一种枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂和应用
一种枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂和应用
【专利摘要】本发明公开了属于生物防治领域的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM?3，该菌株己于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6933。本发明还公开了利用YNM?3制备的微生物菌剂，以及该微生物菌剂的制备方法。本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM?3对玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期茎基部防效达到82.9％，田间成株期防效达88.31％，为玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治提供了一种新途径；其次，本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；此外，本发明微生物菌剂无污染，无公害，对环境友好。CGMCC No.693320121204
【专利说明】
一种枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物防治领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌，还涉及利用该枯草芽孢 杆菌生产的微生物菌剂、以及该微生物菌剂的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 玉米茎基腐病(Corn stalk rot)又称玉米茎腐病或玉米青枯病，由多种病原菌单 独或复合侵染造成，主要病原菌有禾谷镰刀菌（Fusarium gramincarum)、轮生镰刀菌 (Fusarium.moniliforme)和腐霉菌(Pythium. spp)，不同地区主要病原菌种类不同。病原菌 自玉米苗期至成株期都可从根部侵染，在苗期侵染引起根腐和苗枯，一般在玉米灌浆至乳 熟期开始发病，乳熟末期至蜡熟期为显症高峰。开始在茎基部节间产生纵向不规则褐色病 斑，随后基部皱缩、变软，后期茎内空松腐烂，腐烂自茎基第一节开始向上扩展，可达第二、 三节，甚至第四节，后期极易倒折。典型症状有青枯和黄枯两种类型，青枯型为急性发病，叶 片呈灰绿色自下而上迅速枯死;黄枯为慢性发病型，发病后叶片自下而上逐渐黄枯。感病玉 米根部须根和根毛减少，根表皮松脱，髓部中空，变褐腐烂。近几年，由于气候变化、秸杆还 田、种植密度加大等原因该病的发生有上升趋势，茎基腐病已成为继大斑病、小斑病、弯孢 菌叶斑病等叶斑病之后的又一亟待解决的重要玉米病害。此外，蠕孢菌和丝核菌也是造成 玉米苗期根腐的病原菌。
[0003] 目前，防治玉米茎基腐病和苗期根腐病的主要方法：（1)化学防治。即用化学药剂 进行种子包衣或灌根，由于病原菌在玉米整个生育期都能够侵染植株根系，化学防治存在 防治效果不佳，且长期大量使用对土壤和环境带来污染等缺点。（2)抗病育种。由于抗病基 因难找，培育抗性品种困难。（3)生物防治。生物防治因具有专化性强、持久性好、以及环境 友好等特点，是解决玉米茎基腐病和苗期根腐病的有效方法。目前筛选出的对玉米茎基腐 病有生防作用的生防菌有哈次木霉、鞍形小球壳菌、粉红粘帚霉菌、粉红单端孢菌、简单节 葡孢菌、棘腐霉菌、外担菌和绿木霉等。如已公开对玉米茎腐病有防治作用的绿木霉（陈捷 等.植物保护，1994(3): 6-8)和解淀粉芽孢杆菌（崔文艳等.玉米科学，2015,23(5):153-158)等。
[0004] 枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)是目前应用比较广泛的生防细菌。其分布范 围广，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物表面普遍存在。同时还是植物体内 常见的内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境，由于其生长速度快、营养需求简单、在植物表 面易于定殖、生长和繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌的工艺简单、制剂稳定、使用方便、储存期 长，因此是一种理想的生防细菌。因此，如果筛选出对玉米茎基腐病菌和苗期根腐病菌具有 抑制作用的枯草芽孢杆菌，将为防治玉米茎基腐病提供有效途径。
[0005] 经检索，没有发现枯草芽孢杆菌用于防治玉米茎基腐病的报道。
【发明内容】
[0006] 针对目前玉米茎基腐病抗病品种缺少，化学农药防治效果差、且存在污染环境的 问题，本发明目的在于提供一种枯草芽孢杆菌。该菌株对玉米茎基腐病和苗期根腐病防治 效果好。
[0007] 本发明第二目的在于提供利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂。
[0008] 本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0009] 本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0010]本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0011] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0012] 本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3,己于2012年12 月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为:北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.6933。
[0013] 本发明还提供了利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽 孢杆菌菌株YNM-3菌体。
[0014] 上述微生物菌剂，其剂型可以是液体制剂或颗粒剂。
[0015] 上述微生物菌剂的液体制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)菌种活化:将低温保存的YNM-3菌株在LB平板培养基上、在30 °C下活化，挑取单 菌落在LB斜面培养基上扩繁，备用；
[0017] (2)种子液制备：向LB液体培养基100mL中接种一接种环步骤（1)中活化好的YNM-3 菌株，在30~32°C、转速160~180r/min条件下震荡培养20~30h，得种子液；
[0018] (3)发酵培养：向发酵罐加入混合好的发酵培养基（亦称:玉米粉酵母膏发酵培养 基），按照重量百分比0.5~1%的比例接种步骤⑵所得的种子液，初始pH值用HC1调为6.5 ~7.0,在温度为30~32°C、搅拌速度为160~180r/min、0~8h通气比1:0.4;8~1511通气比 1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养，发酵培养时间为24~72h;
[0019] (4)在步骤(3)中发酵培养12h以后，每隔60分钟从发酵培养液中取样进行镜检，对 视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率;芽孢率达到90 %即停止发酵培养，得发 酵液;所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。
[0020] 上述制备方法步骤(2)或(3)中所述的发酵培养时间为24~48h。
[0021 ]上述制备方法步骤(2)或(3)中所述的搅拌速度为170r/min。
[0022] 上述制备方法步骤（1)中所述的的LB平板培养基和LB斜面培养基按常规方法制 作。
[0023] 上述制备方法步骤(2)中的LB液体培养基按常规方法制作。
[0024]上述制备方法步骤(3)中所述的发酵培养基组成成分及其重量百分比为:玉米粉1 ~2%，酵母膏0.2~0.5%，黄豆粉 1~2%，Na2HP〇4 0· 1~0.2%，Ca⑶3〇· 1~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，]\%504 0.1~0.3%，順4勵3 0.1~0.2%1^，]\1115040.01~1.03%，其余为水；
[0025] 所述的发酵培养基的制备方法，包括按照重量百分比比例将各成分加入水中，混 合均匀，121°C灭菌30min，降温到30°C备用。
[0026] 上述微生物菌剂的颗粒剂，包括将上述制备方法中制备的发酵液浓缩，与草炭1:1 混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的颗粒剂。
[0027] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米茎基腐病或苗期 根腐病上的应用。
[0028]上述微生物菌剂在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病上的应用。
[0029]上述微生物菌剂的使用方法:玉米播种前用YNM-3发酵液浸种、或在玉米播种时将 YNM-3微生物菌剂的颗粒剂随底肥施入，即可达到控制玉米茎基腐病和苗期根腐病的目的。
[0030] 本发明菌株YNM-3的筛选分离过程：
[0031] YNM-3菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从玉米茎基腐病发病严重的病田 土壤中分离得到的。2003年3月河北省农林科学院植物保护研究所在河北省邯郸永年县采 集小麦田土壤样品，混勾后称取10g放入250mL三角瓶中，加入无菌水100mL，摇床170r/min 条件下振荡30min，静置2h，取上清液lmL加无菌水9mL，即成10mL 10-2倍土壤微生物悬液，继 而将土壤悬液稀释成10' 10' 10-5、10-6倍稀释液，各浓度取200yL微生物悬液涂于LB平板 培养基上，每个浓度3次重复，在30°C恒温培养3d~5d，分别进行细菌分离，挑取单菌落纯 化，入生防菌库保存。之后，以玉米茎基腐病菌和苗期根腐的优势病原菌禾谷镰刀菌 (Fusarium gramincarum)、轮生镜刀菌（F ·moni 1 iforme )、离懦抱菌（Cochliobolus sativas)和立枯丝核菌(Rhizotonia solani)为革El标菌，进行诘抗菌的筛选，从中筛选出一 个对禾谷镰刀菌、轮生镰刀菌、离蠕孢菌和立枯丝核菌都具有明显抑菌效果的菌株，定名为 YNM-3〇
[0032] YNM-3菌株的分类鉴定：
[0033] (1)形态特征鉴定
[0034] 菌体革兰氏阳性菌、杆状。芽孢形态椭圆至柱状，中部产生。PDA平板培养初期菌落 乳白色，规则圆形，边缘不齐整，表面湿润、光滑；中期脓状凸起;后期淡黄色，边缘粗糙，表 面干燥。平板划线呈直线行。LB液体培养基中静置培养，表面能够形成白色菌膜。这些形态 特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著.科学出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌 属形态特征基本一致，初步判断菌株YNM-3属于芽孢杆菌。
[0035] (2)1防rDNA序列测定
[0036]以本发明菌株TOM-3的基因组DNA为模板、以细菌鉴定常用的16S rDNA通用引物 F27和R1492为引物进行扩增;所述的引物为：
[0037] F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（SEQ ID No:l);
[0038] R1492:5，-GGCTACCTTGTTACGACTT-3，（SEQ ID No:2)。
[0039] PCR的反应体系为50μ1，其中模板DNA 2μ1，上下游引物各2yl，PCR Master Mix 25 μL以及无菌水19μ1。扩增反应条件为:94°C预变性3min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延 伸458,35个循环 ;最后72°(：延伸1〇1^11。？0財广增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并将其 送往上海生物工程技术有限公司进行测序，测序结果见序列表SEQ ID N〇:3。将测序所得 Y匪-3的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株Y匪-3与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99%;构建系统发育树(见图1)，菌株YNM-3与芽孢杆菌属聚合到一起，说明 YNM-3属于芽抱杆菌属(Bacillus)。
[0040] (3)YNM-3生理生化指标鉴定
[00411采用法国梅里埃公司生产的API 50CHB试剂条对菌株Y匪-3进行生理生化指标鉴 定，以枯草芽孢杆菌标准菌株1504(中国菌种保藏委员会)作为对照，操作步骤按其说明书 进行。根据试剂条的颜色反应对结果进行判读，（"+"代表阳性，代表阴性），API Lab V3.0软件分析。
[0042] 表1本发明ΥΝΜ-3菌株的生理生化指标鉴定判读结果
[0043]
[0044] 结果（见表1)本发明菌株TOM-3为枯草芽孢杆菌的鉴定ID( Identification)为 97.7%，鉴定结果说明本发明菌株YNM-3为枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus subti 1 is)。
[0045] 综合以上形态特征、16S rDNA序列分析和API 50CHB试剂条鉴定的结果，可知ΥΝΜ-3 属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) ， 并且和现有的其他芽孢杆菌菌株不同， 是一个 新的枯草芽孢杆菌菌株。
[0046] 本发明具有的优点和有益效果：（1)本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM-3对玉米茎基腐 病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期茎基部防效达到82.9%，田间成株期防效达 88.31%，为玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治提供了一种新途径；（2)本发明微生物菌剂 制备方法简单、成本低、易于推广应用；（3)本发明无污染，无公害，对环境友好。
【附图说明】
[0047] 图1为YNM-3的系统发育树。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1 YNM-3对主要玉米茎基腐病菌和苗期根腐病菌的抑制作用
[0049] 采用平皿对峙培养法测定本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM-3对4种本实验室分离并 保存的玉米莖基腐病原菌和苗期根腐病病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、轮生 镜刀菌(Fusarium verticillioides)、离懦抱菌(Cochliobolus sativas)和立枯丝核菌 (Rhizotonia solani)的抑菌效果。将本发明YNM-3菌株转接至LB平板培养基上30°C下活化 2d;将保存的4种病原真菌在PDA培养基上活化5d，然后在菌落边缘用直径5mm的打孔器打取 菌龄一致的菌片，菌丝朝下转接到另一 PDA平板培养基中央，在菌片四周距菌片2.5cm处接 种YNM-3菌株，以空白为对照，每处理4次重复，置于25 °C恒温培养5d，测量病原菌处理菌落 半径和抑菌带宽，计算抑菌率。
[0050] 抑菌率计算公式为：
[0051]
[0052]结果（见表2)Y匪-3菌株对玉米茎基腐病和苗期根腐病的4种病原菌的抑菌带宽 6.0~12.0mm，抑菌率为57.8 %~79.0%。说明本发明ΥΝΜ-3菌株对4中病原菌都具有较好的 抑制作用。
[0053]表2本发明菌株YNM-3对4种植物病原真菌的抑制作用试验结果
[0054]
[0055] 实施例2本发明YNM-3微生物菌剂液体制剂和颗粒剂的制备 [0056]按照如下步骤进行：
[0057] (1)菌种活化：将保存于-40 °C的菌株YNM-3在LB平板培养基上、在30 °C下进行活 化，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁备用;LB平板培养基和LB斜面培养基都按照常规方 法制作。
[0058] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB液体 培养基l〇〇mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤（1)活化好的TOM-3菌株 一接种环，在30°C、摇床转速170r/min条件下振荡培养22h小时，得种子液；
[0059] (3)发酵培养基的制备：按照如下重量百分比配制发酵培养基:玉米粉1~2%;酵 母膏0.2~0.5%;黄豆粉 1 ~2%;Na2HP〇4 0.1 ~0.2%;CaC03 0.1 ~0.2%;Kcl 0.08~ 0.15%;MgS〇4 0.1 ~〇·3%;ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg;MnS〇4 0.01 ~1.03%;其余为水，混合均 匀；121°C灭菌30min，降温到30°C备用。
[0060] (4)发酵培养:重量百分比0.5~1%的比例向步骤(3)配制的发酵培养基中接种步 骤(2)所得种子液1.5L;初始pH值用Hcl调为7,在温度为30°C、搅拌速度为170r/min、0~8h 通气比1:0.4; 8~15h通气比1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养。
[0061] (5)发酵培养12h以后，每隔60分钟从步骤(4)的三角瓶中取样进行镜检，对视野中 的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90%即可停止发酵培养，得发酵 液。所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。
[0062] (6)将上述所得发酵液浓缩，与草炭1:1混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的 颗粒剂；
[0063] 实施例3 YNM-3防治玉米茎基腐病温室对比试验 [0064]按照如下方法进行：
[0065]所用土壤为灭菌土，于玉米粒培养基上培养本实验室分离并保存的玉米茎基腐病 和苗期根腐病的主要病原菌禾谷镰刀菌、轮生镰刀菌和立枯丝核菌，播种前等量混合土壤 接种，将培养物与灭菌土以体积比1:10混合均匀，花盆直径l〇cm，每盆播种5粒玉米种子，品 种为郑单958,4次重复。苗后3叶期和5叶期分别用稀释10倍的实施例2制备的TOM-3发酵液 灌根2次，每盆250ml，对照用先正达公司种衣剂2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜灵15ml拌种10kg 种子，以接种病原菌不防治为空白对照，待空白对照明显发病时，拔苗洗净根部调查发病级 另IJ，计算病情指数和防治效果。
[0066] 结果（见表3)Y匪-3对玉米茎基腐病根部和茎基部的防治效果分别为37.4%和 82.9%，化学药剂防治效果为51.4%和69.2%，本发明防治效果与化学防治效果之间没有 显著差异。说明本发明枯草芽孢杆菌菌株ΥΝΜ-3及其微生物菌剂对玉米茎基腐病有很好的 防治效果。
[0067]表3本发明菌株ΥΝΜ-3对玉米茎基腐病防效试验结果
[0068]
[0069」 *ρ = 0·05
[0070] 实施例4本发明菌株ΥΝΜ-3防治苗期玉米茎基腐病田间小区对比试验
[0071] ( -）试验处理：
[0072] (1)实施例2制备的本发明ΥΝΜ-3微生物菌剂的液体制剂；
[0073] (2)药剂对照1:2.5 %咯菌腈+1.0 %精甲霜灵；
[0074] (3)药剂对照3:2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲环唑；
[0075] (4)空白对照。
[0076](二)试验方法：
[0077] 本试验于2012-2014年在河北农科院植保所试验地进行。试验地为玉米茎基腐病 和苗期根腐病发生严重地块。在播种前，用实施例2制备的TOM-3液体制剂浸种60min，以 2.5 %咯菌腈+1. Ο %精甲霜灵拌种和2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲环唑按照种子重量的 0.15%拌种为化学药剂对照1和化学药剂对照2,以及空白对照;3次重复，随机排列，播种后 21d拔苗调查玉米根部发病级别，计算病情指数。
[0078]结果(见表4)YNM_3处理后玉米苗期茎基腐病病情指数在3年试验中均显著低于空 白对照，防效显著，平均防效为40.8% ;2012年试验结果YNM-3浸种处理的防效显著高于两 个药剂处理，2013年和2014年试验YNM-3浸种处理的防效与两个药剂处理没有显著差异，说 明YNM-3浸种对玉米茎基腐病苗期侵染和苗期根腐病的防效优于或等同于化学药剂。
[0079]表4本发明YNM-3菌株对玉米茎基腐病的田间小区防治效果
[0080]
[0081] 实例5 YNM-3对成株期玉米茎基腐病的田间防治效果
[0082] (一）试验处理：
[0083] (1)实施例2制备的YNM-3颗粒剂；
[0084] (2)化学药剂(满适金）：2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜灵(购自先正达公司）；
[0085] (3)空白对照。
[0086] (二)试验方法
[0087] 本试验在河北省农林科学院植保所病圃田进行。在播种前沟施实施例2制备的 Y匪-3颗粒剂(有效含量5亿个菌体/克）10kg/亩，对照化学药剂采用种衣剂2.5%咯菌腈+ 1.0%精甲霜灵(购自先正达公司）15mL/10kg种子包衣，设不防治为空白对照。每处理重复3 次，随机排列，于收获前调查玉米茎基腐病的病株率。
[0088] 表5 YNM-3颗粒剂对玉米茎基腐病成株期田间防治效果试验结果
[0089]
[0090]~结果(表5)本发明TOM-3颗粒剂对玉米茎基腐病防效达到88.31 %，高于对照化学_ 药剂的防效42.05 %。说明本发明YNM-3微生物菌剂的颗粒剂对玉米茎基腐病有突出的防治 效果。
【主权项】
1. 一种枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)菌株YNM-3，己于2012年12月4日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6933。2. 利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为 枯草芽孢杆菌菌株YNM-3菌体。3. 根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其剂型是液体制剂或颗粒剂。4. 权利要求3所述的微生物菌剂的液体制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将低温保存的Y匪_3菌株在LB平板培养基上、在30°C下活化，挑取单菌落在LB斜面 培养基上扩繁，备用； (2) 向LB液体培养基100mL中接种一接种环步骤（1)中活化好的YNM-3菌株，在30~32 °C、转速为160~180r/min条件下震荡培养20~30h，得种子液； (3) 向发酵罐加入发酵培养基，按照重量百分比0.5~1%的比例接种步骤(2)所得的种 子液，初始pH值用HC1调为6.5~7.0，在温度为30~32°(：、搅拌速度为160~18(^/1^11、0~811 通气比1:0.4; 8~15h通气比1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养，发酵培养时间为 24~72h; (4) 在步骤(3)中发酵培养12h以后，每隔60分钟从发酵培养液中取样进行镜检，对视野 中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率;芽孢率达到90 %即停止发酵培养，得发酵 液;所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)或（3)中所述的发酵培养时 间为24~48h。6. 上根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)或（3)中所述的搅拌速度 为170r/min〇7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的发酵培养基的组成 成分及其重量百分比为:玉米粉1~2%，酵母膏0.2~0.5%，黄豆粉1~2%，Na 2HP〇4 0.1~ 0.2%，CaC03 0.1 ~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，MgS〇4 0.1 ~0·3%，ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg， MnS〇4 0.01 ~1.03%，其余为水。8. 权利要求3所述的微生物菌剂的颗粒剂，包括将权利要求4制备的发酵液浓缩，与草 炭1:1混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的颗粒剂。9. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米茎基腐 病或苗期根腐病上的应用。10. 权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病上的应用。
【文档编号】A01P3/00GK106085928SQ201610743943
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月29日
【发明人】孔令晓, 纪莉景, 鹿秀云, 王亚娇, 栗秋生, 王连生
【申请人】河北省农林科学院植物保护研究所
【专利摘要】本发明公开了属于生物防治领域的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM?3，该菌株己于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6933。本发明还公开了利用YNM?3制备的微生物菌剂，以及该微生物菌剂的制备方法。本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM?3对玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期茎基部防效达到82.9％，田间成株期防效达88.31％，为玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治提供了一种新途径；其次，本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；此外，本发明微生物菌剂无污染，无公害，对环境友好。CGMCC No.693320121204
【专利说明】
一种枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物防治领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌，还涉及利用该枯草芽孢 杆菌生产的微生物菌剂、以及该微生物菌剂的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 玉米茎基腐病(Corn stalk rot)又称玉米茎腐病或玉米青枯病，由多种病原菌单 独或复合侵染造成，主要病原菌有禾谷镰刀菌（Fusarium gramincarum)、轮生镰刀菌 (Fusarium.moniliforme)和腐霉菌(Pythium. spp)，不同地区主要病原菌种类不同。病原菌 自玉米苗期至成株期都可从根部侵染，在苗期侵染引起根腐和苗枯，一般在玉米灌浆至乳 熟期开始发病，乳熟末期至蜡熟期为显症高峰。开始在茎基部节间产生纵向不规则褐色病 斑，随后基部皱缩、变软，后期茎内空松腐烂，腐烂自茎基第一节开始向上扩展，可达第二、 三节，甚至第四节，后期极易倒折。典型症状有青枯和黄枯两种类型，青枯型为急性发病，叶 片呈灰绿色自下而上迅速枯死;黄枯为慢性发病型，发病后叶片自下而上逐渐黄枯。感病玉 米根部须根和根毛减少，根表皮松脱，髓部中空，变褐腐烂。近几年，由于气候变化、秸杆还 田、种植密度加大等原因该病的发生有上升趋势，茎基腐病已成为继大斑病、小斑病、弯孢 菌叶斑病等叶斑病之后的又一亟待解决的重要玉米病害。此外，蠕孢菌和丝核菌也是造成 玉米苗期根腐的病原菌。
[0003] 目前，防治玉米茎基腐病和苗期根腐病的主要方法：（1)化学防治。即用化学药剂 进行种子包衣或灌根，由于病原菌在玉米整个生育期都能够侵染植株根系，化学防治存在 防治效果不佳，且长期大量使用对土壤和环境带来污染等缺点。（2)抗病育种。由于抗病基 因难找，培育抗性品种困难。（3)生物防治。生物防治因具有专化性强、持久性好、以及环境 友好等特点，是解决玉米茎基腐病和苗期根腐病的有效方法。目前筛选出的对玉米茎基腐 病有生防作用的生防菌有哈次木霉、鞍形小球壳菌、粉红粘帚霉菌、粉红单端孢菌、简单节 葡孢菌、棘腐霉菌、外担菌和绿木霉等。如已公开对玉米茎腐病有防治作用的绿木霉（陈捷 等.植物保护，1994(3): 6-8)和解淀粉芽孢杆菌（崔文艳等.玉米科学，2015,23(5):153-158)等。
[0004] 枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)是目前应用比较广泛的生防细菌。其分布范 围广，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物表面普遍存在。同时还是植物体内 常见的内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境，由于其生长速度快、营养需求简单、在植物表 面易于定殖、生长和繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌的工艺简单、制剂稳定、使用方便、储存期 长，因此是一种理想的生防细菌。因此，如果筛选出对玉米茎基腐病菌和苗期根腐病菌具有 抑制作用的枯草芽孢杆菌，将为防治玉米茎基腐病提供有效途径。
[0005] 经检索，没有发现枯草芽孢杆菌用于防治玉米茎基腐病的报道。
【发明内容】
[0006] 针对目前玉米茎基腐病抗病品种缺少，化学农药防治效果差、且存在污染环境的 问题，本发明目的在于提供一种枯草芽孢杆菌。该菌株对玉米茎基腐病和苗期根腐病防治 效果好。
[0007] 本发明第二目的在于提供利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂。
[0008] 本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0009] 本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0010]本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0011] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0012] 本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3,己于2012年12 月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为:北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.6933。
[0013] 本发明还提供了利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽 孢杆菌菌株YNM-3菌体。
[0014] 上述微生物菌剂，其剂型可以是液体制剂或颗粒剂。
[0015] 上述微生物菌剂的液体制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)菌种活化:将低温保存的YNM-3菌株在LB平板培养基上、在30 °C下活化，挑取单 菌落在LB斜面培养基上扩繁，备用；
[0017] (2)种子液制备：向LB液体培养基100mL中接种一接种环步骤（1)中活化好的YNM-3 菌株，在30~32°C、转速160~180r/min条件下震荡培养20~30h，得种子液；
[0018] (3)发酵培养：向发酵罐加入混合好的发酵培养基（亦称:玉米粉酵母膏发酵培养 基），按照重量百分比0.5~1%的比例接种步骤⑵所得的种子液，初始pH值用HC1调为6.5 ~7.0,在温度为30~32°C、搅拌速度为160~180r/min、0~8h通气比1:0.4;8~1511通气比 1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养，发酵培养时间为24~72h;
[0019] (4)在步骤(3)中发酵培养12h以后，每隔60分钟从发酵培养液中取样进行镜检，对 视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率;芽孢率达到90 %即停止发酵培养，得发 酵液;所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。
[0020] 上述制备方法步骤(2)或(3)中所述的发酵培养时间为24~48h。
[0021 ]上述制备方法步骤(2)或(3)中所述的搅拌速度为170r/min。
[0022] 上述制备方法步骤（1)中所述的的LB平板培养基和LB斜面培养基按常规方法制 作。
[0023] 上述制备方法步骤(2)中的LB液体培养基按常规方法制作。
[0024]上述制备方法步骤(3)中所述的发酵培养基组成成分及其重量百分比为:玉米粉1 ~2%，酵母膏0.2~0.5%，黄豆粉 1~2%，Na2HP〇4 0· 1~0.2%，Ca⑶3〇· 1~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，]\%504 0.1~0.3%，順4勵3 0.1~0.2%1^，]\1115040.01~1.03%，其余为水；
[0025] 所述的发酵培养基的制备方法，包括按照重量百分比比例将各成分加入水中，混 合均匀，121°C灭菌30min，降温到30°C备用。
[0026] 上述微生物菌剂的颗粒剂，包括将上述制备方法中制备的发酵液浓缩，与草炭1:1 混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的颗粒剂。
[0027] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米茎基腐病或苗期 根腐病上的应用。
[0028]上述微生物菌剂在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病上的应用。
[0029]上述微生物菌剂的使用方法:玉米播种前用YNM-3发酵液浸种、或在玉米播种时将 YNM-3微生物菌剂的颗粒剂随底肥施入，即可达到控制玉米茎基腐病和苗期根腐病的目的。
[0030] 本发明菌株YNM-3的筛选分离过程：
[0031] YNM-3菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从玉米茎基腐病发病严重的病田 土壤中分离得到的。2003年3月河北省农林科学院植物保护研究所在河北省邯郸永年县采 集小麦田土壤样品，混勾后称取10g放入250mL三角瓶中，加入无菌水100mL，摇床170r/min 条件下振荡30min，静置2h，取上清液lmL加无菌水9mL，即成10mL 10-2倍土壤微生物悬液，继 而将土壤悬液稀释成10' 10' 10-5、10-6倍稀释液，各浓度取200yL微生物悬液涂于LB平板 培养基上，每个浓度3次重复，在30°C恒温培养3d~5d，分别进行细菌分离，挑取单菌落纯 化，入生防菌库保存。之后，以玉米茎基腐病菌和苗期根腐的优势病原菌禾谷镰刀菌 (Fusarium gramincarum)、轮生镜刀菌（F ·moni 1 iforme )、离懦抱菌（Cochliobolus sativas)和立枯丝核菌(Rhizotonia solani)为革El标菌，进行诘抗菌的筛选，从中筛选出一 个对禾谷镰刀菌、轮生镰刀菌、离蠕孢菌和立枯丝核菌都具有明显抑菌效果的菌株，定名为 YNM-3〇
[0032] YNM-3菌株的分类鉴定：
[0033] (1)形态特征鉴定
[0034] 菌体革兰氏阳性菌、杆状。芽孢形态椭圆至柱状，中部产生。PDA平板培养初期菌落 乳白色，规则圆形，边缘不齐整，表面湿润、光滑；中期脓状凸起;后期淡黄色，边缘粗糙，表 面干燥。平板划线呈直线行。LB液体培养基中静置培养，表面能够形成白色菌膜。这些形态 特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著.科学出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌 属形态特征基本一致，初步判断菌株YNM-3属于芽孢杆菌。
[0035] (2)1防rDNA序列测定
[0036]以本发明菌株TOM-3的基因组DNA为模板、以细菌鉴定常用的16S rDNA通用引物 F27和R1492为引物进行扩增;所述的引物为：
[0037] F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（SEQ ID No:l);
[0038] R1492:5，-GGCTACCTTGTTACGACTT-3，（SEQ ID No:2)。
[0039] PCR的反应体系为50μ1，其中模板DNA 2μ1，上下游引物各2yl，PCR Master Mix 25 μL以及无菌水19μ1。扩增反应条件为:94°C预变性3min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延 伸458,35个循环 ;最后72°(：延伸1〇1^11。？0財广增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并将其 送往上海生物工程技术有限公司进行测序，测序结果见序列表SEQ ID N〇:3。将测序所得 Y匪-3的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株Y匪-3与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99%;构建系统发育树(见图1)，菌株YNM-3与芽孢杆菌属聚合到一起，说明 YNM-3属于芽抱杆菌属(Bacillus)。
[0040] (3)YNM-3生理生化指标鉴定
[00411采用法国梅里埃公司生产的API 50CHB试剂条对菌株Y匪-3进行生理生化指标鉴 定，以枯草芽孢杆菌标准菌株1504(中国菌种保藏委员会)作为对照，操作步骤按其说明书 进行。根据试剂条的颜色反应对结果进行判读，（"+"代表阳性，代表阴性），API Lab V3.0软件分析。
[0042] 表1本发明ΥΝΜ-3菌株的生理生化指标鉴定判读结果
[0043]
[0044] 结果（见表1)本发明菌株TOM-3为枯草芽孢杆菌的鉴定ID( Identification)为 97.7%，鉴定结果说明本发明菌株YNM-3为枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus subti 1 is)。
[0045] 综合以上形态特征、16S rDNA序列分析和API 50CHB试剂条鉴定的结果，可知ΥΝΜ-3 属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) ， 并且和现有的其他芽孢杆菌菌株不同， 是一个 新的枯草芽孢杆菌菌株。
[0046] 本发明具有的优点和有益效果：（1)本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM-3对玉米茎基腐 病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期茎基部防效达到82.9%，田间成株期防效达 88.31%，为玉米茎基腐病和苗期根腐病的防治提供了一种新途径；（2)本发明微生物菌剂 制备方法简单、成本低、易于推广应用；（3)本发明无污染，无公害，对环境友好。
【附图说明】
[0047] 图1为YNM-3的系统发育树。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1 YNM-3对主要玉米茎基腐病菌和苗期根腐病菌的抑制作用
[0049] 采用平皿对峙培养法测定本发明枯草芽孢杆菌菌株YNM-3对4种本实验室分离并 保存的玉米莖基腐病原菌和苗期根腐病病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、轮生 镜刀菌(Fusarium verticillioides)、离懦抱菌(Cochliobolus sativas)和立枯丝核菌 (Rhizotonia solani)的抑菌效果。将本发明YNM-3菌株转接至LB平板培养基上30°C下活化 2d;将保存的4种病原真菌在PDA培养基上活化5d，然后在菌落边缘用直径5mm的打孔器打取 菌龄一致的菌片，菌丝朝下转接到另一 PDA平板培养基中央，在菌片四周距菌片2.5cm处接 种YNM-3菌株，以空白为对照，每处理4次重复，置于25 °C恒温培养5d，测量病原菌处理菌落 半径和抑菌带宽，计算抑菌率。
[0050] 抑菌率计算公式为：
[0051]
[0052]结果（见表2)Y匪-3菌株对玉米茎基腐病和苗期根腐病的4种病原菌的抑菌带宽 6.0~12.0mm，抑菌率为57.8 %~79.0%。说明本发明ΥΝΜ-3菌株对4中病原菌都具有较好的 抑制作用。
[0053]表2本发明菌株YNM-3对4种植物病原真菌的抑制作用试验结果
[0054]
[0055] 实施例2本发明YNM-3微生物菌剂液体制剂和颗粒剂的制备 [0056]按照如下步骤进行：
[0057] (1)菌种活化：将保存于-40 °C的菌株YNM-3在LB平板培养基上、在30 °C下进行活 化，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁备用;LB平板培养基和LB斜面培养基都按照常规方 法制作。
[0058] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB液体 培养基l〇〇mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤（1)活化好的TOM-3菌株 一接种环，在30°C、摇床转速170r/min条件下振荡培养22h小时，得种子液；
[0059] (3)发酵培养基的制备：按照如下重量百分比配制发酵培养基:玉米粉1~2%;酵 母膏0.2~0.5%;黄豆粉 1 ~2%;Na2HP〇4 0.1 ~0.2%;CaC03 0.1 ~0.2%;Kcl 0.08~ 0.15%;MgS〇4 0.1 ~〇·3%;ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg;MnS〇4 0.01 ~1.03%;其余为水，混合均 匀；121°C灭菌30min，降温到30°C备用。
[0060] (4)发酵培养:重量百分比0.5~1%的比例向步骤(3)配制的发酵培养基中接种步 骤(2)所得种子液1.5L;初始pH值用Hcl调为7,在温度为30°C、搅拌速度为170r/min、0~8h 通气比1:0.4; 8~15h通气比1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养。
[0061] (5)发酵培养12h以后，每隔60分钟从步骤(4)的三角瓶中取样进行镜检，对视野中 的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90%即可停止发酵培养，得发酵 液。所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。
[0062] (6)将上述所得发酵液浓缩，与草炭1:1混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的 颗粒剂；
[0063] 实施例3 YNM-3防治玉米茎基腐病温室对比试验 [0064]按照如下方法进行：
[0065]所用土壤为灭菌土，于玉米粒培养基上培养本实验室分离并保存的玉米茎基腐病 和苗期根腐病的主要病原菌禾谷镰刀菌、轮生镰刀菌和立枯丝核菌，播种前等量混合土壤 接种，将培养物与灭菌土以体积比1:10混合均匀，花盆直径l〇cm，每盆播种5粒玉米种子，品 种为郑单958,4次重复。苗后3叶期和5叶期分别用稀释10倍的实施例2制备的TOM-3发酵液 灌根2次，每盆250ml，对照用先正达公司种衣剂2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜灵15ml拌种10kg 种子，以接种病原菌不防治为空白对照，待空白对照明显发病时，拔苗洗净根部调查发病级 另IJ，计算病情指数和防治效果。
[0066] 结果（见表3)Y匪-3对玉米茎基腐病根部和茎基部的防治效果分别为37.4%和 82.9%，化学药剂防治效果为51.4%和69.2%，本发明防治效果与化学防治效果之间没有 显著差异。说明本发明枯草芽孢杆菌菌株ΥΝΜ-3及其微生物菌剂对玉米茎基腐病有很好的 防治效果。
[0067]表3本发明菌株ΥΝΜ-3对玉米茎基腐病防效试验结果
[0068]
[0069」 *ρ = 0·05
[0070] 实施例4本发明菌株ΥΝΜ-3防治苗期玉米茎基腐病田间小区对比试验
[0071] ( -）试验处理：
[0072] (1)实施例2制备的本发明ΥΝΜ-3微生物菌剂的液体制剂；
[0073] (2)药剂对照1:2.5 %咯菌腈+1.0 %精甲霜灵；
[0074] (3)药剂对照3:2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲环唑；
[0075] (4)空白对照。
[0076](二)试验方法：
[0077] 本试验于2012-2014年在河北农科院植保所试验地进行。试验地为玉米茎基腐病 和苗期根腐病发生严重地块。在播种前，用实施例2制备的TOM-3液体制剂浸种60min，以 2.5 %咯菌腈+1. Ο %精甲霜灵拌种和2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲环唑按照种子重量的 0.15%拌种为化学药剂对照1和化学药剂对照2,以及空白对照;3次重复，随机排列，播种后 21d拔苗调查玉米根部发病级别，计算病情指数。
[0078]结果(见表4)YNM_3处理后玉米苗期茎基腐病病情指数在3年试验中均显著低于空 白对照，防效显著，平均防效为40.8% ;2012年试验结果YNM-3浸种处理的防效显著高于两 个药剂处理，2013年和2014年试验YNM-3浸种处理的防效与两个药剂处理没有显著差异，说 明YNM-3浸种对玉米茎基腐病苗期侵染和苗期根腐病的防效优于或等同于化学药剂。
[0079]表4本发明YNM-3菌株对玉米茎基腐病的田间小区防治效果
[0080]
[0081] 实例5 YNM-3对成株期玉米茎基腐病的田间防治效果
[0082] (一）试验处理：
[0083] (1)实施例2制备的YNM-3颗粒剂；
[0084] (2)化学药剂(满适金）：2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜灵(购自先正达公司）；
[0085] (3)空白对照。
[0086] (二)试验方法
[0087] 本试验在河北省农林科学院植保所病圃田进行。在播种前沟施实施例2制备的 Y匪-3颗粒剂(有效含量5亿个菌体/克）10kg/亩，对照化学药剂采用种衣剂2.5%咯菌腈+ 1.0%精甲霜灵(购自先正达公司）15mL/10kg种子包衣，设不防治为空白对照。每处理重复3 次，随机排列，于收获前调查玉米茎基腐病的病株率。
[0088] 表5 YNM-3颗粒剂对玉米茎基腐病成株期田间防治效果试验结果
[0089]
[0090]~结果(表5)本发明TOM-3颗粒剂对玉米茎基腐病防效达到88.31 %，高于对照化学_ 药剂的防效42.05 %。说明本发明YNM-3微生物菌剂的颗粒剂对玉米茎基腐病有突出的防治 效果。
【主权项】
1. 一种枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)菌株YNM-3，己于2012年12月4日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6933。2. 利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为 枯草芽孢杆菌菌株YNM-3菌体。3. 根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其剂型是液体制剂或颗粒剂。4. 权利要求3所述的微生物菌剂的液体制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将低温保存的Y匪_3菌株在LB平板培养基上、在30°C下活化，挑取单菌落在LB斜面 培养基上扩繁，备用； (2) 向LB液体培养基100mL中接种一接种环步骤（1)中活化好的YNM-3菌株，在30~32 °C、转速为160~180r/min条件下震荡培养20~30h，得种子液； (3) 向发酵罐加入发酵培养基，按照重量百分比0.5~1%的比例接种步骤(2)所得的种 子液，初始pH值用HC1调为6.5~7.0，在温度为30~32°(：、搅拌速度为160~18(^/1^11、0~811 通气比1:0.4; 8~15h通气比1:1; 15~22h通气比1:0.6的条件下发酵培养，发酵培养时间为 24~72h; (4) 在步骤(3)中发酵培养12h以后，每隔60分钟从发酵培养液中取样进行镜检，对视野 中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率;芽孢率达到90 %即停止发酵培养，得发酵 液;所得发酵液即为本发明微生物菌剂的液体制剂。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)或（3)中所述的发酵培养时 间为24~48h。6. 上根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)或（3)中所述的搅拌速度 为170r/min〇7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的发酵培养基的组成 成分及其重量百分比为:玉米粉1~2%，酵母膏0.2~0.5%，黄豆粉1~2%，Na 2HP〇4 0.1~ 0.2%，CaC03 0.1 ~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，MgS〇4 0.1 ~0·3%，ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg， MnS〇4 0.01 ~1.03%，其余为水。8. 权利要求3所述的微生物菌剂的颗粒剂，包括将权利要求4制备的发酵液浓缩，与草 炭1:1混合均匀后，通过制粒机制成不同浓度的颗粒剂。9. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米茎基腐 病或苗期根腐病上的应用。10. 权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治玉米茎基腐病或苗期根腐病上的应用。
【文档编号】A01P3/00GK106085928SQ201610743943
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月29日
【发明人】孔令晓, 纪莉景, 鹿秀云, 王亚娇, 栗秋生, 王连生
【申请人】河北省农林科学院植物保护研究所
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0访客 来自[中国] 2023年03月10日 15:57枯草芽孢杆菌是新生的无毒无污染对作物安全的微生物菌剂，希望报导有关施用技术和施用方法，发展和扩大在农业上的应用。谢谢！
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