专利名称：一种盐酸克伦特罗检测试剂盒及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种盐酸克伦特罗检测试剂盒及其制备和使用方法，具体地说是一种采用直接竞争化学发光免疫方法检测盐酸克伦特罗的试剂盒及其制备和使用方法，属于瘦肉精检测领域。
背景技术：
盐酸克伦特罗(elenbuterol hydroehloride，简称CL)是一种β 2_肾上腺素受体激动剂，商品名为氨哮素、克喘素，是儿茶酚胺的一种衍生物，俗称“瘦肉精”。将一定量的CL 添加到饲料中，能明显促进动物生长率和饲料转化率，促进动物脂肪分解，瘦肉率提高10% 左右。随着CL在畜牧生产中的应用，人们发现CL能在动物体内蓄积残留，导致食用中毒。 CL中毒会对人的身体健康造成严重的危害，其症状包括血压升高、血管扩张、心跳加快、 呼吸加剧、体温升高、肌肉颤抖、头痛、胸闷、神经过敏、肌肉疼痛、心悸、恶心、呕吐等。由于 CL作为饲料添加剂的危害严重，上世纪90年代，欧洲等国家纷纷颁布法规，严禁将CL用作促生长剂。我国农业部在1997年3月(农牧发[1997] 3号文)严令禁止肾上腺素在动物生产中的应用，但目前国内非法滥用的情况依然严重。
目前检测CL的方法主要有HPLC-MS (高效液相色谱-质谱)、GC_MS (气相色谱-质谱)和ELISA (酶联免疫吸附法)法。HPLC-MS和GC-MS两种方法所需的设备昂贵、操作复杂，通常作为定量和确证方法；ELISA方法操作简单、快速，但其灵敏度低，适用于定性和半定量，通常用作大规模样品筛选。
化学发光免疫分析法(chemilumi-nescence immunoassay, CLIA)是将免疫反应禾口化学发光反应相结合以检测抗原或抗体的免疫技术，它以化学发光物质或酶为标记物，直接标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入发光底物。利用发光信号检测仪测量发光强度，根据化学发光标记物与发光强度的关系计算出被测物的含量(Shelver等，200 。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的成本低、速度快、特异性强、样品与处理简单和选择性强等优点，非常适合快速检测。
目前化学发光酶免疫分析技术在环境监测、食品安全、制药和临床医学等领域有较大发展。前人采用间接竞争化学发光酶免疫分析法对猪尿样中的CL进行检测，检测灵敏度分别为0. 08Pg/L和0. OlPg/L，但方法只限于猪尿样中CL的测定；有些采用间接竞争化学发光酶免疫法测定沙丁胺醇和CL，但操作繁琐耗时。发明内容
为了解决上述问题，本发明设计了盐酸克伦特罗检测试剂盒及其制备和使用方法，该试剂盒能够对盐酸克伦特罗进行快速检测，且结果准确，误差小，检测灵敏度高，对检测设备要求低。
本发明的技术方案为一种盐酸克伦特罗检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的盐酸克伦特罗酶标板，以及盐酸克伦特罗标准溶液、盐酸克伦特罗酶结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物；所述酶标板的板孔包被有固相化的盐酸克伦特罗抗体；所述盐酸克伦特罗标准溶液包括浓度依次为0 ng/ml,0. 1 ng/ml,0. 3 ng/ml,0. 9 ng/ ml、2. 7 ng/ml、8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗溶液；所述盐酸克伦特罗酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的盐酸克伦特罗抗原； 所述稀释液为PH=7. O的0. OlM的磷酸盐缓冲溶液；所述浓缩洗涤液为含有体积分数0. 05%的吐温-20、PH=7. 5浓度0. lmol/L的磷酸盐缓冲液；所述第一底物为每250ml含有BSA 2. 5g、Trisl. 5g、鲁米诺0. 05g、对位碘酚0. 0075g, pH=9. 0的溶液；所述第二底物为每250ml含有BSA 2. 5g、Trisl. 5g、过氧化氢0. 25ml，pH=9. 0的溶液。
上述盐酸克伦特罗检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤 (1)盐酸克伦特罗酶标板的制备1. 1包被液的配制稀释配制2Pg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液；1. 2包被量将酶标板的板孔加入上述制备的包被液100μ1，4 包被48小时；1. 3洗涤将上述包被后的酶标板用浓缩洗涤液洗涤两次；1.4封闭将上述洗涤后的酶标板板孔每孔加封闭液130μ1，室温20-25°C封闭3小时； 1. 5干燥将上述封闭后的酶标板板孔中的封闭液甩出，然后18-25°C干燥48小时；1.6将上述干燥后的酶标板装入铝箔袋，封口，备用。
(2)盐酸克伦特罗标准溶液的配制2.1制备浓度为lOOPg/L的盐酸克伦特罗溶液；_20°C避光保存； 2. 2配制8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液；2. 3将8. lng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液用稀释液进行倍比稀释，依次配制2. 7 ng/ ml,0.9 ng/ml,0.3 ng/ml,0. 1 ng/ml标准品溶液；0 ng/ml为未添加盐酸克伦特罗的稀释液。
(3)盐酸克伦特罗酶结合物的制备用辣根过氧化物酶标记盐酸克伦特罗抗原，工作浓度为体积比1: 2000，得到盐酸克伦特罗酶结合物。
(4)稀释液的配制配制pH=7. 0的0. OlM PBS溶液。
(5)浓缩洗涤液的配制配制含有体积分数0. 05%吐温-20、PH=7. 5,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液作为浓缩洗涤液。
(6)第一底物的配制称取BSA 2. 5g、Tris 1. 5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml ；再用HCl调节pH至 9.0，完全混勻；再称取鲁米诺0. 05g、对位碘酚0. 0075g，倒入上述容量瓶，充分溶解，摇勻； (7)第二底物的配制称取BSA 2. 5g、Trisl. 5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml ；再用HCl调节PH至9. 0，完全混勻；取0. 25ml H2O2加入上述液体中，混勻。
上述盐酸克伦特罗检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)样品的制备 1.1尿液样品离心清亮尿样可直接测定；如尿样浑浊，则需过滤或3000r离心5min，取上清液 50 μ 1检测；检测稀释倍数1; 1.2饲料样品取Ig均质化后的饲料样品于50ml试管中，加入IOml 0. IM的HCl溶液，用振荡器剧烈振荡5min，3000r离心IOmin ；取上述离心后的上清液Iml加入20 μ 1 IM氢氧化钠溶液混勻；3000 r离心10分钟；取50 μ 1上清液用于检测，检测稀释倍数10 ； 1.3肌肉、肝等组织称取3. 0士0. 05g均质化后的组织样本至50ml离心管中；加入6ml 3%的三氯乙酸，用振荡器振荡摇至均勻，颠倒混勻IOmin ；3000r以上离心10分钟；将上述离心后的上清液取 3ml转入20ml试管，加3ml异丙醇-乙酸乙酯混合液，体积比2 :3，震荡lOmin，静置5min ； 然后，3000r以上离心10分钟；取1. 5ml上述离心后的上层有机相于小烧杯或玻璃试管中， 60°C氮气吹干；用2ml稀释液充分溶解；取50 μ 1上清液用于检测，检测稀释倍数4 ； 1.4肌肉蒸煮法称取IOg均质化后的肌肉样本于50ml离心管中；将离心液放入沸水浴中蒸IOmin ；/K 浴后取上层渗出液1ml，直接取50 μ 1用于检测，检测稀释倍数1 ；(2)加样检测步骤(室温25°C条件下操作) 将在冷藏环境中贮藏的试剂室温25°C平衡；2. 1 将浓度分别为0 ng/ml、0. 1 ng/ml、0. 3 ng/ml、0. 9 ng/ml、2. 7 ng/ml、8. 1 ng/ml 的盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品按浓度由低到高加入酶标板的板孔中，每孔50μ 1 ；2. 2然后将100 μ 1稀释的酶结合物即辣根过氧化物酶标记的CL抗原，1:2000稀释倍数，加入到板孔底部，用震荡机震荡30秒，盖上封板膜，25°C温育30分钟；2. 3用洗涤液洗涤，方法是向板孔中每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干，重复5次；2. 4第一底物和第二底物以体积比1 :1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50 μ 1，震荡 20秒；2. 5震荡后10分钟测定结果，使用微孔板化学发光免疫分析仪及化学发光检测软件进行分析。
(3)检测结果根据各标准溶液发光值，借助化学发光检测软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择 X-Y，得标准曲线，根据标准曲线即可推算出盐酸克伦特罗的浓度，然后乘上相应的稀释倍数，即获得样品稀释前实际的克伦特罗含量。
本发明检测原理是采用直接竞争化学发光一步法进行检测，测定基础是抗原抗体反应。酶标板微孔包被有针对CL的抗体，反应过程中，样本中游离的CL与酶标记的CL竞争结合酶标板微孔中固相化的抗体，然后通过洗涤液的洗涤去除未结合酶标记的CL，再加入发光底物，根据发光值与样品中的CL浓度成反比，从而得到被检测物质的含量。
本发明的优点在于本发明采用直接竞争化学发光免疫方法检测CL残留，样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了光源稳定性、光散射、光波选择器等各种可能因素给分析带来的影响，分析结果灵敏、稳定、可靠。另外，该方法操作步骤少、样品前处理简便、所需设备易于普及，能够用于猪肉中CL残留的测定，灵敏度达0. 03Pg/kg，且检测时间比ELISA法缩短了 30 min，能满足盐酸克伦特罗残留的快速检测要求。
图1为本发明实施例的盐酸克伦特罗标准曲线图(相关系数r=0. 9995)。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
1、一种盐酸克伦特罗检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的盐酸克伦特罗酶标板， 以及盐酸克伦特罗标准溶液、盐酸克伦特罗酶结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物；所述盐酸克伦特罗酶标板为96孔/板(12条X8孔)包被有固相化的盐酸克伦特罗抗体；所述盐酸克伦特罗标准品:6Xlml/瓶，分别为浓度0，0. 1，0.3，0.9，2. 7，8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液；盐酸克伦特罗酶结合物为辣根过氧化物酶标记的盐酸克伦特罗抗原，工作浓度为体积比1 2000，即1体积酶标抗原+2000体积的酶稀释液，2瓶(6ml/瓶)CL酶结合物； 稀释液:pH=7. 0的0. OlM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，1瓶40ml ； 第一底物1瓶:3ml，每250ml第一底物溶液含有BSA (N, 0-双三甲硅基乙酰胺)2. 5g、 Trisl. 5g、鲁米诺 0. 05g、对位碘酚 0. 0075g ；第二底物1瓶:3ml，每250ml第二底物溶液含有BSA 2. 5g、Trisl. 5g、过氧化氢 0. 25ml ；在整个试剂盒内还包括用于防止潮湿的干燥剂，用于存放一次实验未用完板条的自封袋，用于实验时避光的封板膜说明书。
2、上述盐酸克伦特罗检测试剂盒的制备方法，包括 2. 1盐酸克伦特罗酶标板的制备2. 1. 1包被液的配制用0. lmol/L碳酸盐缓冲液(例如配方:0. 34g Na2CO3 + 0. 57g Na2HCO3,定容至100ml)将3mg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液稀释成2Pg/ml ；2. 1. 2包被量将酶标板的板孔每孔加入上述制备的包被液100μ1，4 包被48小时； 2. 1. 3洗涤将上述包被后的酶标板用浓缩洗涤液洗涤两次，方法为将浓缩洗涤液按 1:40稀释，即1体积浓缩洗涤液+39体积蒸馏水，间隔0秒，在洁净纱布或吸水纸上拍干； 2. 1. 4封闭将上述洗涤后的酶标板板孔每孔加封闭液130μ1，室温20_25°C封闭3小时；封闭液组成配方为NaHCO3 2. 93g + Na2CO3 1. 59g + BSA 10g，纯水定容 1000ml ；2. 1. 5干燥将上述封闭后的酶标板板孔中的封闭液甩出，然后18-25°C干燥48小时； 2. 1. 6将上述干燥后的酶标板装入铝箔袋，真空包装机封口，备用。
2. 2盐酸克伦特罗标准溶液的配制2. 2. 1称取0. Olg盐酸克伦特罗标准品，蒸馏水定容为100ml，得到浓度为lOOPg/L的盐酸克伦特罗溶液，定为储备液1 ；_20°C避光保存；2. 2. 2根据需要用量，将储备液1用蒸馏水再稀释，使用移液器准确量取810μ 盐酸克伦特罗储备液1，用蒸馏水定容为IOOmL,作为盐酸克伦特罗储备液2，-20°C避光保存；2. 2. 3量取Iml克伦特罗储备液2，用稀释液定容为100ml，得到8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液；2. 2. 4将8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液进行倍比稀释，依次配制2. 7 ng/ml,0. 9 ng/ml,0.3 ng/ml,0. 1 ng/ml标准品溶液；0 ng/ml为未添加盐酸克伦特罗的稀释液。
2. 3盐酸克伦特罗酶结合物的制备用辣根过氧化物酶标记盐酸克伦特罗抗原，工作浓度为体积比1: 2000，得到盐酸克伦特罗酶结合物。
2. 4稀释液的配制用托盘天平准确称量 NaCl 7g、Na2HPO4'12H20 2. 8g、KH2PO4 0. 2g、KCl 0. 2g、叠氮钠 0. Ig加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；量取小牛血清200ml加入容量瓶，搅拌均勻，以纯水定容至1000ml，即得pH=7. 0的0. OlM PBS溶液。
2. 5浓缩洗涤液的配制配制含有体积分数0. 05%吐温-20、pH=7. 5,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液作为浓缩洗涤液。
2. 6第一底物的配制用电子天平准确称取BSA (队0-双三甲硅基乙酰胺)2.58、扑化1.5g，加入容量瓶；加适量纯水，轻摇使之溶解完全，以纯水定容至250ml ；用HCl调节pH至9. 0，完全混勻；再用电子天平准确称取鲁米诺0. 05g、对位碘酚0. 0075g，倒入容量瓶，充分溶解，摇勻。
2. 7第二底物的配制用电子天平准确称取BSA 2. 5g、Trisl. 5g，加入容量瓶；加适量纯水，轻摇使之溶解完全，以纯水定容至250ml ；再用HCl调节PH至9. 0，完全混勻；用加样器取0. 25ml H2O2加入上述液体中，混勻。
3、上述盐酸克伦特罗检测试剂盒的参数要求 3.1最低检出量重复测定零标准品10次，计算出发光值的均值(i)和标准差(s)，将(i -2s)的值带入反应曲线，计算出相应浓度值。
结果最低检出量为0. 03ng/ml (国家要求不高于0. ^g/ml)。
权利要求
1.一种盐酸克伦特罗检测试剂盒，其特征在于包括盒体、设在盒体内的盐酸克伦特罗酶标板，以及盐酸克伦特罗标准溶液、盐酸克伦特罗酶结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物；所述酶标板的板孔包被有固相化的盐酸克伦特罗抗体；所述盐酸克伦特罗标准溶液包括浓度依次为0 ng/ml,0. 1 ng/ml,0. 3 ng/ml、0.9 ng/ ml、2. 7 ng/ml、8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗溶液；所述盐酸克伦特罗酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的盐酸克伦特罗抗原；所述稀释液为PH=7. O的0. OlM的磷酸盐缓冲溶液；所述浓缩洗涤液为含有体积分数0. 05%的吐温-20、PH=7. 5浓度0. lmol/L的磷酸盐缓冲液；所述第一底物为每250ml含有BSA 2. 5g、Trisl. 5g、鲁米诺0. 05g、对位碘酚0. 0075g, pH=9. 0的溶液；所述第二底物为每250ml含有BSA 2. 5g、Trisl. 5g、过氧化氢0. 25ml，pH=9. 0的溶液。
2.如权利要求1所述的盐酸克伦特罗检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)盐酸克伦特罗酶标板的制备·1. 1包被液的配制稀释配制2Pg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液；·1. 2包被量将酶标板的板孔加入上述制备的包被液100μ1，4 包被48小时；·1. 3洗涤将上述包被后的酶标板用浓缩洗涤液洗涤两次；·1.4封闭将上述洗涤后的酶标板板孔每孔加封闭液130μ1，室温20-25°C封闭3小时；·1. 5干燥将上述封闭后的酶标板板孔中的封闭液甩出，然后18-25°C干燥48小时；·1.6将上述干燥后的酶标板装入铝箔袋，封口，备用；(2)盐酸克伦特罗标准溶液的配制·2.1制备浓度为lOOPg/L的盐酸克伦特罗溶液；_20°C避光保存；·2. 2配制8. 1 ng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液；·2. 3将8. lng/ml的盐酸克伦特罗标准溶液用稀释液进行倍比稀释，依次配制2. 7 ng/ ml,0.9 ng/ml,0.3 ng/ml,0. 1 ng/ml标准品溶液；0 ng/ml为未添加盐酸克伦特罗的稀释液；(3)盐酸克伦特罗酶结合物的制备用辣根过氧化物酶标记盐酸克伦特罗抗原，工作浓度为体积比1: 2000，得到盐酸克伦特罗酶结合物；(4)稀释液的配制配制pH=7. 0的0. OlM PBS溶液；(5)浓缩洗涤液的配制配制含有体积分数0. 05%吐温-20、PH=7. 5,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液作为浓缩洗涤液；(6)第一底物的配制称取BSA 2. 5g、Tris 1. 5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml ；再用HCl调节pH至 9.0，完全混勻；再称取鲁米诺0. 05g、对位碘酚0. 0075g，倒入上述容量瓶，充分溶解，摇勻；(7)第二底物的配制称取BSA 2. 5g、Trisl. 5g，加入容量瓶；加水溶解，定容至250ml ；再用HCl调节PH至 9. 0，完全混勻；取0. 25ml H2O2加入上述液体中，混勻。
3.如权利要求1所述的盐酸克伦特罗检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)样品的制备·1.1尿液样品离心清亮尿样可直接测定；如尿样浑浊，则需过滤或3000r离心5min，取上清液 50 μ 1检测；检测稀释倍数1;·1.2饲料样品取Ig均质化后的饲料样品于50ml试管中，加入IOml 0. IM的HCl溶液，用振荡器剧烈振荡5min，3000r离心IOmin ；取上述离心后的上清液Iml加入20 μ 1 IM氢氧化钠溶液混勻；3000 r离心10分钟；取50 μ 1上清液用于检测，检测稀释倍数10 ；·1.3肌肉、肝等组织称取3. 0士0. 05g均质化后的组织样本至50ml离心管中；加入6ml 3%的三氯乙酸，用振荡器振荡摇至均勻，颠倒混勻IOmin ；3000r以上离心10分钟；将上述离心后的上清液取 3ml转入20ml试管，加3ml异丙醇-乙酸乙酯混合液，体积比2 :3，震荡lOmin，静置5min ； 然后，3000r以上离心10分钟；取1. 5ml上述离心后的上层有机相于小烧杯或玻璃试管中， 60°C氮气吹干；用2ml稀释液充分溶解；取50 μ 1上清液用于检测，检测稀释倍数4 ；·1.4肌肉蒸煮法称取IOg均质化后的肌肉样本于50ml离心管中；将离心液放入沸水浴中蒸IOmin ；/K 浴后取上层渗出液1ml，直接取50 μ 1用于检测，检测稀释倍数1 ；(2)加样检测将在冷藏环境中贮藏的试剂室温25°C平衡；·2. 1 将浓度分别为0 ng/ml、0. 1 ng/ml、0. 3 ng/ml、0. 9 ng/ml、2. 7 ng/ml、8. 1 ng/ml 的盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品按浓度由低到高加入酶标板的板孔中，每孔50μ 1 ；·2. 2然后将100 μ 1稀释的酶结合物即辣根过氧化物酶标记的CL抗原，1:2000稀释倍数，加入到板孔底部，用震荡机震荡30秒，盖上封板膜，25°C温育30分钟；·2. 3用洗涤液洗涤，方法是向板孔中每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干，重复5次；·2. 4第一底物和第二底物以体积比1 :1混合均勻，加入到板孔中，每孔加入50 μ 1，震荡 20秒；·2. 5震荡后10分钟测定结果，使用微孔板化学发光免疫分析仪及化学发光检测软件进行分析；(3)检测结果根据各标准溶液发光值，借助化学发光检测软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择 X-Y，得标准曲线，根据标准曲线即可推算出盐酸克伦特罗的浓度，然后乘上相应的稀释倍数，即获得样品稀释前实际的克伦特罗含量。
全文摘要
本发明公开了一种盐酸克伦特罗检测试剂盒及其制备和使用方法，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的盐酸克伦特罗酶标板，以及盐酸克伦特罗标准溶液、盐酸克伦特罗酶结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物；所述制备方法包括酶标板、标准溶液、结合物、稀释液、浓缩洗涤液、第一底物和第二底物配制；所述使用方法包括样品的制备、加样检测、检测结果分析；本发明的优点在于分析结果灵敏、稳定、可靠，该方法操作步骤少、样品前处理简便、所需设备易于普及，能够用于猪肉中CL残留的测定，灵敏度达0.03μg/kg，且检测时间比ELISA法缩短了30min，能满足盐酸克伦特罗残留的快速检测要求。
文档编号G01N33/535GK102520155SQ201110414539
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者刘发新, 孙明强, 杨致亭, 管廷武, 陶德友 申请人:潍坊市康华生物技术有限公司