疫印迹分析。
[0067] 实施例3抗人脂联素单克降抗体在免痔组化中的应用
[0068] 抗人脂联素单克隆抗体用于免疫组织化学，鉴定脂肪组织中脂联素的表达：将手 术中切除的人皮下脂肪组织浸泡于新鲜配制4%多聚甲醛固定液，经梯度乙醇脱水，石蜡包 埋和组织切片，切片用二甲苯中脱蜡，换2次，移入体积比为1 : 1的二甲苯和乙醇混合液 中，浸泡5分钟左右，移入系列乙醇梯度（100 %，95 %，80 %)水化，PBS漂洗，蒸馏水洗1次； 置3%H202孵育20分钟，高压锅内抗原修复，PBS洗3次X5分钟，山羊血清室温封闭，加 鼠抗人脂联素单克隆抗体混合液（A63和C25)37°C孵育2h，PBS洗3次。生物素化羊抗鼠 二抗37°C孵育30分钟，PBS洗3次，加SABC，37°C孵育30分钟，PBS洗3次，二氨基联苯胺 (DAB)显色10分钟，自来水冲洗，苏木素复染2分钟，盐酸乙醇分化2秒；脱水透明，中性树 胶封片；镜检，将图像通过光学显微镜（400X)观察并拍摄图像如图2所示，其中细胞胞浆 呈现棕黄色为阳性染色。
[0069] 因此，结果说明本发明单克隆抗体既可用于免疫组化定性检测组织细胞中脂联素 的原位表达，还可应用于评价脂肪细胞的分化成熟及内分泌功能。
[0070] 实施例4抗人总脂联素单克降抗体宙量检泖IELISA试剂盒的制各
[0071] 本发明人总脂联素定量检测ELISA试剂盒实验用液包括：（1)包被 液：0. 1MNaHC03-Na2C03(PH9. 6-9. 8)缓冲液，⑵磷酸盐缓冲液（PBS) :0. 01M Na2HP04-NaH2P04(PH7.2)缓冲液，（3)阻断液（1 %BSA-PBST) :1 %BSA-0.01M PBS-TWEEN-20,（4)洗涤液（PBS-T)，（5)抗体稀释液：取 1L0? 01MPBS加入BSA10g、牛y 球蛋白lg、Tween-20 0. 5ml、硫柳汞0. 2g，（6)酶结合物稀释液：取1L0. 01MPBS加入BSA 3g、硫柳汞0. 2g、TWEEN-200. 5ml，（7)底物应用液的配制：检测前10分钟，取TMB-HCL1片 (lmg片剂）加入10ml过硼酸钠溶液，混匀即用。（8)终止液：1M浓H2S04。
[0072] 本发明人总脂联素定量检测ELISA试剂盒的制备步骤为：
[0073] 1、人脂联素标准品制备：收集正常人血清100ml，4°C离心20分钟。取上清以美国 Phoenix的ELISA试剂盒检测其人脂联素含量，取均值作为人脂联素标准品母液浓度。添 加含0.01%硫柳汞并过滤除菌分装冻存于-80°0，以作为参比标准。使用时以1%854-?85 稀释配制成标准品及质控品的各浓度点，同时以PhoenixELISA标准品进行比对校正。
[0074] 2、ELISA夹心配对抗体的筛选：将制备的多种纯化单克隆抗体按棋盘式矩阵配 对，进行夹心结合试验，筛选最佳配对单克隆抗体。即分别以包被缓冲液稀释待配对单克 隆抗体（MAb)，按照10yg/ml浓度包被酶标板作固相抗体，同时生物素化后作为检测抗 体（MAb-B)，以抗体稀释液稀释至lyg/ml，分别加入脂联素标准0和10ng/ml进行夹心 结合，采用亲和素-辣根酶放大检测信号，TMB底物显色，进行配对试验，结果如表1可见， MAb4(C63)做包被抗体和MAbl(A25)做标记抗体的夹心配对，ELISA本底最低，信躁比（即 10ng/ml与Ong/ml的0D值之比）最高，从而选择这两种单克隆抗体制备具有最佳动力学反 应曲线的生物素-亲和素放大酶联免疫（BA-ELISA)检测试剂盒。
[0075] 表1双抗体夹心配对试验结果
【主权项】
1. 一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为6C3-I或C2001，其中，杂交瘤细胞株 6C3-I的保藏号为CGMCCNo. 9908 ;杂交瘤细胞株C2001的保藏号为CGMCCNo. 9568。
2. -种抗人脂联素单克隆抗体A25或C63,其中，所述抗人脂联素单克隆抗体A25由保 藏号为CGMCCNo. 9568的杂交瘤细胞株C2001产生； 所述抗人脂联素单克隆抗体C63由保藏号为CGMCCNo. 9908的杂交瘤细胞株6C3-I产生。
3. 根据权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步 骤： 1) 制备抗人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株； 2) 检测单克隆抗体； 3) 将杂交瘤的克隆化及扩大培养； 4) 大量生产、纯化和鉴定单克隆抗体的性质。
4. 如权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体在生物样本中定量和/或定性检测人脂 联素分子中的应用； 优选地，所述人脂联素分子为人总脂联素分子； 优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子； 进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和 高分子12-18聚体或更高聚体； 优选地，所述生物样本为生物学液体样本，优选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、 乳汁、组织细胞提取液或细胞培养上清； 优选地，所述检测的方法为半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法或定量的ELISA法。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法为ELISA方法，该方法包括以下步骤： (1) 进行夹心结合试验，在单克隆抗体A25和C63中选择最佳配对单克隆抗体； (2) 将两种单克隆抗体中的一种作为固相抗体，使用酶标板包被，另一种作为标记抗 体，使用生物素标记； (3) 加入酶标亲和素，检测被结合的标记； 优选地，所述生物样本为生物学液体样本，优选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、 乳汁、组织细胞提取液或细胞培养上清。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，使用单克隆抗体C63作为固相抗体，A25作为标 记抗体。
7. 如权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体在组织/细胞中检测人脂联素蛋白表达 的方法中的应用，优选地，所述方法为免疫组化法；优选地，所述样本为培养的细胞或组织 活检样本。
8. -种检测人总脂联素的试剂盒，所述试剂盒中包含如权利要求2所述的抗人脂联素 单克隆抗体； 优选地，所述检测试剂盒为ELISA试剂盒；更优选地，所述ELISA试剂盒中的ELISA采 用双抗体夹心的非竞争结合法；进一步优选地，所述ELISA中引入BA放大系统。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述ELISA试剂盒包括： 用于捕获待测样品中的抗人脂联素单克隆抗体C63 ; 生物素标记的人脂联素单克隆抗体A25 ; 系列包含已知浓度的人脂联素标准品溶液和质控品； 酶标亲和素； 检测酶标亲和素的工具； 优选地，所述试剂盒还包括包被液、磷酸盐缓冲液、阻断液、洗涤液、抗体稀释液、酶结 合物稀释液、底物应用液和/或终止液； 优选地，所述ELISA试剂盒为定量检测试剂盒。
10.如权利要求9所述的试剂盒在临床样品检测中的应用，所述试剂盒用于定量和/或 定性检测生物样本中人总脂联素；优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联 素分子，进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体 和高分子12-18聚体。优选地，所述临床样品检测为大批量检测；更优选地，所述待测样品 为生物学液体样本，选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁、组织细胞提取液或细胞培 养上清。
【专利摘要】本发明提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为保藏号为CGMCC No.9568的C2001或保藏号为CGMCC No.9908的6C3-Ⅰ，以及所述杂交瘤细胞株产生的抗人脂联素单克隆抗体A25或C63，本发明提供的抗人脂联素单克隆抗体可以用于在生物样本中定量或定性检测人总脂联素。本发明还提供了一种人总脂联素的检测试剂盒。本发明的人脂联素单克隆抗体质地均一、特异性强。本发明的检测人总脂联素的试剂盒可根据用途进行灵敏度和检测范围调控，不仅适用于血中人脂联素含量的测定，而且高敏BA-ELISA适宜检测唾液、尿液、乳汁、尿液及关节液以及脂肪细胞培养上清的脂联素水平。CGMCC No.990820141103 CGMCC No.956820140818
【IPC分类】G01N33-577, C12R1-91, C12N5-20, G01N33-68, C07K16-24
【公开号】CN104694478
【申请号】CN201410637736
【发明人】黎明, 邱贵兴, 范中杰, 王颖, 阴津华, 徐璐
【申请人】中国医学科学院北京协和医院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年11月6日