一种筛选pd-1抗体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种筛选PD?1抗体的方法，所述方法包括：将人PD?1和PD?L1全长基因分别构建到慢病毒表达载体中；然后分别转染到T和B淋巴细胞株；筛选出稳定表达的淋巴细胞；随后加入PD?1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE共同孵育48小时；最后根据上清中IL?2含量的高低筛选所需的PD?1单克隆抗体。本发明方法与SEB刺激全血分泌IL?2的实验相比，在重复性和精确度方面更加优越，并且显著降低了实验成本，减少了操作人血液带来的各种潜在风险。
【专利说明】
一种筛选PD-1抗体的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种筛选抗体的方法，具体涉及一种筛选ro-i抗体的方法。
【背景技术】
[0002] T细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗 原特异性的，由主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC)以及 与其结合的抗原肽被T细胞受体（T cell receptor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向 T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC)和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提 供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，其中CD28是一种表达在T细 胞表面的重要共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。当TCR与MHC-抗原肽复合物 结合后，如果共刺激分子缺乏，将导致T细胞对特异的抗原表现为无能状态，不仅不能被激 活，而且对抗原特异性的活化信号均不应答；如果共刺激分子如CD28与B7分子结合并激活 后，可在多个水平上介导T细胞的活化。活化的T细胞可以自分泌和旁分泌的形式产生白细 胞介素2 (interleukin 2 ;IL-2)，作用于细胞表面的受体IL2R，进一步刺激T细胞的增殖， 从而为发挥效应功能做好准备。
[0003] PD-1 (⑶279)是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白， 最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤中克隆，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死 亡-1 (programmed death-1，ro-1)。ro-1是在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达的 CD28家族的抑制性成员（Okazaki 等（2002)Curr Opin Immunol 14:391779-82 ;Bennett等 (2003) J Immunol 170:711-8)，该家族还包括CD28、CTLA-4、IC0S和 BTLA等。PD-1 在活化的 B 细胞、T 细胞和髓样细胞上表达（Okazaki 等（2002) Curr. Opin. Tmmunol. 14:391779-82 ; Bennett等（2003)J Immunol 170:711-8)。ro-1含有接近膜的免疫受体酪氨酸抑制 基序（IHM)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序（ITSM) (Thomas，M. L. (1995) J Exp Medl81:1953-6 ;Vivier，E 和 Daeron，M(1997) Immunol Todayl8:286-91)。虽然与 CTLA-4 结构类似，但ro-1蛋白因缺乏介导CD28/CTLA-4与B7-1/B7-2相结合的MYPPPY序列，以及 介导IC0S与IC0S-L相结合的FDPPPF序列，因而在结构上与CD28、CTLA-4及IC0S存在明 显差异。因此，PD-1与配体的结合非常特异，不与其他的B7家族分子产生交叉结合。
[0004] 现已鉴定了 ro-1 的两种配体，分别是 ro-Ll (B7-H1)和 TO-L2 (B7-DC) (Latchman 等（2001) Nat Tmmuno 12:261-8 ;Carter 等（2002) Eur J Immunol32:634-43)。PD-L1 属于 B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体H)-l相互 作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；该分子具有宽广的组织表达谱，广泛表 达于抗原提呈细胞（APCs)、活化T/B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上 皮细胞。PD-L1在许多人类肿瘤组织中均可检测到ro-Li蛋白的表达，且许多癌组织较正常 组织中的H)-L1表达水平明显上调（Dong等人（2002)Nat. Med 8:787-9)。应用免疫组织 化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺 癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到ro-Li蛋白的表达，且ro-Li的表达水平 和患者的临床及预后紧密相关。许多研究均表明ro-Li与肿瘤的免疫逃逸机制相关。研究 表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的apc表达的ro-Li均可经ro-i/PD-Li信号通路抑制肿 瘤抗原特异性T细胞的活化，下调t细胞介导的肿瘤免疫应答。大量实验证明，阻断ro-i/ PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增值，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，有效抑制肿 瘤生长。因此，干预ro-1/PD-Li信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。
[0005]目前，对ro-1单克隆抗体进行体外评价的模型往往需要使用新鲜抗凝的人血液 或从人血中分离的白细胞，人血液来源比较困难，不仅成本较高而且存在潜在的生物危害 性。因此，建立一种稳定可靠的、能够在体外长期传代培养的细胞模型来评价ro-i抗体的 功能，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于，提供一种利用传代细胞筛选ro-i单克隆抗体的方法，该方法 能有效的筛选出特异性结合ro-i并促使淋巴细胞分必出il-2的单克隆抗体，且本发明方 法无需使用血液。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种筛选ro-i单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
[0009] 1、将人ro-i和ro-Li全长基因构建到慢病毒表达载体中；
[0010] 2、将构建好的ro-1表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到T淋巴细胞株；将 构建好的ro-Li表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到b淋巴细胞株；
[0011] 3、用抗生素G418筛选出稳定表达ro-1的T淋巴细胞和稳定表达ro-Ll的B淋巴 细胞；
[0012] 4、稳定表达ro-1的T淋巴细胞和稳定表达ro-Ll的B淋巴细胞按照合适的比例 混合后，加入梯度稀释的ro-1单克隆抗体和T细胞超抗原SEE，然后共同孵育48小时；
[0013] 5、用ELISA法检测细胞培养上清中的IL-2含量，根据IL-2含量的高低筛选所需 的ro-i单克隆抗体。
[0014] 较佳的，所述载体为pLV-IRES-Neo载体。
[0015] 较佳的，步骤4中，所述T淋巴细胞与B淋巴细胞按照1:1的细胞个数比混合。
[0016] 较佳的，所述的T淋巴细胞株选自来源于小鼠、大鼠或人的在体外培养条件下可 以稳定传代的T淋巴细胞株；所述的B淋巴细胞株选自来源于小鼠、大鼠或人的在体外培养 可以稳定传代的B淋巴细胞株。优选所述的T淋巴细胞株为人T淋巴细胞株Jurkat ;所述 的B淋巴细胞株为人B淋巴细胞株Raji。
[0017] 实验表明，PD-1单克隆抗体Nivolumab能够显著增强Raji细胞和SEE刺激Jurkat 细胞的IL-2分泌，并且这种作用具有剂量依赖性；另外，这种方法与SEB刺激全血分泌 IL-2的实验相比，在重复性和精确度方面更加优越，并且显著降低了实验成本，减少了操作 人血液带来的各种潜在风险，达到了本发明的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是转染后Jurkat细胞表面H)-l的相对表达；
[0019] 图2是转染后Raj i细胞表面PD-L1的相对表达；
[0020] 图3是抗H)-l抗体的SEB刺激全血实验；
[0021] 图4是SEE刺激Jurkat-PD-1和Raji-PD-Ll的混合细胞反应。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实 施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基 因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambr 〇〇k， J. , Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0023] 实施例1.人源ro-i、PD-L1和ro-L2表达载体的构建以及抗体的表达
[0024] 人源ro-1和PD-L1的全长基因购买自北京义翘神州生物技术有限公司，其序列与 Gene Bank中公布的序列完全相同（ID分别为：NM_005018.2和NM_014143.2)。PCR均采用 高保真DNA聚合酶（例如：Takara公司的PrimeSTARK HS DNA Polymerase)。扩增ro-l和 PD-L1全长基因反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95°C 20秒；55°C 10秒， 72°C 1分/kb ;30个循环。扩增H)-l和PD-L1全长基因所用引物序列如下：PD-1正向引物： TATGAATTCGCCACCATGCAGATCC CACAGGCGCCCTG，PD-1 反向引物：ATAGCGGCCGCTCAGAGGGGCCAA GAGCAGTGTCC ;PD-L1 正向引物：TATGAAITCGCCACCATGAGGATAITTGCTGTCTTTAT，PD-L1 反向引 物：ATAGCGGCCGCTTACGTCTCCTCCAAATGTGTAT。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆 到pLV-IRES-Neo载体中（购自北京英茂盛业生物科技有限公司），测序验证后确认获得了 正确的克隆。本例中的正确克隆分别记作pLV-IRES-Neo-PD-1和pLV-IRES-Neo-PD-Ll 〇
[0025] 作为阳性参照物的]^-1单克隆抗体Nivolumab (Bristol-Myers Squibb公司 产品）和Pembrolizumab的序列根据WHO所公布的氨基酸序列（http://www.who.int/ medicines/publications/druginformation/en/)由苏州金唯智生物技术服务有限公司全 基因合成。抗体轻链和重链的编码序列构建到PCH01. 0载体中，表达载体转染CH0-S细胞 (Life technologies公司产品）以及重组蛋白的表达与纯化方法按照细胞供应商提供的 说明书实施。
[0026] 实施例2.慢病毒载体的包装和转染靶细胞
[0027] 慢病毒的包装质粒pHl、pH2购自北京英茂盛业生物科技有限公司，其 编码慢病毒转染和整合所必需的蛋白，J1EK293细胞作为包装病毒颗粒的宿主细 胞。 用 Lipofectamine2000(购自 Life Technologies)将 pLV-IRES-Neo-PD-1 和 pLV-IRES-Neo-PD-Ll分别与包装质粒pHl和pH2的混合物（pHl与pH2的质量比为1 : 1)转染到J1EK293细胞中，表达载体、包装质粒的质量比为1 :1。转染具体步骤为：转染 前24小时将HEK293细胞接种到6孔板中，每孔2ml细胞悬液共106个细胞；转染时将 1. 5 y 1浓度为1 y g/y 1的慢病毒表达载体以及1. 5 y 1浓度为1 y g/y 1的慢病毒包装 质粒稀释到150 y lOptiPRO? SFM(购自Life Technologies)中，轻轻混匀；将10 y 1转 染试剂Lipofectamine2000稀释到150 y 10ptiPR0?SFM中，轻轻混匀；立即将稀释后的 Lipofectamine2000溶液慢慢加入到稀释后的DNA溶液中，加入时枪头浸于液面之下并慢 慢排出液体；立即上下颠倒数次使溶液混匀，室温下孵育5分钟左右以使DNA-脂质体复合 物形成；将300 y 1 DNA-Lipofectamine2000复合物逐滴加入到上述培养细胞的6孔板中， 边加边轻摇培养板；转染后的细胞培养物置于37°C、5% 0)2的饱和湿度的细胞培养箱中培 养48小时。
[0028] 靶细胞转染过程如下：48小时后用0. 45 y mMi 1 lex-HV过滤器（Mi 11 ipore产 品）过滤转染后的HEK293细胞培养液上清，将过滤好的上清分别加入到Jurkat和Raji 细胞培养物中，Jurkat和Raji的细胞密度均为5X10 5个/ml ;然后加入转染增强剂 Po 1 ybrene (Sigma公司产品），使其终浓度为5 y g/ml ;继续置于37 °C、5 % C02的饱和湿 度的细胞培养箱培养48小时；离心收集感染后的Jurkat和Raji细胞，分别用含有lmg/ 11116418(上海生工产品）的1?^11640完全培养液〇?^11640基本培养基+10%胎牛血清 ； 两者均购自Life Technologies)重悬细胞，继续培养7天；7天之后，为转入外源基因的细 胞将会被G418杀死，而转染外源基因的细胞因为同时表达外源基因和新霉素抗性基因（其 产物能够将G418灭活）而存活下来并不断增殖。最终将稳定转染了 H)-l的Jurkat细胞 和转染了 H)-L1的Raji细胞分别命名为Jurkat-PDl和Raji-PD-Ll。
[0029] 实施例3.流式细胞法检测细胞表面目的蛋白的表达情况
[0030] Jurkat-PDl细胞表达H)-l的情况用流式细胞仪确定，只转染空载体的Jurkat作 为对照细胞，具体步骤如下：离心收集各种细胞，用含有5% (质量分数）牛血清白蛋白的 磷酸盐缓冲液（以下简称 PBSB:135mM NaCl，2. 7mM KC1，1. 5mM KH2P04,8mM K2HP04,5% 牛血 清白蛋白；pH 7. 2)将细胞密度调整到5X105个/ml ;将细胞悬液分成两份，每份lml，其中 一份加入终浓度为1 y g/ml的Nivolumab (ro-l单克隆抗体，本实验室内部制备），另一份 不加；室温孵育1小时后，离心收集细胞弃上清，用PBS将细胞洗涤三遍，最后每份样品用 lmlPBSB重悬；加入FITC标记的羊抗人IgG二抗（Fc特异；Sigma公司产品），室温孵育30 分钟；离心收集细胞弃上清，用PBS将细胞洗涤三遍，最终用PBS重悬细胞；流式细胞仪检 测荧光强度。实验结果如图1所示，Jurkat-PDl的H)-l表达量明显高于只转染空载体的 Jurkat 细胞。
[0031] Raji-PD-Ll细胞表达H)-L1的情况用流式细胞仪确定，只转染空载体的Raji细 胞分别作为对照细胞，具体步骤如下：离心收集各种细胞，用含有5%牛血清白蛋白的PBS 将细胞密度调整到5X10 5个/ml ;将将细胞悬液分成两份，每份lml，其中一份加入终浓度 为3 y g/ml的ro-1-hFc (H)-l胞外段与人IgG的Fc段的融合蛋白，R&D公司产品），另一 份不加；室温孵育1小时后，离心收集细胞弃上清，用PBS将细胞洗涤三遍，最后每份样品用 lmlPBSB重悬；加入FITC标记的羊抗人IgG二抗（Fc特异；Sigma公司产品），室温孵育30 分钟；离心收集细胞弃上清，用PBS将细胞洗涤三遍，最终用PBS重悬细胞；流式细胞仪检 测荧光强度。实验结果如图2所示，Raji-PD-Ll的H)-L1表达量明显高于只转染空载体的 Raji细胞。
[0032] 实施例4.葡萄球菌肠毒素 B刺激全血实验
[0033] 葡萄球菌肠毒素B (Staphylococcal Enterotoxin B，SEB)是一种T细胞超抗原， 能直接与MHC-II类分子和某些亚型的TCR-V区结合，可刺激T细胞总数的5~20%，，具有 强烈的激活T细胞（CD4 +T细胞）的作用。此实施例的目的是要检测H)-l单克隆抗体能否 进一步增强SEB激活的T细胞对白介素（interleukin 2，IL-2)的分泌。具体实施步骤如 下：用无血清RPMI1640培养基将采自健康志愿者的新鲜抗凝血按1:5稀释，然后将稀释好 的血液接种到96孔圆底培养板（Coring公司产品），每孔100 y 1 ;在相应孔中加入50 y 1 梯度浓度的ro-l单克隆抗体Nivolumab或Pembrolizumab，置于细胞培养箱中孵育30-60 分钟；每孔中加入50y 1 SEB，使其终浓度为100ng/ml ;置于细胞培养箱中继续培养2-4天； 取细胞培养物上清用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定 上清中IL-2的含量。
[0034] ELISA法测定上清中IL-2含量的具体实施步骤如下：大鼠抗人的IL-2捕获抗体 (BD Biosciences公司产品）用0. 05M碳酸盐缓冲液（pH 9. 6)稀释成2μg/ml，96孔酶 标板（Corning公司产品）每孔添加100 y 1上述稀释后的抗体溶液，置于37°C恒温箱中孵 育2小时；用洗涤缓冲液（含有0. 05% Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟； 然后加入封闭液（含有5%脱脂奶粉的0. 05M碳酸盐缓冲液；pH 9. 6)，于4°C冰箱内过夜； 次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；将稀释4倍的100 y 1上清加于上 述已包被的反应孔中，置37°C孵育1小时；用洗涤缓冲液洗涤后，加浓度1 μg/ml的生物 素化大鼠抗人的IL-2检测抗体（BD Biosciences公司产品）于各反应孔中，每孔100 y 1， 37°C孵育1小时；洗涤缓冲液洗涤后，加浓度1 y g/ml的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 (Streptavidin-HRP，BD Biosciences 公司产品）于各反应孔中，每孔 100 yl，37°C孵育 1 小时；用洗涤缓冲液洗涤后，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 y 1显色，37°C 放置10~30分钟；于各反应孔中加入2M硫酸50 y 1终止反应；置SpectraMax i3酶标仪 (美国Molecular Devices公司产品）测定450nm波长处吸光值。
[0035] 实验结果如图3所示（所示为三次独立重复实验的平均值），两个阳性对照抗 体Nivolumab和Pembrolizumab在此实验中均能够有效刺激IL-2的分泌，它们在SEB刺 激全血实验中的EC 5。分别为52. 25和55. 13 (单位ng/ml)，它们的95 %置信区间分别为 27. 41-99. 61和25. 87-117. 5,另外它们的R2 (反映拟合度的好坏，数值越接近1说明拟合 度越好）分别为〇? 9374和0? 9020。
[0036] 实施例5.葡萄球菌肠毒素E刺激Jurkat-PD-1和Raji-PD-Ll混合细胞实验
[0037] 葡萄球菌肠毒素E (Staphylococcal Enterotoxin E，SEE)也是一种T细胞超抗 原，能直接与MHC-II类分子和某些亚型的TCR-V区结合，具有强烈的激活T细胞（⑶4 +T细 胞）的作用。Jurkat细胞来源于人的T淋巴白血病细胞，而Raji来源于人的B淋巴白血病 细胞，它们仍然分别保留了 T和B淋巴细胞的性质，即Jurkat表达TCR而Raji表达MHC-II 类分子，SEE能够同时结合两种细胞上的TCR和MHC-II类分子，从而激活Jurkat细胞使其 分泌IL-2。此实施例的目的是要检测H)-l单克隆抗体能否进一步增强SEE和Raji激活的 Jurkat细胞对白介素（interleukin 2, IL-2)的分泌。具体实施步骤如下：
[0038] 离心分别收集 Jurkat-PD-1 和 Raji-PD-Ll 细胞，用含有 800 y g/ml 完全 RPMI1640 培养基将两种细胞的密度均调整到2X 105个/ml，然后将两种细胞等体积混合，混合培养 物中加入SEE使其终浓度为100ng/ml，混匀后接种到96孔圆底培养板（Coring公司产 品）中，每孔150 y 1 ;在相应孔中加入50 y 1梯度浓度的H)-l单克隆抗体Nivolumab或 Pembrolizumab，置于细胞培养箱中继续培养2天；取细胞培养物上清用ELISA法测定上清 中IL-2的含量。ELISA法检测IL-2浓度的方法与实施例4中所述相同。
[0039] 实验结果如图4所示（所示为三次独立重复实验的平均值），两个阳性对照抗体 Nivolumab 和 Pembrolizumab 在 SEE 刺激的 Jurkat-PD-1 和 Raji-PD-Ll 混合细胞反应中均 能够有效刺激IL-2的分泌，它们的EC5。分别为47. 94和44. 22 (单位ng/ml)，它们的95% 置信区间分别为39. 55-58. 11和35. 11-55. 70,另外它们的R2分别为0.9957和0.9929。另 外，我们的实验结果还显示，仅仅转染空载体的Jurkat和Raji-PD-Ll的混合细胞反应，以 及Jurkat-PD-1和仅仅转染空载体的Raji的混合细胞反应均不能有效刺激IL-2的进一步 分泌，这说明在两种细胞中分别同时转染ro-i和ro-Li是建立此模型的必要条件，相应结 果未予显示。
[0040] 图3和4的结果说明我们建立的混合细胞反应模型在平行性和精确度方面要优于 SEB刺激的全血实验。
【主权项】
1. 一种筛选ro-1单克隆抗体的方法，包括以下步骤： 1) 、将人ro-i和ro-Li全长基因分别构建到慢病毒表达载体中； 2) 、将构建好的ro-i表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到τ淋巴细胞株；将构 建好的ro-Li表达载体通过慢病毒转染的方法稳定转染到b淋巴细胞株； 3) 、用抗生素 G418筛选出稳定表达ro-i的τ淋巴细胞和稳定表达ro-Li的b淋巴细 胞； 4) 、筛选后的稳定表达ro-l的T淋巴细胞和稳定表达PD-L1的B淋巴细胞按照合适的 比例混合后，加入梯度稀释的ro-i单克隆抗体和T细胞超抗原SEE，然后共同孵育48小时； 5) 、检测细胞培养上清中的IL-2含量，根据IL-2含量的高低筛选所需的ro-Ι单克隆 抗体。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体为pLV-IRES-Neo载体。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤4中所述T淋巴细胞与B淋巴细胞按照 1:1的细胞个数比混合。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述的T淋巴细胞株为人T淋巴细胞株 Jurkat〇5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述的B淋巴细胞株为人B淋巴细胞株 Raji〇
【文档编号】C07K16/28GK105820247SQ201410853531
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月31日
【发明人】赵杰, 张成海, 朱玲巧
【申请人】三生国健药业（上海）股份有限公司