一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：(1)用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻2～4次，洗涤干净的螺旋藻经压力为200～400kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5～6min，超声波处理12?15min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中离心10～18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4～5℃下储存；(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾钠，彻底搅拌1～2h，静置过夜使两相分开，收集上相；(3)采用膜孔径为3～5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，制得双水相萃取藻蓝蛋白。本发明分离效果好，过滤分离回收率高，产品质量高，运行成本低。
【专利说明】
一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法
技术领域
[0001 ]本领域涉及天然产物深加工技术领域，尤其是涉及一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水 相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]藻蓝蛋白是一种天然蓝色色素，已作为食物色素添加在软饮料，口香糖，唇膏，眼 线等产品中。高纯度的藻蓝蛋白因其具有高效的荧光性，被作为生物化学探针应用在免疫 分析研究。藻蓝蛋白具有抗氧化、增强机体免疫力、保肝护肝、抗癌、抗炎等诸多生理活性， 具有重大的潜在药用开发价值。藻蓝蛋白主要从螺旋藻、鱼腥藻等藻类中提取纯化得来，不 同纯度(A620/A280)的藻蓝蛋白有不同的用途。
[0003]葡聚糖dextran，glucan又称右旋糖酐。为一种多糖。存在于某些微生物在生长过 程中分泌的粘液中。葡聚糖具有较高的分子量，主要由D-葡萄吡喃糖以a，1-6键连接，支 链点有1 - 2、1 - 3、1 - 4连接的。随着微生物种类和生长条件的不同，其结构也有差别。 八620/六280大于等于0.7时，澡监蛋白为食品级;六620/六280大于等于3.9时，澡监蛋白为反应 级;A620/A280大于等于4.0时，藻蓝蛋白为分析级。藻蓝蛋白具有十分广阔的应用前景，但 繁琐的纯化步骤不仅制约着它的大规模生产也导致其价格昂贵。食品级藻蓝蛋白的价格约 为0.13美元/mg，分析级的藻蓝蛋白价格为1-5美元/mg。
[0004] 葡聚糖是以葡萄糖为组成糖的多糖的总称。由于D-葡萄糖残基彼此间结合样式的 不同而分为多种，广泛分布于微生物、植物、动物界。其中代表性的有细菌的多缩葡萄糖（由 a_l，6键的主链上支出以a-1，4和a-1，6键的侧链），褐藻类的海带多糖（lami-narin)(主要 以0-1，3键），地衣类的木聚糖⑴-1，4和0-1，3键），高等植物的纤维素、(0-1，4结合），直链淀 粉(a-1，4键），支链淀粉（由a-1，4键的主链上支出a-1，6键的侧链），动物的糖原等。藻蓝蛋 白是从藻类中分离出的一种深蓝色物质.它既是一种蛋白质，又是一种极好的天然食用色 素，同时还是良好的保健食品，具有很高的营养价值和医疗价值。传统的从蓝藻中提取分离 藻蓝蛋白的方法多采用盐析沉淀法，包括沉淀、离心和透析3个主要操作环节，这在实际工 业化生产中存在操作步骤繁琐、动力能耗高及操作周期长等缺点。Albertsson于20世纪50 年代后期开发了双水相萃取法。70年代以后，双水相萃取技术在生物分离过程中得到广泛 应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径，具有良好的发展前景。
[0005] 目前，缺乏一种分离效果好，过滤分离回收率高的葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃 取分离藻蓝蛋白的方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种分离效果好，过滤分离回收率高的葡 聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
[0007] 为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种葡聚糖和酒石 酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)制备藻蓝蛋白粗提取液:用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻2~4次，洗涤干净的螺旋 藻经压力为200~400kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5~6min，超声波处理12-15min，将破碎 的螺旋藻悬浊液于离心机中离心1 〇~18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于 4~5 °C下储存；
[0009] (2)双水相萃取：向步骤（1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾 钠，彻底搅拌1~2h，静置过夜使两相分开，收集上相；
[0010] (3)采用膜孔径为3~5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20~ 26小时，再于-13~-8°C冷冻干燥8~15小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。
[0011] 进一步地，在步骤(1)中，所述离心速率为800~1000r/min。
[0012]进一步地，在步骤⑵中，所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的9~13%。
[0013] 更进一步地，在步骤(2)中，所述酒石酸钾钠为双水相体系总质量的16~25%。
[0014] 进一步地，在步骤(2)中，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的65~ 70% 〇
[0015] 进一步地，在步骤（3)中，所述滤膜的流速为150mL/min，渗透通量为58.5L/(h ? m2)〇
[0016] 有益效果:本发明分离效果好，过滤分离回收率高，产品质量高，运行成本低;过程 无需添加化学药品、溶媒溶剂，不带入二次污染物质;设备可自动运行，稳定性好，容易实现 工业化需求。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0018] (1)本发明的双水相萃取与其他分离方法相比，具有易放大、操作时间短、成相物 质对待分离的生物活性物质无毒负作用等优点。在双水相体系中，待分离的组分选择性分 配于其中一相，而其他杂质组分分配于另一相中，因此使待分离组分的浓度和纯度都得到 提高。其中影响双水相萃取的因素很多，主要有:聚合物种类、聚合物平均分子质量和浓度、 成相无机盐种类和浓度、离子强度、pH值等等。
[0019] (2)本发明的双水相体系用于萃取螺旋藻细胞破碎液中藻蓝蛋白，经一次萃取藻 蓝蛋白收率可达90.6%，分配系数达到8.03,分离因数达到6.5。结果证实螺旋藻藻蓝蛋白 在该体系中的分配系数和分离因数均较高。
[0020] (3)超/微滤膜过滤与传统过滤的不同在于不同分子质量的化合物可通过膜进行 有效分离，这个过程是一种物理过程，不发生相的变化，不需要添加助剂。
【附图说明】
[0021 ]图1为破壁后螺旋藻溶液的紫外-可见吸收图；
[0022] 图2为酒石酸钾钠饱和度对藻蓝蛋白纯度的影响图；
[0023] 图3为pH值对双水相体系及藻蓝蛋白萃取的影响图。
【具体实施方式】
[0024]以下通过实施例和说明书附图进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是 本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
[0025] 实施例1
[0026] 本发明的一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步 骤：
[0027] (1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻2次，洗涤干净的螺旋藻 经压力为200kg/cm 2的高压细胞勾衆机破碎5min,超声波处理15min,将破碎的螺旋藻悬池 液于离心机中离心15min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4°C下储存;所述搅 摔转速为800r/min。
[0028] (2)双水相萃取：向步骤（1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾 钠，彻底搅拌lh，静置过夜使两相分开，收集上相;所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的 9%。酒石酸钾钠为双水相体系总质量的16%。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总 质量的68%。
[0029] (3)采用膜孔径为3um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20小时， 再于-13°C冷冻干燥8小时得藻蓝蛋白粉末。所述滤膜的流速为150mL/min，渗透通量为 58.5L/(h ? m2)〇
[0030]如图1所示，图1为破壁后螺旋藻溶液的紫外-可见吸收图，藻蓝蛋白溶液在280nm 和620nm处有最大吸收波长，螺旋藻蛋白在280nm处有最大吸收峰，藻蓝蛋白在620nm处有最 大吸收峰，冻融破壁后螺旋藻溶液中藻蓝蛋白纯度为0.4,其中螺旋藻杂蛋白含量较多。 [0031] 实施例2
[0032]实施例2与实施例1的区别在于:本发明的一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分 离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
[0033] (1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻3次，洗涤干净的螺旋藻 经压力为300kg/cm 2的高压细胞匀浆机破碎5.5min，超声波处理12min，将破碎的螺旋藻悬 浊液于离心机中离心10min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于5°C下储存;所述 搅拌转速为900r/min。
[0034] (2)双水相萃取：向步骤（1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾 钠，彻底搅拌2h，静置过夜使两相分开，收集上相;所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的 10%。酒石酸钾钠为双水相体系总质量的21 %。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系 总质量的70 %。
[0035] (3)采用膜孔径为4um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为24小时， 再于-8°C冷冻干燥15小时得藻蓝蛋白粉末。所述滤膜的流速为150mL/min，渗透通量为 58.5L/(h ? m2)〇
[0036] 实施例3
[0037] 实施例3与实施例1的区别在于:本发明的一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分 离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻4次，洗涤干净的螺旋藻 经压力为400kg/cm 2的高压细胞勾衆机破碎6min，超声波处理14min,将破碎的螺旋藻悬池 液于离心机中离心18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4.5°C下储存;所述 搅拌转速为l〇〇〇r/min。
[0039] (2)双水相萃取：向步骤（1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾 钠，彻底搅拌1.5h，静置过夜使两相分开，收集上相;所述葡聚糖质量为双水相体系总质量 的13%。酒石酸钾钠为双水相体系总质量的25%。含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体 系总质量的65 %。
[0040] (3)采用膜孔径为5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为26小时， 再于-10°c冷冻干燥12小时得藻蓝蛋白粉末。所述滤膜的流速为150mL/min，渗透通量为 58.5L/(h ? m2)〇
[0041] 试验 1
[0042] 酒石酸钾钠质量分数对C 一 PC分配影响
[0043] 酒石酸钾钠质量分数对C 一 PC分配影响如表1所示，
[0044] 表 1
[0047]由表1所示，当葡聚糖的质量分数一定时，酒石酸钾钠质量分数为16%，pH值为 6.2，室温条件下，当酒石酸钾钠低于某一用量时不能形成双水相体系，随着酒石酸钾钠质 量分数增加，相比值逐渐减小，分配系数、纯度和回收率逐渐增大。当酒石酸钾钠质量分数 为21 %时，C一 PC的分配系数、纯度和收率最高，然后逐渐减小。造成这种现象的原因可能 是，酒石酸钾钠的质量分数增加，下相的盐析作用增加，使C 一 PC由下相向上相迀移。但酒石 酸钾钠的质量分数过高时，下相盐析作用过强，破坏C-PC表面的水化层，C-PC被部分或全 部析出。再者，在葡聚糖质量分数不变的情况下，随着酒石酸钾钠质量分数在一定范围内的 提高，双水相体系逐渐远离临界点，物质在两相中界面张力增大，有利于藻蓝蛋白在上相富 集，多糖在下相富集；当酒石酸钾钠质量分数更大时，上相体积逐渐减小，上相体积逐渐减 小，同时粘度逐渐增大，不利于藻蓝蛋白的在上相的富集。C 一 PC的迀移能力受到限制，不利 于C-PC的富集。
[0048] 如图2所示，10 %~30 %酒石酸钾钠析得到的藻蓝蛋白纯度较低，30 %~45 %酒石 酸钾钠析出藻蓝蛋白，藻蓝蛋白纯度逐渐增加，大于45%饱和度酒石酸钾钠盐析藻蓝蛋白 纯度变化不大。确定：10 %~30 %之间的酒石酸钾钠饱和度可以用来除去大量螺旋藻杂蛋 白，大于40%饱和度的酒石酸钾钠用于沉淀藻蓝蛋白和藻蓝蛋白的富集纯化。
[0049] 试验 2
[0050] 葡聚糖质量分数对藻蓝蛋白萃取的影响
[0051] 表 2
[0053] 从表2可以看出，葡聚糖质量分数的变化对藻蓝蛋白萃取率和纯度均有影响。当葡 聚糖的质量分数为11%时，藻蓝蛋白萃取率达到了 94.3%，纯度达到了 0.77。
[0054] 由试验2可知，葡聚糖与酒石酸钾钠形成的双水相体系中，上相为葡聚糖相，下相 为酒石酸钾钠盐相。当葡聚糖的浓度大于其成相临界点的浓度时，系统远离临界点，系线长 度增大，两相性质的差别也增大，同时蛋白质在两相中的界面张力差别增大，使其趋于向一 侧分配。在葡聚糖-酒石酸钾钠双水相体系中，酒石酸钾钠浓度的增高会使下相盐析作用加 强，下相中的藻蓝蛋白向上相转移，并富集于上相。当富集到上相的藻蓝蛋白浓度超过其溶 解度时，藻蓝蛋白就会被析出而分布在上下相之间，造成萃取率下降。同时，当葡聚糖相对 分子质量较大时，由于其极强的吸水能力，会导致下相酒石酸钾钠浓度增大，上相自由水含 量降低，也会造成部分蛋白质在上下相之间析出。当葡聚糖的相对分子质量为4000u-6000u 时，下相中没有检测到藻蓝蛋白，但上下相之间有藻蓝蛋白析出。选择适宜的葡聚糖相对分 子质量及酒石酸钾钠浓度对于提高藻蓝蛋白的萃取率非常重要。
[0055] 试验 3
[0056] 离子强度对双水相体系及藻蓝蛋白萃取的影响
[0057]双水相体系上下相间存在电位差，通过加入不同种类和浓度的盐可以使得体系的 电荷状态和疏水作用发生改变，进而对物质在两相中的分配产生显著影响。配置葡聚糖质 量分数为11%，酒石酸钾钠的质量分数为21%的体系，并考察分别添加不同浓度的NaCl情 况下对藻蓝蛋白萃取的影响如表2所示，
[0058]表3
[0060]由表3可知，随着NaCl浓度的升高，上相中藻蓝蛋白纯度与分离回收率都先升高后 降低。当葡聚糖的质量分数为10%，酒石酸钾钠的质量分数为16%时，与未添加NaCl的体系 相比，添加质量分数为1.0%的NaCl情况下，上相中藻蓝蛋白纯度与分离回收率都较高。 [0061 ]试验 4
[0062] pH值对双水相体系及藻蓝蛋白萃取的影响
[0063] 双水相体系pH值变化能改变两相的点位，并影响蛋白质带点性质，从而影响藻蓝 蛋白在两相中的分配。配制酒石酸钾钠的质量分数为18%，葡聚糖的质量分数为12%的双 水相体系，体系pH为5.8~6.3。由于藻蓝蛋白较稳定的pH范围为4.5~8.5，因此调节体系pH 分别为4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 值对双水相体系及藻蓝蛋白萃取的影响如图3所示，随着 双水相体系pH的升高，上相中藻蓝蛋白的纯度与分离回收率都呈降低趋势。而体系原始的 pH约为6.2。
[0064]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明 要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一种葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 制备藻蓝蛋白粗提取液:用蒸馏水清洗新鲜的螺旋藻2~4次，洗涤干净的螺旋藻经 压力为200~400kg/cm2的高压细胞匀浆机破碎5~6min，超声波处理12-15min，将破碎的螺 旋藻悬浊液于离心机中离心10~18min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4~5 °(：下储存； (2) 双水相萃取：向步骤（1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和酒石酸钾钠，彻 底搅拌1~2h，静置过夜使两相分开，收集上相； (3) 采用膜孔径为3~5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20~26小 时，再于-13~_8°C冷冻干燥8~15小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。2. 根据权利要求1所述葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征 在于:在步骤(1)中，所述离心速率为800~1000r/min。3. 根据权利要求1所述葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征 在于:在步骤(2)中，所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的9~13%。4. 根据权利要求1所述葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征 在于:在步骤(2)中，所述酒石酸钾钠为双水相体系总质量的17~25%。5. 根据权利要求1所述葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征 在于:在步骤(2)中，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的65~70%。6. 根据权利要求1所述葡聚糖和酒石酸钾钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征 在于:在步骤(3)中，所述滤膜的流速为150mL/min，渗透通量为58.5L/(h · m2)。
【文档编号】C07K1/14GK105820237SQ201610239713
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】高志刚, 汪世军, 王峰
【申请人】东台市赐百年生物工程有限公司