克伦特罗适配体与检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种克伦特罗适配体以及检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。本发明所述的克伦特罗适配体为含有GGATATTGG序列、长度为13-18个碱基的单链DNA探针，且3’端修饰了3’-NH2-(CH2)7-。该传感器提高了检测克伦特罗的灵敏性，最低可以检测出1.0pg/mL的克伦特罗；大大降低了检测克伦特罗的成本，操作简单方便，可实现对克伦特罗的快速检测。
【专利说明】克伦特罗适配体与检测克伦特罗的适配体电化学生物传感 器 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于检测【技术领域】，涉及一种克伦特罗适配体以及检测克伦特罗的适配体 电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。 【背景技术】
[0002] 克伦特罗（(：161*1^61'〇1，0^)，化学命名为人-[(叔丁氨基）甲基]-4-氨基-3， 5_二氯苯甲醇盐酸盐，分子量为277. 19,分子式C12H18C12N20,是一种人工合成的化学物质， 化学结构式如下：
[0003]
【权利要求】
1. 一种克伦特罗适配体，其特征在于，所述适配体为含有GGATATTGG序列、长度为 13-18个碱基的单链DNA探针，即XnGGATATTGGYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，η和m表 示整数。
2. 根据权利要求1所述的克伦特罗适配体，其特征在于：所述适配体的3'端进行氨基 修饰。
3. 根据权利要求1所述的克伦特罗适配体，其特征在于：所述3'端氨基修饰基团 为-NH2 _ (CH2) 7-。
4. 一种检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，其特征在于：所述的电化学生物传 感器中含有如权利要求1至3之一所述的适配体。
5. 如权利要求4所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声 清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25°C 下活化10分钟，得到活化的裸金电极； (2) 活化电极的适配体修饰：合成如权利要求1所述的适配体，配制100 μ mol/L的适 配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2 μ mol/L适配体组装液；将步骤（1)所得的活化的裸 金电极浸入适配体组装液中，4°C下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。
6. 根据权利要求4所述的适配体电化学生物传感器可以用于克伦特罗的检测。
7. -种基于如权利要求4所述的适配体电化学生物传感器的检测克伦特罗的方法，其 特征在于，包括以下步骤： (1)对克伦特罗标准溶液进行检测，建立标准曲线： 将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl (饱和KC1)电极作为参比 电极，钼丝电极作为对电极； 将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓 度为 5mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为 1 :1 的含 0. lmol/L KC1 的电解液中，进行交 流阻抗分析，初始电位为〇. 22V，频率为0. 1-1. 0X105Hz，得到适配体电化学生物传感器的 交流阻抗图谱及其阻抗值RetO ; 将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1. 〇pg/mL的 克伦特罗水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的克伦特 罗，然后置于浓度为5mmol/L的1( 3%_)6]/1(4%_)6]为1 :1的含0. lmol/L KC1的电 解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为〇. 22V，频率为0. 1-1. 0X105Hz，得到浓度为1. Opg/ mL的克伦特罗标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Retl ; 同理，将上述修饰电极依次放入浓度5. 0pg/mL、10. 0pg/mL、50. 0pg/mL、l. OX 102pg/ mL、5. 0 X 102pg/mL、1. 0 X 103pg/mL、5. 0 X 103pg/mL的克伦特罗标准液中，分别于室温下 孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn(η =2, 3···8)，并计算各标准液相对初始的适配体电化学生物传感器的阻抗变化值Λ Ret， Λ Ret为各标准液对应的阻抗值Retn (η = 1，2, 3…8)减去适配体电化学生物传感器对应 的阻抗值RetO ; 以浓度为 1. 0pg/mL、5. 0pg/mL、10. 0pg/mL、50. 0pg/mL、1. 0 X 102pg/mL、5. 0 X 102pg/mL、 1. OX 103pg/mL、5. OX 103pg/mL的克伦特罗标准液浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对 应的阻抗变化值Λ Ret为纵坐标作图，建立标准曲线； (2)对含克伦特罗的样品溶液进行定量检测： 根据GB/T 5009. 192-2003所述方法对样品中的克伦特罗进行提取纯化；将得到的克 伦特罗干粉用超纯水溶解后过〇. 45 μ Μ滤膜，然后进行电化学检测； 将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从样品溶液中提 取纯化得到的克伦特罗水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度 为 5mmol/L WK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为 1 :1 的，含浓度 0· lmol/L KC1 的电解液中，进行 交流阻抗分析，初始电位为0. 22V，频率为0. 1-1. 0X105Hz，得到样品中克伦特罗溶液检测 的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets ; 通过步骤（1)建立的标准曲线，计算出Rets-RetO对应的克伦特罗浓度，即为样品中克 伦特罗的浓度。
【文档编号】C12N15/115GK104109677SQ201410369878
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】刘大岭, 陈丹, 姚冬生, 谢春芳 申请人:暨南大学