一种克伦特罗检测试剂盒及其使用方法

专利名称：：一种克伦特罗检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
：本发明属于检测
技术领域：
，具体地，涉及一种检测尿液、动物组织(肌肉、心脏、肝脏)、血清、饲料等中的克伦特罗的酶联免疫试剂盒和其使用方法。
背景技术：
：克伦特罗(Clenbuterol，CLE)，俗称"瘦肉精"，化学名为"2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐"，药品名为"克喘素"是一种P-兴奋剂。因其能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，并能加速动物生长，而被广泛添加于动物饲料中，并且可以残留在动物的体内。经大量实验结果证实，克伦特罗的毒性并不很强，但因其半衰期长，在体内代谢慢等原因，人体对其的耐受量非常小，治疗用药时也都十分慎重，用量过大或无病用药则会导致肌肉震颤、心悸、战栗、头痛、恶心、呕吐等症状。由于这种药物对人有严重的副作用，轻则导致心跳及心率不正常，重则可引发心脏病。目前，我国已禁止其使用。而在生产上，一些不法生产者在育肥猪(6070Kg以上)饲料中添加，连用至宰前。由于克伦特罗饲用浓度是治疗用量的IO倍以上，停药期短(如果停药造成受体调节减弱，脂肪在皮下和内脏补偿性蓄积，瘦肉率下降)，更重要的是它的化学结构比较稳定，因此在肝、肺等动物内脏器官残留量很大。另外，克伦特罗能耐受IO(TC高温，经126t:油煎5min才会破坏减半，常规烹调对肉食品中克伦特罗残留起不到破坏作用，因而人类食用后会发生中毒。早在上世纪80年代就有学者开始对于克伦特罗的定量检测和分析研究，上述分析技术发展至今已经20余年。通常，检测克伦特罗的主要方法有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱_串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。这些方法由于仪器设备复杂、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等原因，不适合现场监控和大量样本筛查。1993年Boyd等人(D.Boyd，P.Shearan.J.P.HopkinsandM.0'Keeffe.Applicationofmatrixsolidphasedispersionforthedeterminationofclenbuterolinliversamples[J]，AnalyticaChimicaActa,1993，27(5):221-226.)应用基质固相分散法与放免法结合对肝脏中克伦特罗残留作了检测。检测中用^标记克伦特罗，检测限达0.5ng/g，回收率大于70%，上述方法的应用开创了免疫检测分析克伦特罗残留的先河。放免法检测克伦特罗残留具有很好的特异性和高度灵敏度。但由于对条件要求比较苛刻且放射性同位素对工作人员有一定伤害，因而限制了该法的广泛应用。随后发展起来的荧光免疫分析法(FIA)同放免法相比，克服了放免法中的核辐身寸缺点。Bacigalupo等(M.A.Bacigalupo，A丄us，G.MeroniDovisandEPetruzzlli.Comparisonoftime—resolvedfluroimm皿oassayandimmm皿oenzymometricassayforclenbuterol[J].Analyst,1995，120(8):2269-2271.)利用单抗技术与荧免分析技术检测了克伦特罗在牛尿中的残留，检测线性范围10105pg，检测限10pg。与色谱法相比，荧光免疫法检测克伦特罗残留具有特异性高，稳定性好，对样品处理要求比较简单及一次可检测多个样品等优点。缺点是对温度的强烈依赖性和荧光强度取决于激发波长。3标记免疫分析技术是"迈向21世纪的医学检验技术"之一，其发展趋势是新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，可明显提高检测特异性，敏感度可达z印to(10—2°)、yocto(10—24)水平，即可实现分子水平的检测。目前，检测克伦特罗较高效的免疫分析技术是ELISA技术。McCo皿ell等人(McCo皿ellRI，McCormickA，LamontJV，etal.Developmentofanimm皿oaffinitycolumnandanenzymeimmunoassayforthescreeningofclenbuterolinmeatsamplesandthepracticalapplicationofthistestinthescreeningof1005samples[J]FoodAgriImmunol,1994，6:147-153.)在1994年米用ELISA方法对1005份包括肝脏、肾脏、肌肉在内的组织样品进行了筛选实验。由于组织试样的前处理采用了IAC分离技术，因此假阳性率极低。经过复核测定，仅有4份假阳性，假阳性率为0.4%。其中检出的阴性样品有982份，阳性样品23份。1998年陈继明等(陈继明，龚晓明，陆承平.兔异源蛋白与自身蛋白作为载体制备克伦特罗抗血清南京农业大学学报，1998，21(3):81-88.)用ELISA方法检测了饲料、尿样与脏器中克伦特罗含量，检测范围为15.6iig/mL1.90ng/mL;回收率多在85X。上述检测结果有较好的稳定性和较高的标准回归曲线，与用HPLC检测结果大体一致。目前，作为商品化的检测试剂盒来讲，英国的Randox公司和德国的r-biopharm公司均率先开发出了检测肉品、饲料中克伦特罗残留的ELISA试剂盒。中国在应用ELISA检测克伦特罗方面的研究起步相对国外稍晚些，但近几年取得了明显的进展。目前国内企业和研究单位已经开发成功自主知识产权的克伦特罗ELISA检测试剂盒，并在近期通过了农业部兽药残留试剂盒的备案审核。早在2002年叶妮等(叶妮，闫小峰.国内外克伦特罗ELISA检测试剂盒评价中国兽药杂志，2002，36(10):25-28.)对中国兽药监察所研制的试剂盒及国外快速检测试剂盒进行了测试，结果表明该试剂盒与德国r-biopharm公司生产的CLEELISA检测试剂盒有相当的可比性，且检测水平相当。上述多种检测克伦特罗的方法中，色谱、质谱等方法的检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、常常作为高端实验室确证手段。但是，实验室确诊不能完全取代快速、便捷、高效的现场检测和大样本量、高通量的筛选。根据我国目前已经形成了一套兽药残留的监控检测技术，对于克伦特罗的监控过程包括了ELISA筛选，HPLC或GC-MS、HPLC-MS定量，GC-MS或HPLC-MS/MS确证。由此可见，ELISA作为一种准确、灵敏性、高性价比的检测方法，是食品安全监测、兽药残留监测领域对"瘦肉精"进行高通量筛选的理想方法。本发明通过特有的免疫方案免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的抗体克伦特罗抗体，并采用酶标记抗原，建立一种可以检测克伦特罗的高特异性、高亲和力、灵敏快速的直接竞争ELISA检测方法。相比其他产品，本方法具有操作更简便、时间更短、特异性更高等特点。
发明内容针对现有技术中存在的问题，本发明人进行了广泛深入的研究，并因此完成本发明。本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来进行的。首先在微孔板上包被克伦特罗特异性抗体，然后加入克伦特罗标准品或待检测样品，再加入酶标抗原，温4育后，用洗涤液洗板后分别加入底物液A和底物液B，显色后，加入反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读取吸光值，然后通过提供的软件对结果进行计算分析。在整个反应完成后，样品中克伦特罗含量越多，反应呈色就越浅；反之，样品中克伦特罗含量越少，则呈色越深。—方面，本发明提供了一种快速、结构简单、使用简便、价格便宜、灵敏度高及便于携带的用于检测克伦特罗的试剂盒。本发明的克伦特罗检测试剂盒包括以下物质(1)包被了克伦特罗抗体的微量测试孔；(2)克伦特罗标准溶液；(3)清洗缓冲液；(4)浓縮酶标记物；(5)底物溶液A;(6)底物溶液B;(7)反应终止液；(8)酶标稀释液，其中，将克伦特罗进行重氮化，再与牛血清白蛋白BSA进行偶氮连结，形成克伦特罗-BSA，作为制备多克隆抗体的免疫抗原，并且用该免疫抗原制备的多克隆抗体包被微量测试孔，以及在酶标记物的制备中，将小分子克伦特罗先进行重氮化，再与辣根过氧化物酶HRP进行偶氮连接形成酶标抗原克伦特罗-HRP。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，在包被了克伦特罗抗体的微量测试孔的制备过程中，克伦特罗抗体包被浓度为0.1-1iig/mL，包被体积为100iiL，37t:放置2小时后置于4t:静置过夜。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，克伦特罗标准溶液浓度分别为0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，清洗缓冲液可为含有吐温20的PBS，优选为含有千分之五的吐温20的0.05moL/L的PBS。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，浓縮酶标记物(酶标抗原)的浓度可为0.3lig/mL_l.0lig/mL。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，底物液A液可为用一定浓度的柠檬酸缓冲液，调pH值至4.5-5.O，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，底物溶液B可为8mg/mL-16mg/mL的四甲基联苯胺溶液，该溶液的溶剂为等体积混合的二甲亚砜和水。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，反应终止液可为10%_15%的硫酸溶液。本发明所述的克伦特罗检测试剂盒中，酶标稀释液可为0.05mol/L的PBS溶液。在本发明的一个实施方式中，提供了一种检测克伦特罗的试剂盒，该试剂盒包括以下各项5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>另一方面，本发明提供了使用所述试剂盒检测克伦特罗的方法，该方法包括1、检测样品的制备；2、使用本发明的试剂盒检测克伦特罗；禾口3、分析检测结果。其中，使用本发明的试剂盒检测克伦特罗的方法包括向包被了克伦特罗抗体的微量测试孔中加入克伦特罗标准溶液或样品溶液和酶标克伦特罗溶液，25t:竞争反应20min后，用清洗缓冲液洗板3次后加入等体积混合的底物溶液A和B，25。C下温育10min显色，然后加入反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读数。计算方法(1)计算B/B。值，用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B。)再乘以100%。(2)以B/B。值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。(3)根据每个样品的B/B。值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。(4)有些样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定再要乘以其稀释倍数。本发明的克伦特罗检测试剂盒，除可用于尿液检测以外，同时着重于对血清样本的检测，使检验结果更准确、更稳定；也可以对饲料、肌肉、组织等样品进行检测。该试剂盒简化了样品处理方式，使用简便，省时省力省钱，整个操作过程不到40分钟，回收率为80%120%，灵敏度可达到0.05ppb，是各类饲料企业、屠宰企业及各级政府检测机构的理想产品。图1为克伦特罗检测的标准曲线。具体实施例方式下文中，将通过实施例详细描述本发明。但是，本发明的范围不仅仅限于实施例。实施例材料与仪器药品和耗材药物名称生产厂家规格批号NaOH国药集团化学试剂有限公司ARF20080125HCL国药集团化学试剂有限公司AR080101NaN02国药集团化学试剂有限公司AR080103牛血清白蛋白(BSA)SEEBIO公司OG2012A盐酸克伦特罗Sigma公司HPLC067K0668完全福氏佐剂Sigma公司不完全福氏佐剂Sigma公司H2S04国药集团化学试剂有限公司ARF20080128NaCL国药集团化学试剂有限公司ARF20080104KCL国药集团化学试剂有限公司ARF20080110KH2P04国药集团化学试剂有限公司ARF20080106Na2HP0412H20国药集团化学试剂有限公司ARF200711037<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例1主要材料的制备1、克伦特罗标准溶液的制备克伦特罗(以下简称CLE)系列标准溶液6瓶，lmL/瓶。制备过程如下參精确称取CLE标准品10mg，用蒸馏水溶解，定容至lOOmL，得到lOOppmCLE标准溶液；參取1.OmL100卯m标准溶液稀释定容至lOOmL，得到1.O卯mCLE标准溶液；參用1.O卯mCLE标准溶液准确稀释成0.lppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7卯b、8.lppb(Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.Ing/mL)的系列标准溶液。2、克伦特罗免疫抗原与酶标抗原的制备參将CLE进行重氮化(段行信.实用精细有机合成手册[M].北京化学工业出版社，2000)，再与BSA(Bovineserumalbumin,牛血清白蛋白BSA)蛋白进行偶氮连结，形成CLE-BSA，作为制备多抗的免疫抗原；參酶标抗原CLE-HRP:将小分子CLE先进行重氮化，再与辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)进行偶氮连接。3、克伦特罗多抗的制备參CLE-BSA过柱(葡聚糖凝胶G25)纯化，其中BSA含量有9mg/mL;參初次免疫用100-500iigCLE-BSA加入lmL福氏完全佐剂(Freund'sCompleteAdjuvant,FCA)，在家兔背部皮下注射10点每点0.lmL;參每隔4-6个星期用100-500iigCLE-BSA于福氏不完全佐剂(Freund'slncompleteAdjuvant,FIA)中，在肌肉皮下静脉注射和脚趾皮下注射加强免疫5次，每次lmL;參佐剂和CLE-BSA按照1:1的比例混合乳化。每只兔子每次免疫用lmL乳化完的抗原，CLE-BSA含量100-500iig;分10个点打入，每个点0.lmL。參最后一次免疫直接用lmL生理盐水稀释100-500ygCLE-BSA，静脉注射，10天后颈部静脉取血，获得抗血清。4、克伦特罗抗体的检测9免疫时间免疫次数效价抑制(0.l卯b)抑制(lppb)2007年9月9日1i:io万5%21%2007年10月1日21:40万17%58%2007年10月22日3i:ioo万24%79%2007年11月13日4i:400万28%87%2007年12月4日5i:800万32%94%2007年12月25日第五次免疫后测定为合格(用间接法测定效价达到检测要求且通过直接竞争法测定灵敏度达到0.05ng/mL)可以取血。5、多克隆抗体的纯化1)将上述经测定达到要求的兔血经4t:或室温离心13000r/min(20000Xg)，30min，收集上清；2)取上清约20mL与等体积生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加40mL饱和硫酸氨溶液，于4。C沉淀30min以上或过夜，使蛋白充分沉淀；3)13000r/min，4。C离心10min，弃上清；4)用12mL生理盐水溶解沉淀，同步骤(2)滴加8mL饱和硫酸铵溶液，4"C静置lh;5)重复步骤3)离心，用13.3mL生理盐水溶解沉淀；6)滴加6.6mL饱和硫酸氨溶液，4"静置lh;7)重复步骤4)离心后所得沉淀物用少许盐水溶解沉淀，并装入透析袋；8)用大于20倍体积的PBS缓冲液于4。C透析，更换透析液数次，然后加入等体积甘油置-2(TC保存。9)多抗效价的测定采用间接ELISA法(EnzymeImmunoassays:FromConc印ttoProductDevelopment.S.S.DESP應DE.ChapmanandHall，NewYork，1996.)测定多抗血清的效价。实施例2检测方法的建立1、包板多抗及克伦特罗-HRP最佳浓度的选择将上述制备的多抗做不同稀释后，进行方阵滴定(EnzymeImmunoassays:FromConcepttoProductDevelopment.S.S.DESPHANDE.ChapmanandHal1，NewYork,1996.)，在用ELISA法测定一定浓度的克伦特罗中，用酶标仪选择450nm波长时的吸光值在2.3-2.8时，即为两个参数的最佳工作浓度。2、竞争ELISA法的建立及标准曲线的建立不同浓度的克伦特罗标准品含量的测定在确定了最优化的多抗包被浓度和CLE-HRP浓度的基础上，用CLE标准品与CLE-HRP进行竞争ELISA。103、样品提取方法的研究情况3.l待测物为尿液直接将尿液取50L进行测试，如有混浊请先离心取上清液进行分析。3.2待测物为血清抽取待验动物血液，离心或静置取其较透明之上层液(血清层)使用，注意不要有溶血。取0.ImL血清，加入0.4mL样品稀释液(0.05moL/L的PBS)，涡旋1分钟，混匀。离心10分钟(3000rpm)，取上清液50yL进行分析。3.3待测物为肉类取4g已均质样品置入离心管中，再加入6mL0.01NHC1，涡旋1分钟。静置30分钟，离心10分钟(3000rpm)，上清液与样品稀释液(0.05moL/L的PBS)进行1:3(4倍)稀释后，取50iiL进行分析。3.4.待测物为心、肝等器官取4g已均质样品置入离心管中，再加入6mL0.01NHC1，涡旋1分钟。以80—10(TC水浴加热约3分钟，离心10分钟(3000rpm)。上清液与样品稀释液(0.05moL/L的PBS)进行l:3(4倍)稀释后，取50iiL进行分析。3.5.待测物为饲料取lg已磨碎的待测饲料加入5mL0.OlNHCl，震荡混合1分钟。3000转离心10分钟后，取上清液100iiL，用样品稀释液(0.05moL/L的PBS)做10倍稀释。取50yL进行分析。4、理化方法的比较与气相色谱-质谱法(GC-MS)比对报告。实施例3克伦特罗检测试剂盒的制备1.微量测试孔的包被将上述经硫酸铵法纯化后的抗体用0.05moL/L、pH为9.6的碳酸缓冲液稀释到浓度为0.1iig/mL-1.0iig/mL，每孔0.lmL加入96孔微孔板，37摄氏度孵育2小时后4摄氏度过夜。2.制备CLE-HRP采用重氮法将克伦特罗与辣根过氧化物酶按10:l摩尔比连接，4摄氏度过夜后对PBS充分透析。根据偶联物的活性决定酶的工作浓度。实施例4克伦特罗检测试剂盒的组建组建克伦特罗检测试剂盒，使其包括以下组分(1)包被了克伦特罗抗体的微量测试孔，每条8孔，每板12条；(2)克伦特罗标准溶液，浓度分别为Ong/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL，每个浓度各1瓶；(3)20倍清洗缓冲液，含有千分之五的吐温20的0.05moL/L的PBS;(4)20倍浓縮酶标记物，浓縮酶标记物(酶标抗原)的浓度为0.3iig/ml-l.0yg/ml;(5)底物溶液A，称取NaAcH202.825g，柠檬酸1.725g，柠檬酸钠？H202.95g，加蒸馏水溶解，用浓HAc调pH至4.50后加入0.1-1.OmL30%的H202，最后用250mL的容量11瓶定容即可；(6)底物溶液B，称取TMB20-200mg，溶解于125mL的二甲亚砜中，再加入蒸馏水定容至250mL;(7)反应终止液，用量筒量取浓硫酸150mL，在玻璃棒搅拌下缓慢加入850mL蒸馏水中；(8)酶标稀释液，为0.05mol/L的PBS溶液。实施例5检测样品的制备(样品前处理)1.若待测物为尿液，直接将尿液取50L进行测试，如有混浊请先离心取上清液进行分析。2.若待测物为血清，则用以下方法进行处理(5倍稀释)抽取待验动物血液，离心或静置取其较透明之上层液(血清层)使用，注意不要有溶血。取O.lmL血清，加入O.4mL稀释液，涡旋l分钟，混匀。离心10分钟(3000rpm)，取上清液50iiL进行分析。*若需要0.05ppb的灵敏度，则可直接取lmL血清进行管柱纯化，详细方法见下文管柱纯化。3.若待测物为肉类，则用以下方法进行处理(10倍稀释)取4g已均质样品置入离心管中，再加入6mL0.01NHC1，涡旋1分钟。静置30分钟，离心10分钟(3000rpm)，上清液与稀释液进行1:3(4倍)稀释后，取50yL进行分析。*若需要0.05卯b的灵敏度，则可继续取稀释液3mL进行管柱纯化，详细方法见下文管柱纯化。4.若待测物为心、肝等器官，则用以下方法进行处理(10倍稀释、煮沸)取4g已均质样品置入离心管中，再加入6mL0.01NHC1，涡旋1分钟。以80—10(TC水浴加热约3分钟，离心10分钟(3000rpm)。上清液与稀释液进行1:3(4倍)稀释后，取50yL进行分析。*若需要0.05ppb的灵敏度，可继续取稀释液3mL进行管柱纯化，详细方法见下文管柱纯化。5.若待测物为饲料，则用以下方法进行稀释(50倍稀释)取lg已磨碎的待测饲料加入5mL0.OlNHCl，震荡混合1分钟。3000转离心10分钟后，取上清液100iiL，用稀释液做10倍稀释。取50iiL进行分析。管柱纯化(C18，500mg3mL)若利用C-18管柱进行样品纯化，可提升敏感度至0.05卯b，方法如下1.以10mL甲醇洗涤管柱，流速3mL/分。2.再以10mL蒸馏水洗涤管柱，流速3mL/分。3.分析样品进入管柱(血清加入lmL，肉类或内脏均质稀释后的上清液加入3mL)。(注)4.以10mL蒸馏水洗管柱，流速3mL/分。5.利用减压真空装置干燥管柱10分钟。6.以2mLCH3CN洗涤管柱，流速3mL/分。7.再利用减压真空装置干燥管柱10分钟。8.以2mL甲醇流出样品，流速3mL/分。9.以5(TC氮气流吹干样品后，加入稀释液溶解样品。(样品若是血清，则加入lmL稀释液，样品若是肉类或是内脏类，则加入300iiL稀释液)。10.取100iiL进行分析。注:分析样品进管柱之前必须先用1NNaOH调整到pH9.0~9.5间！实施例6使用本发明的试剂盒检测克伦特罗的操作步骤检测前使用本发明的试剂盒检测克伦特罗的方法包括1、将标准品6瓶、待测样品、20倍浓縮清洗缓冲液、酶标记物、微孔测试板，置于室温下，回温5分钟。2、清洗缓冲液的配制用蒸馏水将20倍清洗缓冲液以1:19的比例稀释(即lmL浓縮液+19mL蒸馏水)，作为微孔板清洗液。3、酶标记物配制利用酶标稀释液将20倍浓縮酶标记物以1:19的比例稀释(即0.lmL20倍浓縮酶标记物+1.9mL酶标稀释液)，即完成原倍酶标记物的配制。稀释后的酶标记物请尽快使用，若保存于-20°C，保存期可达1个月，若保存于4°C，请勿超过一个星期。5、将剩余的微孔条放回铝箔袋中，以胶带封好储存于4°C。6、如要提高灵敏度可用酶标稀释液将标准液稀释一倍后使用。检领[J时1、于适当微孔中分别加入50iiL标准溶液(O，O.l，O.3，0.9，2.7和8.l卯b)。2、在另外的微孔中加入50iiL已完成前处理的样品溶液。3、再于每一微孔中另再加入100iiL已完全回溶的酶标记物。4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育30分钟。5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。7、将底物A和B液等比例稀释，于每一微孔中加入混合好的底物溶液100iiL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。8、于室温下避光静置温育15分钟。9、于每一微孔中加入50iiL反应终止液。10、用酶标仪于波长450nm下判读。实施例7判定1.计算B/B。值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B。)再乘以100%。2.以B/B。值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。3.根据每个样品的B/B。值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。4.有些样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。标准曲线见图1。实验实施例本试剂盒1至6号标准液为无色透明液体；酶标记物为蓝色带有絮状沉淀物液体；底物(A液)为粉红色澄清透明液体，无沉淀和絮状物；显色剂(B)液为无色澄清透明液体，无沉淀和絮状物，无蓝色趋向性变化；反应终止液为澄清透明液体，无沉淀和絮状物。实验实施例l灵敏度向包被了克伦特罗抗体的微量测试孔中加入0ng/mL克伦特罗标准溶液和酶标克伦特罗溶液，25t:竞争反应20min后，用清洗缓冲液洗板3次后加入等体积混合的底物溶液A和B，25t:下温育lOmin显色，然后加入反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读数。上述制备的试剂盒的克伦特罗含量为Ong/mL的标准溶液20次测定OD值为<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>平均值B。=EXi鰭(i=1n)标准差SD={[n□EX2-(EX)2]辚n□(n_l)]}1/2灵敏度LOD=B。-3SDB。=2.170SD=0.0106LOD=2.136代入曲线计算得灵敏度=0.Olng/mL本试剂盒灵敏度在0.05ng/mL以内IC50=0.57ng/mL平行20孔测定零值标准品的光吸收度值，计算测定结果的平均值(B)与标准差(SD)。灵敏度LOD=(B0-3SD)在标准曲线上所对应的浓度值。本试剂盒灵敏度为0.lppb以内。实验实施例2特异性上述制备的克伦特罗试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到。抗血清的抑制物分别用莱克多巴胺、沙丁胺醇等类似物，以类似物在标准曲线上的实测浓度的回收率计算交叉反应率。向包被了克伦特罗抗体的微量测试孔中加入不同浓度的克伦特罗标准溶液或者其他相关物质的标准品溶液和酶标克伦特罗溶液，25t:竞争反应20min后，用清洗缓冲液洗板3次后加入等体积混合的底物溶液A和B，25t:下温育lOmin显色，然后加入反应终止液，用酶标仪选择450nm波长读数。标准及交叉物五次平均OD值实测浓度ng/mL交叉反应率02.23000.lng/mL1.7650.10.3ng/mL1.3840.314<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果显示本试剂盒与克伦特罗类似物的交叉反应<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实验实施例3精密度使用试剂盒批号为20080201，20080202，20080203分别用三个批次的试剂盒，进行相同的质控样品的检测。其中质控样品1为lng/mL，质控样品2为2ng/mL，质控样品3为5ng/mL每份样品做5次重复。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>结果显示本试剂盒批内CV<10%，批间CV<20%。体现了良好的精密度。实验实施例4本发明的试剂盒与气相色谱_质谱法(GC核S)比对GC-MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。应用气相色谱_串联质谱法(GC-MS-MS)对牛、羊、猪组织中的CLE含量进行检测，最低检测限为O.5ng/g;用GC-MS法(El离子源)检测猪尿中的CLE,检测限为0.5ng/mL;本次使用GC-MS法检测猪尿中的CLE含量与试剂盒经行比对。进行30个猪尿盲样进行领lj试。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>从以上数据，可以看出克伦特罗含量在0.5ppb以上本试剂盒所测定的结果与GC-MS所测定的结果基本一致，0.5ppb以下时已经超出了GC-MS的检测下限，而本试剂盒仍然可以给出准确的结果。因此，本试剂盒完全可以取代GC-MS用于常规克伦特罗的检测。实验实施例5回收率在不同样品中添加不同浓度的CLE标准品溶液，然后采用本试剂盒提供的前处理方法和试剂进行检测，回收率=实测浓度/添加浓度X100%<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实验实施例6产品稳定性试验1、使用有效期实验使用本发明的试剂盒进行稳定性试验，28t:放置，分别于0、l、2、3月，及以后每3个月，测定6个标准点的OD值及计算阴性猪尿中添加lng、5ng克伦特罗的回收率，并计算IC5Q。(IO次重复平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>B回收率尿样品中大约90110%BIC50二0.54上述实验结果说明，该试剂盒在一年内不同月份检测，标准点OD数值、标准曲线形态、样品浓度、添加回收率均无显著性变化。体现了该试剂盒在正确保存条件下，实验数据良好的再现性。2、室温放置实验室温放置本发明的试剂盒，室温(25_28°C)放置，分别于15天、1个月、2个月后测定各标准浓度的0D值(10次重复的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>结果显示该试剂盒在室温(25-28°C)放置2个月内实验OD值及IC5。无显著性变化。3、冻融实验使用本发明的试剂盒进行冻融实验，将试剂盒组份置-181:三天，解冻后测定各标准浓度的0D值(10次平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>结果显示该试剂盒组分经冻融后0D值及IC50无显著性变化。4、37摄氏度加速试验使用本发明的试剂盒进行加速试验，37t:放置，分别于1天、2天、3天、4天、5天、6天、9天、12天16天、20天后测定各标准浓度的0D值(10次重复的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>结果显示该试剂盒组分经37摄氏度后0D值及IC50无显著性变化。本发明的克伦特罗检测试剂盒灵敏度已达到国外进口产品的水平，且交叉反应低，反应时间短，稳定性好。权利要求一种克伦特罗检测试剂盒，其包括(1)包被了克伦特罗抗体的微量测试孔；(2)克伦特罗标准溶液；(3)清洗缓冲液；(4)浓缩酶标记物；(5)底物溶液A；(6)底物溶液B；(7)反应终止液；和(8)酶标稀释液，其中，将克伦特罗进行重氮化，再与牛血清白蛋白BSA进行偶氮连结，形成克伦特罗-BSA，作为制备多克隆抗体的免疫抗原，并且用该免疫抗原制备的多克隆抗体包被微量测试孔，以及在酶标记物的制备中，将小分子克伦特罗先进行重氮化，再与辣根过氧化物酶HRP进行偶氮连接形成酶标抗原克伦特罗-HRP。2.根据权利要求1所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述克伦特罗标准溶液浓度分另U为0ng/mL、0.lng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.lng/mL。3.根据权利要求1所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述浓縮酶标记物的浓度为0.3lig/mL_l.0lig/mL。4.根据权利要求1所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述包被了克伦特罗抗体的微量测试孔的制备过程中，克伦特罗抗体包被浓度为0.1-1g/mL，包被体积为100L。5.根据权利要求1所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述清洗缓冲液为含有千分之五的吐温20的0.05moL/L的PBS。6.根据权利要求l所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述底物溶液A用一定浓度的柠檬酸缓冲液，调PH值至4.5-5.0，加入千分之一至千分之五的30%的H202制得，而所述底物溶液B为8mg/mL-16mg/mL的四甲基联苯胺溶液，该溶液的溶剂为等体积混合的二甲亚砜和水。7.根据权利要求l所述的克伦特罗检测试剂盒，其中，所述反应终止液为10%-15%的硫酸溶液。8.—种检测样品中残留的克伦特罗的方法，该方法包括以下步骤(1)检测样品的制备；(2)使用权利要求17中任一项所述的试剂盒检测克伦特罗；禾口(3)分析检测结果。9.根据权利要求8所述的方法，其中，向包被了克伦特罗抗体的微量测试孔中加入克伦特罗标准溶液或样品溶液和酶标克伦特罗溶液，竞争反应后，用清洗缓冲液洗板后加入等体积混合的底物溶液A和B，显色，然后加入反应终止液终止，用酶标仪测定吸光度值，其中，所述酶标克伦特罗溶液为用所述酶标稀释液稀释浓縮酶标记物得到的溶液。10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述样品为尿液、血清、动物组织、器官或饲料。全文摘要本发明提供了一种克伦特罗检测试剂盒，其包括包被了克伦特罗抗体的微量测试孔、克伦特罗标准溶液、清洗缓冲液、浓缩酶标记物、底物溶液A、底物溶液B、反应终止液和酶标稀释液。本发明还公开了使用上述试剂盒检测克伦特罗的方法，其包括以下步骤检测样品的制备；使用本发明的试剂盒检测克伦特罗；和分析检测结果。本发明的克伦特罗检测试剂盒，除可用于尿液检测以外，同时着重于对血清样本的检测，使检验结果更准确、更稳定；也可以对饲料、肌肉、组织等样品进行检测。该试剂盒简化了样品处理方式，使用简便，省时省力省钱，整个操作过程不到40分钟，回收率为80％～120％，灵敏度可达到0.05ppb。文档编号G01N33/543GK101776684SQ20101011056公开日2010年7月14日申请日期2010年2月12日优先权日2010年2月12日发明者李康,肖理文,胡佳骏,董国秀,蔡晓帆,郭晓梅申请人:上海优你生物科技股份有限公司