[0029] 根据巧光定量PCR扩增曲线检测Bim基因缺失突变。
[0030] 优选的，样品组织为临床组织蜡块。
[0031 ]优选的，巧光定量PCR的条件为:反应体系为25化，正、反引物各0.化L，探针各0.化 L，样品模板DNA 2化，2XI^qman universal PCR Master Mix 1 扣L,d地2〇 7.4化，PCR反应 条件:95 °C预变性30秒;并按95 °C 5秒，58 °C 33秒，扩增反应45个循环。
[0032] 需要说明的是，本发明所述检测方法并不能直接诊断个体的患病情况，不属于疾 病的诊断方法。
[0033] 本发明具有W下有益效果：
[0034] 与现有检测方法比较，本技术采用巧光定量PCR技术检测Bim基因缺失具有W下优 势：
[0035] 1.检测灵敏度高，特异性好:本发明分别针对Bim基因保守序列设计了特异性引物 和巧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低;本发明适用于临床组织样本的检测，甚 至对于组织蜡块都可W有效的检测。
[0036] 2.线性关系好，可定量检测，由于巧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性 关系，通过巧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；
[0037] 3.操作简单，自动化程度高，FQ-PCR技术对PCR产物的扩