一种新型抗egfr单克隆抗体的制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明根据仓鼠偏爱密码子设计合成CMAB009抗体的轻链、重链，转染GS基因敲除的CHO-CR-GS-/-宿主细胞，并采用无血清培养技术培养。其中培养基pH为：6.5~6.9，温度为：33℃~36℃，渗透压为：290mOsm/kg~350mOsm/kg。分离纯化，获得低免疫原性CMAB009抗体，有利于临床应用。
【专利说明】
一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型抗EGFR单克隆抗体的 制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病中所致死 亡中居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率 高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程 度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提 商。
[0003] 正常细胞的增殖是通过各自的配体严格激活其生长因子受体来控制的，如生长因 子受体酪氨酸激酶。癌细胞也是生长因子受体的激活下增殖的，但失去了正常增殖的严格 控制。这种失控可能是由很多因素引起，如生长因子的过度表达或生长因子受体的过度表 达，以及由生长因子调控的生化途径的自发性激活。参与致癌的受体包括表皮生长因子受 体（EGFR)，来源于血小板的生长因子受体（PDGFR)，类胰岛素生长因子受体（IGFR)，神经生 长因子受体（NGFR)和成纤维生长因子受体（FGF)等。
[0004] 表皮生长因子受体（EGFR)也称作c-erbBl/HERl，其家族成员都是生长因子受体 酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与EGF或TGF a相 互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。已发现的该家族第一个成员是表观分子量为165KD的 糖蛋白。
[0005] EGFR在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要 的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中有表达。在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与 较差的预后和较低的生存率相关。由此可知，如果有药物能阻断EGFR的活性，那将会抑制 其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿 瘤疗效。在一些研究中，EGFR抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤株时， 表现出累加和协同作用。
[0006] EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、喹唑啉pyralo-/吡咯并-/ 吡啶并嘧啶、配体-毒素和免疫毒素联结物，以及反义核苷酸和EGFR/配体主导的疫苗等。
[0007] -些体内和体外实验显示抗EGFR抗体成功的抑制了表达EGFR的肿瘤细胞株的生 长。在实体瘤的治疗中，一些抗EGFR单克隆抗体单独应用或与传统治疗方法合并应用的治 疗结果令人鼓舞。
[0008] 糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分 子的结构和功能产生深远的影响，糖基化作为重要的翻译后加工过程，对蛋白质的正确折 叠、定位、免疫原性以及生物学活性有很大的影响。mAb的糖基化聚糖结构与抗体效应功 能之间密切相关，通过影响IgG分子与FcRs、Clq以及FcRn的结合而分别调节IgG分 子的抗体依赖细胞毒作用（ADCC)、补体依赖的细胞毒作用（CDC)以及半衰期。糖基化作 用还会影响mAb的安全性特征，特别是非人源聚糖，具有潜在的免疫原性。存在于Fab功 能区的聚糖可以同时影响此类药物的安全性和有效性特征。
[0009] 糖基化修饰高度依赖于细胞表达系统和亚克隆选择，细胞培养过程中的诸多因 素，如培养基的成分，培养条件均会影响糖基化，进而影响治疗性蛋白的生物学活性，疗效， 免疫原性以及药代动力学。
[0010] 在当前已上市的治疗型单克隆抗体中，绝大多数是通过重组DNA技术实现的，绝 大多数应用体外细胞培养的技术。由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性， 外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在 哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源 基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后修饰等过程，翻译后修 饰主要包括蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的 形成，翻译后修饰对于蛋白质的功能至关重要，要表达某些具有生物学功能的蛋白质如膜 蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶有时必须在哺乳动物细胞中进行。CH0细胞和小鼠 骨髓瘤细胞（NSO，SP2/0)表达系统已经成为当前治疗性抗体和Fc-融合蛋白的金标准 哺乳动物工程细胞。据统计，目前已批准上市的治疗性单抗中，48 %表达于CH0细胞，而 45 %表达于鼠源细胞（21 % NS0细胞，14 % SP2/0细胞，10 %杂交瘤细胞)。尽管多肽链 的完整性在不同的表达系统和培养条件下看似不会发生变化，但糖基化类型的重大改变不 容忽视。
[0011] Cetuximab (Erbitux?, C225单抗），是一种特异性祀向细胞表皮生长因子受 体（EGFR)的重组人鼠嵌合单克隆抗体，被多个国家批准用于转移性结直肠癌和头颈鳞状 细胞癌治疗。然而，多项研究报道，该药在临床应用中发生超敏反应发生率极高。大多数发 生超敏反应的患者血清中存在药物特异性的IgE抗体，该IgE抗体特异性抗a-Gal.进 一步的研究发现，Erbitux?由哺乳动物细胞(小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)培养制备获得，这种 鼠源细胞系含有一种额外的a 1，3半乳糖苷转移酶，主要是介导半乳糖残基从a构象的 UDP-Gal转移到末端半乳糖残基上，进而生成a-Gal。a-Gal是一种不良的非人类二糖， 发现存在于某些mAb的聚糖上，特别是鼠源细胞系内表达的mAb中。某些患者体内存在 高水平的抗a-Gal IgE抗体,如果使用聚糖中含有a-Gal单元的mAb进行治疗，就会 出现严重的超敏反应。另外，鼠源细胞系糖基化同人IgG糖基化的不同之处在于，一方面 具备产生a-Gal表位的蛋白生物合成机制，另一方面鼠源细胞系产生N羟乙基神经氨酸 (NGNA)，而并不是产生N乙酰神经氨酸（NANA). NGNA和NANA的区别是NGNA有一个 额外的氧原子，并且，糖蛋白中若含有NGNA残基，被认为与其在人体中的免疫原性密切相 关。一些已上市的治疗型糖蛋白因为含有NGNA残基而在病人体内引起严重的不良反应。
【发明内容】
[0012] 为了克服利用SP2/0细胞作为宿主细胞培养抗EGFR单克隆抗体的缺点，需要利用 合适的宿主细胞并优化培养条件从而减少细胞表达的蛋白与人体天然存在蛋白的差异，提 高对人体的安全性。
[0013] 本发明的发明人利用CH0细胞作为宿主细胞，采用无血清培养的方式培养，成功 制备出具有不同糖型结构的抗EGFR基因工程抗体（CMAB009单抗)，由于该抗体的聚糖结 构中不含有a-Gal，因此不会引发药物特异性IgE抗体介导的超敏反应；构建的工程细 胞中无内源性的逆转录病毒颗粒，利用该工程细胞培养获得的抗体没有病毒的污染。本发 明制备的抗EGFR单克隆抗体具有较Erbitux?单抗更好的临床安全性。
[0014] 本发明公开了 ： 1、一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a) -种新型抗EGFR单克隆抗体具有SEQ ID N0 :1所述核苷酸序列的轻链及具有SEQ ID N0 :3所述核苷酸序列的重链； b) 利用步骤a)所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； c) 优化培养条件，大规模培养，获得新型抗EGFR单克隆抗体，分离纯化。
[0015] 2、上述的一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，根据仓鼠最偏爱 密码子设计合成新型抗EGFR单克隆抗体轻链、重链基因序列。
[0016] 3、上述的一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为 真核哺乳动物细胞CH0。
[0017] 4、上述的一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述培养基的培 养的温度为33°C ~36°C，其中优选为34°C。
[0018] 5、上述的一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述培养基的培 养的pH值为6. 5~6. 9,其中优选为pH6. 6。
[0019] 6、上述的一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述培养基的培 养的渗透压为290m0sm/kg~350 mOsm/kg，其中优选为340 mOsm/kg。
[0020] 7、上述，其特征在于，培养基为无血清培养基，采用无血清培养的方式培养宿主细 胞。
[0021] 8、一种组合物，含有上述的新型抗EGFR单克隆抗体，和药学上可接受的载体。
[0022] 9、上述的新型抗EGFR单克隆抗体在制备治疗表达表皮生长因子受体肿瘤的药物 中的应用。
[0023] 10、上述的组合物在治疗表达表皮生长因子受体肿瘤的药物中的应用。
[0024] 11、上述的用途，还包括和其他的治疗表达表皮生长因子受体肿瘤的药物的联合 使用。
[0025] CH0细胞糖基化的机制同人类的IgG糖基化机制作用十分相似，早期研究认为 CH0细胞缺乏合成含有a-Gal表位糖蛋白的生物合成机制，新近研究报道CH0细胞中 存在a 1，3半乳糖苷转移酶基因，但在克隆选择过程中此基因处于无表达或低表达状态， a 1，3半乳糖苷转移酶基因在CH0细胞系中的激活机制尚不清楚，推测可能同其它糖苷 转移酶相似，与转染过程相关。正是基于此，我们设计选择CH0表达系统成功制备出具 有不同糖形结构的抗EGFR基因工程抗体（CMAB009单抗)，通过结构解析证实Erbitux? 的聚糖结构中含有大量ct-Gal，且末端唾液酸形式主要是NGNA，具有极高的免疫原性。 CMAB009单抗的聚糖结构中不含有a-Gal，且末端唾液酸形式主要是NANA，随后的临床 研究证实该抗体有较好的临床耐受性，未观察到药物相关性超敏反应，未检测到IgE特异 性的ADA。在免疫原性大大降低的同时，CMAB009单抗在体内的清除特征符合嵌合抗体在 体内的代谢规律，药代动力学参数与Erbitux?基本一致，并初步获得显著的临床疗效，有 望为潜在的超敏反应患者带来最大的益处。
[0026] 与Erbitux?单抗相比，CMAB009单抗具有相同的氨基酸一级结构，但聚糖中不 含有a-Gal，且末端唾液酸主要是人体常见的唾液酸化形式N乙酰神经氨酸（NANA)。这 与我们在临床研究中观察到较好的耐受性，未观察到药物相关性超敏反应相一致。在免疫 原性大大降低的同时，CMAB009单抗在体内的清除特征符合嵌合抗体在体内的代谢规律， 其药代动力学参数与Erbitux?基本一致。
[0027] 本研究证明，通过改造单抗的糖基化结构，在不影响单抗生物活性和清除特征的 同时，可有效降低单抗的免疫原性，避免超敏反应的发生，减少临床不良反应的发生率，有 望为潜在的超敏反应患者带来最大的益处，是一种潜在的安全可耐受的有效靶向新药。
【附图说明】
[0028] 图1、LC/MS分析Cetuximab和CMAB009重链Fc段寡糖的荧光标记色谱图 图2、LC/MS分析Cetuximab和CMAB009重链Fab段寡糖的荧光标记色谱图 图3、Fortebio Octet免疫原性分析（Octet QK系统） 图4、Fortebio Octet免疫原性分析（Octet RED系统）。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例、实验例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例、 实验例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0030] 实施例1、真核表达载体的构建 选用仓鼠最偏爱的密码子构建真核高效表达载体，以期在拟用的中国仓鼠卵巢表达体 系中获得更加高效的表达。仓鼠偏爱密码子如表1。
[0031] 表1、仓鼠偏愛密码子
信号肽：选择来自中国仓鼠B细胞抗原受体复合物相关蛋白0链的信号肽。 MATMVPSSVPCHWLLFLLLLFSGSS, ATG GCC ACC ATG GTG CCC TCT TCT GTG CCC TGC CAC TGG CTG CTG TTC CTG CTG CTG CTG TTC TCT GGC TCT TCT。
[0032] 根据仓鼠的最偏爱密码子设计合成CMAB009轻链序列具有SEQ ID NO :1的核苷 酸序列和SEQ ID NO :2的氨基酸序列，CMAB009重链序列具有SEQ ID NO :3的核苷酸序列 和SEQ ID NO :4的氨基酸序列。将上述轻链和重链连接入真核细胞高效表达载体中，获得 轻链和重链的真核表达载体。
[0033] 实施例2、宿主细胞的选择与改造 生物制药领域中宿主细胞的选择需要关注以下几个重要的方面：糖基化及其他翻译后 修饰类型避免带来免疫原性；宿主细胞适于生物反应器的大规模培养，并能在无动物源性 成分的化学成分限定性（chemically defined and animal component free，ACDF)培养基 中生长至高密度；病毒安全性；适于在ACDF中进行克隆及压力筛选。
[0034] CH0细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与 人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。工业生产中最常使用的克隆 为 CH0-K1，CH0-DXB11 和 CH0-DG44。CH0-K1 与原代 CH0 近似，而 DXB11 和 DG44 为经过随机 突变缺失DHFR基因，从而可以通过代谢缺陷标记进行基因扩增。CH0-K1使用GS筛选系统， 但GS在CH0-K1中有内源性表达，因而降低了筛选的效率。
[0035] 本发明选用治疗性抗体工业化生产应用更加广泛的CH0细胞作为宿主细胞，并对 CH0-K1进行了适宜的改造。我们利用CRISPR/Cas技术敲除了 CH0-K1的GS基因，获得的细 胞系命名为CH0-CR-GS /消除了内源性GS表达，因此更加有利于高表达细胞克隆的筛选。
[0036] 实施例3、转染宿主细胞筛选高表达克隆 脂质体法共转染CH0-CR-GS /，GS筛选系统加压筛选获得高效表达抗EGFR单克隆抗体 的稳定细胞克隆。经过多轮的转染及筛选，获得了表达量大于20pg/Cell. day的细胞克隆。 [0037] 实施例4、无血清培养适应及培养条件的优化 我们开发了针对CH0-CR-GS /的通用型基础培养基，培养基类型为化学成分限定性 (Chemical Defined,⑶）培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、 葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工程细胞 的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性的优化 调整，包括添加激素、基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。
[0038] 培养pH为：6.5~6.9,其中最优选pH6.6 ;培养温度为：33°C~36°C，其中最优选为 34°C ;渗透压为：290m0sm/kg~350 m0sm/kg，其中最优选渗透压为340 m0sm/kg。
[0039] 经过反复比较优化，最终确定了适于抗EGFR单克隆抗体工程细胞大规模无血清 培养的培养基（CH0M-B08 )和补充培养基（CH0M-S08 )，培养条件为：Ph6. 6，温度34 °C，渗透 压为 340 m0sm/kg。
[0040] 工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell. day,利用Fed-batch培养 模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/L以上。
[0041] 实施例5、CMAB009抗体的分离纯化 将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，收集上清，9000rpm*20min，4°C 离心弃去沉淀的细胞及碎片，利用Millipore公司50KD超滤膜包进行超滤浓缩，然后再 9000rpm*30min，4°C离心去除细胞碎片，0. 45iim滤膜进行过滤，利用rProtein A (重组 蛋白A)亲和层析进行初步纯化，原位清洗缓冲液为6M GuCl，柱子用结合缓冲液是20mM PB+150mM NaCl pH7.0,平衡三到五个柱体积后，用洗脱缓冲液20mM Citric Acid (柠檬酸 缓冲液）PH3.0三到五个柱体积进行洗脱，柱平衡清洗后保存于20% EtOH，。rProteinA洗 脱目的蛋白，用Hitrap G25(GE Healthcare)进行脱盐置换缓冲液，柱子洗脱缓冲液为PBS (20mMPB+150mMNaCl pH7. 0)，原位清洗液为0. 5M NaOH。以上所有纯化步骤均为冰上操作， 纯化所得抗体经50KD超滤离心管（Merck Mi 11 ipore)进行浓缩，获得CMAB009单克隆抗体。
[0042] 实验例1、培养产物糖基化比较 采用 LC/MS，MS/MS 技术对 CMAB009 单克隆抗体及 Cetuximab (Erbitux?, C225 单抗） 进行糖链的比较分析。
[0043] 样品制备：抗体经过糖苷酶酶切制备Fc段及Fab上的寡糖；寡糖外切酶处理Fab 上的寡糖；2-AB荧光标记寡糖；经过HILIC固相萃取，除去过量2-AB，获得带有荧光标记的 糖链，进行LC/MS及MS/MS色谱分析。
[0044] 单抗在糖苷酶作用下得到游离糖链，经荧光标记后分别通过LC/MS，MS/MS及寡 糖外切酶分析。研究结果表明，CMAB009抗体和原研药分别具有两个糖基化位点，其Fc段 上的糖链结构完全一致，结果见图1。但Fab段具有不同的糖链结构，CMAB009抗体Fab 段上的糖链结构以唾液酸NANA为主，而原研药Fab段上的糖链结构以唾液酸NGNA为 主；CMAB009抗体Fab段上的糖链不含有a半乳糖，而原研药Fab段上的糖链含有大量 的c[半乳糖。LC/MS分析重链Fab段的糖链结构，见图2。
[0045] 实验例2、临床耐受性研究 CMAB009单抗的临床耐受性评价 本研究共入组18例受试者，其中单次静脉给药研究中100 mg/m2剂量组、250 mg/m2 剂量组和400 mg/m2剂量组分别入组3、6、6例，接受单次给药的受试者中有3例在试验 中因发生疾病进展而出组，按照研究方案其余15例受试者符合多次给药入选标准均进入 多次给药组，另外新增3例受试者入组多次给药研究(表1)。
[0046] 表1The allocation of patients to the different dose groups
本研究中入组的受试者均为缺乏常规的有效治疗方法或常规方法治疗后失败或复发 的晚期肿瘤患者，包括结直肠癌10例、肺癌7例、胃癌1例，受试者的人口统计学特征 及既往治疗情况见表2。
[0047] 表 2 Patient characteristics
分别对比分析受试者入组的基线情况，单次给药的三个剂量组和多次给药的两个剂量 组入组受试者的年龄、身高、体重、体表面积、EC0G评分，结果无统计学差异见表3。
[0048] 表 3 Subject characterstics at baseline. Mean 土 SD
研究结果表明，受试者对CMAB009单抗耐受性良好，18例受试者中，均未出现 III-IV级药物相关性毒性反应见表4,出现的毒性反应皆为I-II级，且毒性反应发生率 与用药剂量和用药次数无关。未观察到剂量限制性毒性反应，未观察到药物相关性超敏反 应。
[0049] 表 4 CMAB009_related toxicities
本研究中未观察到与CMAB009单抗相关的超敏反应，而PaulaM. Fracasso等的研究 结果表明Erbitux?相关的超敏反应发生率达到31 %，其中III-IV级超敏反应发生率 达到13 %。Christine H. Chung等研究关于原研药Erbitux?用药中出现的超敏反应 (Chung CH, Mirakhur B, et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1, 3-galactose. N Engl J Med, 2008; 358 (11):1109-17 ) 76 例接受Erbitux?治疗的受试者中，25例发生超敏反应,超敏反应发生率达到33 %,这与 Paula M. Fracasso的研究结果相吻合。Christine H. Chung研究证实Erbitux?相关 性超敏反应是由a-Gal特异性的IgE介导的。
[0050] 实验例3、临床结果安全性、免疫原性实验 CMAB009单克隆抗体临床安全性：主要不良事件是药物相关性皮疹，未观察到有临床 意义的新增毒性反应，73例受试者中未观察到重度超敏反应。
[0051] 免疫原性是作为生物制药安全性评估的重要方面。传统的ELISA可用于免疫 原性的分析，问题是包被的捕获抗体的Fab段理论上应该朝向利于抗原抗体相互作用的 最适构想，有时捕获抗体的Fab段会部分甚至全部结合于酶标板上，造成活性捕获抗体减 少。
[0052] 本研究采用生物薄膜干涉技术，通过光纤制成的生物传感器，在其底端覆盖生物 分子相容层偶联的配体SA，当捕获的生物素化的抗体与其结合后，生物膜层厚度增加，反 射光干涉光谱曲线产生可测量的漂移距离，从而可以实现对分子间相互作用的实时测量， 本方法相当于捕获抗体的自我组装过程，因此生物传感器的表层形成一定密度的系列最适 构象捕获抗体，这样既提高了分析灵敏度又会增加线性范围，利于降低非特异性结合的假 阳性反应。
[0053] Fortebio Octet免疫原性分析：临床血清样本的ADA检测，结果见图3、4 :cut point值分析73例受试者中有3例潜在阳性（HPC为高阳性，MPC为中阳性，LPC为低阳性， NC为阴性)。
[0054] 本研究中关于CMAB009单抗免疫原性的分析，研究结果表明1. 4 % (1/73)的受 试者检测到ADA，且经亚型分析证实其为IgG型ADA，并非介导超敏反应的IgE型ADA。 此研究结果同临床的安全性评价结果保持一致，临床研究中没有受试者观察到重度超敏反 应的发生。
【主权项】
1. 一种新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a) -种新型抗EGFR单克隆抗体具有SEQ ID NO :1所述核苷酸序列的轻链及具有SEQ ID NO :3所述核苷酸序列的重链； b) 利用步骤a)所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； c) 优化培养条件，大规模培养，获得新型抗EGFR单克隆抗体，分离纯化。2. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，根据仓鼠最偏 爱密码子设计合成新型抗EGFR单克隆抗体轻链、重链基因序列。3. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞 为真核哺乳动物细胞CH0。4. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的培养温 度为33°C ~36°C，其中优选为34°C。5. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述培养基的 pH值为6. 5~6· 9,其中优选为ρΗ6· 6。6. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的培养渗 透压为 290m0sm/kg~350 mOsm/kg，其中优选为 340 mOsm/kg。7. 根据权利要求4、5、6所述，其特征在于，培养基为无血清培养基，采用无血清培养的 方式培养宿主细胞。8. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体，较常规方法培养获得的抗体具有更低的 免疫原性。9. 一种组合物，含有权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体，和药学上可接受的载 体。10. 权利要求1所述的新型抗EGFR单克隆抗体在制备治疗表达表皮生长因子受体肿瘤 的药物中的应用。11. 权利要求9所述的组合物在治疗表达表皮生长因子受体肿瘤的药物中的应用。12. 权利要求10、11任一所述的用途，还包括和其他的治疗表达表皮生长因子受体肿 瘤的药物的联合使用。
【文档编号】C12N15/85GK105820248SQ201510006233
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】钱卫珠
【申请人】上海张江生物技术有限公司