一种重组VEGF与GnRH融合蛋白的基因工程菌的构建的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，本发明公开提供了关于一种重组VEGF与GnRH的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明提供的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/VGD，CCTCC NO：M2016132。该工程菌含有重组质粒pET32a?VEGF?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG，质粒上有重组突变VEGF基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VGD菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白VEGF I?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。CCTCC NO：M201613220150321
【专利说明】
一种重组VEGF与GnRH融合蛋白的基因工程菌的构建
技术领域
[0001] 在基因工程领域，本发明公开了一种新型融合蛋白重组工程菌及其构建方法，以 及该融合蛋白的纯化。
【背景技术】
[0002] 重组质粒是指在基因工程的领域，将目的基因和载体结合成一个具有自我复制能 力的DNA分子，继而转化或转染入宿主菌株或细胞，筛选出含目的基因的重组子。
[0003] 基因工程(Genetic engineering):是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和 微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分 子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品，通过基因工程 技术可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
[0004] 肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的 针对肿瘤的靶抗原和提高免疫原性。
[0005] 肿瘤细胞会表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，针对这些抗原发展起来的肿瘤 特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。
[0006] 肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen，TAA):指并非某一种肿瘤所特有，在 其他肿瘤细胞或正常细胞上也存在的抗原分子。正常细胞与肿瘤细胞仅在增殖中有量的差 异，因此称为相关抗原。
[0007] 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor)，即VEGF，是内皮特 异性的有丝分裂原，能增强内皮细胞的生存能力，促进有丝分裂，诱导毛细血管新生、增加 微血管通透性使肿瘤持续生长、促进细胞移行和抑制凋亡等多种功能。大多数肿瘤细胞均 高水平表达VEGF，而正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达，因此VEGF是抗肿 瘤血管治疗理想的靶部位。
[0008]目前应用单克隆抗体、小分子抑制物、可溶性受体等方法通过阻断其信号转导通 路或耗竭肿瘤细胞产生VEGF，抑制肿瘤血管生成，达到抑制肿瘤生长及转移的作用。以肿瘤 血管生成为靶点的靶向治疗，主要集中在抗VEGF治疗上。目前针对VEGF途径的基因疗法，在 肿瘤的治疗中前景比较乐观。VEGFm突变体I是本实验室用破伤风毒素两个强T辅助表位 618-627和831-838替换hVEGFm的1-8和115-121两个肽段。结果说明在保持半胱氨酸原有 二聚体结构的前提下，破伤风毒素两个强T辅助表位hVEGF非关键残基置换后，可有效提高 VEGF的免疫原性。
[0009] 促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)由下丘脑特定神 经元细胞合成，并以脉冲方式通过垂体门脉循环分泌到垂体前叶，与垂体细胞膜上高亲和 力的GnRH受体(GnRHR)特异地结合，引发FSH和LH的合成与释放，从而促进性腺中类固醇激 素的合成。通过诱导高滴度的抗GnRH-I抗体来中和机体内的GnRH-I，可抑制其与垂体上I型 GnRHR的结合，导致LH和FSH等促性腺激素释放水平明显下降，下调类固醇类激素的合成，降 低对肿瘤细胞的供应，对激素依赖性肿瘤有良好的治疗效果。同时GnRH可通过抑制V EGF等 的表达下调肿瘤细胞诱导的血管再生作用以及调控或作用于生长因子，如在前列腺癌细胞 中GnRH-A具有抗EGF/TGFa系统作用，降低细胞分裂;也可能涉及细胞凋亡的诱发或者抑制 细胞内诸如P13/PKB等信号通道。因此GnRH及其受体是肿瘤治疗的理想靶点。
[0010] GnRH-I是一种小分子半抗原，免疫原性很弱，单独将其作为疫苗很难引起免疫应 答，因此本实验室利用辅助T表位来提高GnRH-I的免疫原性。研究表明，麻疹病毒融合蛋白 序列中的288-302氨基酸片段是一个典型的T表位(SEIKGVIVRLEGVAK，下文均简称MVP)，可 用于人用疫苗而且不会产生明显的针对该T表位的抗体。有研究表明，含有多拷贝线性连接 的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到极大的提高，因而，本实验室将编码三段首尾相连 的GnRH-I的核苷酸片段克隆入高效表达载体。还有研究表明，半抗原的二聚体能产生很强 的免疫原性。人IgGl铰链区（hinge region)寡肽片段226-232/226'-232'（CPPCPAP/ CPPCPAP)是天然免疫蛋白的枢轴。本实验将与DnaK多肽结合结构域有着高度亲和力的多肽 片段NRLLLTG融合在先前所构建的GnRH-I多肽疫苗融合蛋白的C-端。因此，本设计是在编码 GnRH-I重复序列和MVP的核苷酸序列之间引入该寡肽片段的相应核苷酸序列，希望GnRH-I 能藉此形成二聚体，增强免疫原性。
[0011]由于单独用VEGF或GnRH免疫原性相对较低，且从多个位点共同作用于肿瘤已经成 为趋势。本发明将VEGFmI_M2基因同GnRH基因连接起来，组建pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-Dnak binding site重组质粒，诱导表达融合蛋白，将其作为疫苗刺激机体产生 主动免疫，打破免疫耐受，产生针对VEGF和GnRH特异性肽段的抗体，从而抑制肿瘤的生长。
【发明内容】
[0012] 本发明公开一种表达重组VEGF融合蛋白的基因工程菌。
[0013] 本发明的一个目的是提供该重组菌的制备方法，方法简便，易于操作。
[0014] 本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的纯化方法。
[0015] 在本发明的第一个方面，该大肠杆菌菌株命名为Escherichia coli BL21(DE3)/ VGD: pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，菌株已提交中国典型培养物保藏中心，保 藏地址：中国、武汉、武汉大学。保藏日期：2015年3月21日，保藏编号为CCTCC NO:M2016132， 分类命名为Escherichia coli BL21/pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其细胞 中含有重组质粒pET32a-VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，质粒中含有SEQ ID NO. 1 所示 的重组突变VEGF基因序列。
[0016] 在本发明的第二个方面，提供了该重组质粒的制备方法，其技术路线详述如下：
[0017] 1 ·重组质粒pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG及相应基因工程菌的构 建
[0018] 根据本实验室已有的关于重组质粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和pET28a-VEGF I-M2的序列信息，利用引物设计软件Primer 5和01igo7来设计引物 VI、V2。上游引物VI中引入Nco I，下游引物V2中引入BamH頂每切位点以及GSGSG连接肽序 列。采用PCR技术从pET28a-VEGF I-M2质粒中克隆得到基因 VEGF I-M2-GSGSG。通过Nco I和 BamH I双酶切、T4连接酶连接和转化技术将PCR的产物VEGF I-M2-GSGSG插入pEDGD质粒载 体的相应酶切位点中，得到中间转化子pET28a-VEGF-M 2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，再通过 N co I和Hind III双酶切、T4连接酶连接，将目的基因插入pET32a组成重组质粒pE T32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21获得需要的重 组基因的工程菌。
[0019] 2.融合蛋白的诱导表达
[0020] 将重组工程菌进行活化，接种至含氨苄霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按1:100 转接于新鲜LB培养液中，37°C培养至A600值为0.5-0.8时，加入乳糖(终浓度7mM)进行诱导 表达，7h后离心收取菌体沉淀，进行15%SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带位置和表达量。
[0021] 3.融合蛋白的分离纯化
[0022] 收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解缓冲液溶解，菌体超声裂解后，离心收集 上清。经硫酸铵分级沉淀，筛选出目的蛋白主要沉降时的硫酸铵饱和浓度并收集此时的沉 淀。将沉淀复融于离子交换液中，4°C搅拌至充分溶解，离心收集上清。上清装于8000-14000KDa的透析袋中，对离子交换液于4°C充分透析，离心弃沉淀，上清液过阴离子交换柱 DEAE-cellulose做进一步纯化，用浓度梯度为0-1M NaCl层析缓冲液梯度洗脱，收集洗脱 峰，检测合并目的蛋白峰组分，蒸馏水充分透析后冻干保存。
【附图说明】
[0023] 图1重组质粒构建原理示意图。
[0024] 图2 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物VEGFmI-M2-GSGSG基因的结果。
[0025] Lanel :Protein Marker，Lane2:VEGFmIHVl2-GSGSG基因
[0026] 图3质粒pET28a-VEGFmI-M2_GSGSG基因的正向测序图
[0027] 图4 重组质粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pED⑶）基因的正向 测序图。
[0028] 图5 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG目的基因的结 果。
[0029] Lane 1: Protein Marker，Lane2:重组质粒，Lane3:单酶切验证，Lane4:双酶切得到 V⑶基因
[0030] 图 6 重组质粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pEDVG2)的基因正向测 序图。
[0031] 图7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因的结果。
[0032] Lane 1: Prote in Marker，Lane2:重组质粒，Lane3:单酶切验证，Lane4:双酶切得到 V⑶基因
[0033] 图8 重组质粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pET32a-VG)的基因正 向测序图。
[0034]图9 15%SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。
[0035] Lanel :Protein Marker，Lane2:诱导前的全菌蛋白样品，Lane3_10:诱导后l_8h每 个小时的全菌蛋白样品
[0036] 图10 15%SDS-PAGE电泳检测融合蛋白破碎后图。
[0037] Lanel: Protein Marker，Lane2 :诱导前全菌蛋白，Lane3 :诱导后6h全菌蛋白， Lane4:超声破碎后离心上清，Lane5:超声破碎后沉淀 [0038]图11 15%SDS_PAGE电泳检测硫酸铵饱和浓度的选择
[0039] 1^1161:?1'(^6；[11]\^^61'，1^1162:诱导前全菌蛋白，1^1163:0~5%硫酸铵饱和浓度 透，Lane4:5 %~10 %硫酸铵饱和浓度，Lane5:10 %~20 %硫酸铵饱和浓度，Lane6:20 %~ 30 %硫酸铵饱和浓度，Lane7:30 %~40 %硫酸铵饱和浓度，Lane8:40 %~50 %硫酸铵饱和 浓度，Lane9:50 %~60 %硫酸铵饱和浓度
【具体实施方式】
[0040] 材料
[0041 ] (1)菌株
[0042]载体PET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli B L21 (DE3)，菌株pET28a-VEGFmI_M2均为本实验室保存。
[0043] (2)工具酶和试剂
[0044]分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海捷瑞生物科技有 限公司;产物纯化试剂盒以及PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。 [0045] (3)培养基
[0046] LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989〇
[0047] 本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、PCR产物的回收、连接 酶连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory M anual 2nd ed.NY：CoId Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp·16_340〇
[0048] 实施例 1 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 基因的克隆
[0049] 根据本实验室已构建的关于pET28a-VEGFmI_M2的序列信息，利用引物设计软件 卩1'；[11161'、01180分别设计两对引物￥1、￥2:
[0050] VI：57-CATGCCATGGACATCATCGACGACTTCACTA-37 [0051 ] V2：57-CGGGATCCACCGCTGCCGCTACCCTTGTTGT-37
[0052] 上游引物VI中引入酶切位点Nco I，下游V2中引入酶切位点BamH I以及柔性肽 GSGSG。用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-VEGFmI_M2和质粒pET28a-(ansB-C)-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG。利用引物V1、V2克隆VEGFmI-M2-GSGSG基因，PCR反应体系见表1，反应 参数见表2。
[0053]表 1 VEGF I-M2-GSGSG PCR反应体系
[0054]
[0055] 表2 VEGF I-M2-GSGSG PCR反应参数
[0056]
[0057] 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见说明书附图2)，条带位置与预期的534bp 一致。
[0058] 通过切胶回收获得目的片段VEGFmI-M2-GSGSG，将目的片段和pET28a-(ansB-C)- GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG载体质粒分别经Nco I、BamH I双酶切，双酶切反应体系见表3、 表4。
[0059] 表3 VEGF I-M2-GSGSG基因双酶切反应体系
[0060]
[0061]
[0062]表4 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG双酶切反应体系
[0063]
[0064] 酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段 与载体基因片段后用E. co 1 i DNA连接酶4 °C连接，用冷CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态 细胞，将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，37 °C过夜培养 后挑取单菌落，将单菌落接种至LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，分别通过PCR、单酶 切和双酶切等方法初筛阳性克隆，并送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后 完全正确(参见说明书附图4)。
[0065] 通过切胶回收获得目的片段，将目的片段VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和 pET32a载体质粒分别经Nco I、Hind III双酶切，双酶切反应体系见表3、表4。
[0066] 表3 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因双酶切反应体系
[0067]
[0068] 表4空载体pET32a双酶切反应体系
[0069]
[0070] 酶切产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段 与载体基因片段后用E. co 1 i DNA连接酶4 °C连接，用冷CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态 细胞，将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含氨苄霉素的LB固体培养基上，37 °C过夜培养 后挑取单菌落，将单菌落接种至LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，通过PCR、单酶切和 双酶切等方法初筛阳性克隆，并送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全 正确(参见说明书附图8)。
[0071] 实施例2 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因在大肠杆菌中的表达及培养
[0072] 重组菌以1 %接种量在液体LB培养基试管中37°C振荡培养过夜，再以1 %的接种量 转接摇瓶大批培养，培养4h后加入终浓度为5mM乳糖诱导表达，诱导6h后收集菌体，留样进 行SDS-PAGE分析。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融 合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的65% (参见说明书附图9)。
[0073] 实施例3融合蛋白的初步分离纯化
[0074] 挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37 °C过夜培养;过夜培养液转接入LB培养 基，37 °C扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。5000r/min离心15min，上清及沉淀均 留样。将沉淀用配制好的菌体裂解液（10mL/g菌体)溶解，超声裂解菌体。12000r/min离心 20min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAG E电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体上 清中，故可判断融合蛋白为可溶性表达(参见说明书附图10)。
[0075] 实施例4可溶性目的蛋白的硫酸铵分级沉淀
[0076] 取重组菌裂解液离心后上清于冰浴中边搅拌边加入研细的硫酸铵粉末至相应饱 和度(饱和度分别为5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60% )，加入速度应缓慢，以液体中不 出现硫酸铵固体为宜。达到相应饱和度后4°C静置lh，供蛋白质充分沉淀，12000r/min离心 20min，每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行SDS-PAGE检测，根据蛋白条带分析目 的蛋白集中沉淀的硫酸铵饱和度。选择目的蛋白集中沉淀的硫酸铵饱和浓度时收集沉淀复 融于离子交换液中，（25mM Tris · HCl，pH8.0)中，复溶时须加入1%(v/v)β-巯基乙醇。将复 溶的蛋白溶液于4°C对离子交换缓冲液透析过夜，再于4°C，12000r/min离心20min，弃沉淀， 上清用DEAE-52阴离子交换树脂进行进一步分离纯化。
[0077]实施例5 DEAE-52阴离子交换层析
[0078] 本实验采用的DEAE52是弱酸型阴离子交换剂，将DEAE-52用NaOH、HCl和NaOH分别 处理后用蒸馏水将其洗至中性，再将DEAE-52装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流 栗，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用离子交换缓冲液(pH8.0,20mM Tris · HC1)进行层析 柱的平衡，平衡完毕后以lmL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作， 再用NaCl(O-lM)进行梯度洗脱，收集洗脱峰留样，进行SDS-PAGE电泳分析。
[0079]实施例6脱盐冻干
[0080]收集蛋白纯度较高的洗脱液，4 °C对R0水透析过夜，将透析后的洗脱液在冻干机中 冻干，刮取蛋白干粉冷冻保存。
[0081]除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的 技术方案，均落于本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种生产重组蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG的大肠杆菌菌株，其特征在于 大肠杆菌菌株Escherichia coli.BL21(DE3)/VGD，保藏编号：CCTCC N0:M2016132。2. 根据权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/VGD，其特征在于:大肠杆菌细 胞中含有重组质粒 pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。3. 根据权利要求书2所述的该大肠杆菌菌株BL21(DE3)/V⑶中重组质粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特征在于：含有重组的VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，可表达融合蛋白，其具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。4. 一种制备权利要求书1所述的该大肠杆菌菌株的方法，它包括以下步骤： (I)用质粒提取试剂盒提取质粒 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 和 pET28a-VEGF I-M2,通过PCR方法扩增出目的片段VEGF I-M2-GSGSG。 (Π )用限制性内切酶Nco I、BamH I切割VEGF I-M2-GSGSG和pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG质粒，用E. coli DNA连接酶4°C连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得 含质粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 的菌株。 (ΠI)用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和质粒 pET32a，用限制性内切酶Nco I、Hind III切割质粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和质粒pET32a，用E.coli DNA连接酶4°C连接过夜，将其转化大肠杆菌菌株，获得 BL21(DE3)/VGD 菌株。 (IV)鉴定重组质粒:使用PCR法、和单酶切、双酶切方法进行验证，将重组菌株进行测序 验证。5. 根据权利要求3所述的一种新型融合蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特 征在于：该基因表达的融合蛋白实际分子量约为27kDa，其N端为VEGF I和M2(Hsp70(407-426)的两段串联重复序列），C端为三段串联重复的GnRH序列及IgG的铰链区及麻疹病毒融 合蛋白序列中的288-302氨基酸片段MVP，N端和C端之间利用GSGSG柔性肽连接。6. 根据权利要求5所述的VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的重组方法，其特征在 于:包含抗肿瘤疫苗的抗原表位VEGF、GnRH，及分子内佐剂M 2，具有更强的抗肿瘤功能。7. -种VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步 骤： (I) 根据权利要求4所述步骤构建宿主菌 (II) 通过乳糖诱导，超声破碎，硫酸铵分级沉淀来初步获得重组蛋白 (III) 通过DEAE-52离子交换层析分离出VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，该融合蛋 白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。
【文档编号】C12R1/19GK106085932SQ201610343170
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】曹荣月, 叶佳, 井亮亮, 李岩, 李曼曼, 苗梓韬, 刘淑君
【申请人】中国药科大学