专利名称：盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸及制备方法
技术领域：
本发明属于生物学免疫方法的测定试纸及制备方法。
背景技术：
盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride)，又称瘦肉精，是饲料和养殖生产禁止使用的β-兴奋剂类药品，这种药品在畜产品中残留积蓄，通过食物链导致人类产生急性中毒和其他影响，是被全面禁止用作食用动物的促生长剂。根据农业部“食品动物禁用的兽药及其它化合物清单”规定，在10-9ppb数量级上不得检出。目前检测中使用较多的是酶联免疫法(ELISA)试剂盒，它具有抗原-抗体特异反应性，能够定性被测样品结果，即不出现假阴性和尽可能少的假阳性，该法通常作为大量样品的筛选检测，需要酶标仪、离心机及分析天平等仪器，分析和测定步骤都较繁琐。对于定性或定量分析检测有多种方法和技术，如应用两种以上检测原理的高效液相色谱法HPLC或气相色谱法GC，或带连字符(hyphenated)检测技术，即色谱与质谱联用技术-GC-MS或LC-MSn，由此得到待测化合物结构本质质谱图。但该法需要大型仪器，需要特殊场地和专业人员，分析费用高，前处理比较费时。
为了简便临床医学抗体、抗原或半抗原检验，在此之前，申请人取得了“一种不孕检测试纸及其检测方法”(00112780.2中国发明专利公报)、“一种人体全血清或血清总总灰区值检测及前列腺癌症检测试纸”(01129174.5中国发明专利公报)等多项发明专利权。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够半定量检测克伦特罗，快速、准确的胶体金法测试试纸及试纸的制备方法。
本发明通过以下途径实现上述目的盐酸克伦特罗检测试纸，包括固定在底板7上的硝酸纤维素膜6，其特征是金标抗克伦特罗单抗2、克伦特罗偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4，间隔地顺序与硝酸纤维素膜6表面形成复合层。
所述底板7中部固定硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜6一端与上吸水垫5串联；而另一端或者与下吸水垫1串联，或者通过固定于硝酸纤维素膜6一端的金标抗克伦特罗单抗2部分交叠再与下吸水垫1相连。
所述下吸水垫1、金标抗克伦特罗单抗2及上吸水垫5表面有不干胶纸。
上述膜条宽度分为2.5mm、3.0mm、4.0mm三种类型。
盐酸克伦特罗检测试纸的制备方法包括敷在底板7上的硝酸纤维素膜6，其特征是(1)克伦特罗与大分子蛋白结合成克伦特罗偶联抗原3免疫鼠细胞的克隆得到抗克伦特罗单抗，(2)胶体金颗粒标记抗克伦特罗单抗形成金标抗克伦特罗单抗2，(3)抗克伦特罗单抗免疫种属相异动物得到抗鼠IgG抗体4，(4)将胶体金标记抗克伦特罗单抗2、克伦特罗偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4间隔地顺序附着在硝酸纤维素膜6上，其中，以克伦特罗偶联抗原3为检测带，以抗鼠IgG抗体4为参照带。
抗克伦特罗单抗由克伦特罗偶联抗原免疫鼠细胞，以鼠腹水形式制备，抗体效价不低于15000，或有效抗体含量大于0.5mg/ml。
所述底板7中部固定硝酸纤维素膜6，下吸水垫1和上吸水垫5分别地贴于底板7两端与硝酸纤维素膜6串联；下吸水垫1或者与固定于硝酸纤维素膜6一端的金标抗克伦特罗单抗2部分交叠。
所述下吸水垫1、金标抗克伦特罗单抗2及上吸水垫5表面贴有不干胶纸。
本发明检测原理是利用吸水垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测抗原首先与胶体金标记的抗克伦特罗单抗发生竞争形式的结合，其后果是，当胶体金标记的抗克伦特罗单抗过量时，多余的单抗漂移到检测带，与克伦特罗偶联抗原结合并显色；而与抗原结合的胶体金标记的抗克伦特罗单抗，其V区结合位点被检测抗原占据，只能跨越检测带漂移到参照带以C区位点与抗鼠IgG抗体非特异性结合，同检测带进行比色而得到检测结果。
本发明应用层析式一步竞争法原理，试纸中上下带比色来半定量检测血清或尿液样品中的克伦特罗残留量，以1ppb(1ng/ml)的精度、在5-10min内，快速准确地检测出样品是否含有盐酸克伦特罗，以确定盐酸克伦特罗是否超标，能够满足食品安全对克伦特罗残留量检测需求，适用于饲料、屠宰企业及政府检测机构。
本发明与现有技术相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
图1是本发明俯视图。
图2是本发明下吸水垫1与金标抗克伦特罗单抗2部分交叠的侧视图。
图3是本发明下吸水垫1与硝酸纤维素膜6串联的侧视图。
具体实施例方式
以下结合附图做进一步说明。
1、盐酸克伦特罗检测试纸包括下吸水垫1、金标抗克伦特罗单抗2、克伦特罗偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4、上吸水垫5、硝酸纤维素膜6、底板7。
其中，以克伦特罗偶联抗原3作为检测带，以抗鼠IgG抗体4作为参照带。
膜条宽度不低于2.5mm，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5mm/min。
2、盐酸克伦特罗检测试纸的制备将克伦特罗与牛血清蛋白分子结合成克伦特罗偶联抗原3，用抗原3免疫鼠细胞的克隆以鼠腹水形式制备，抗体效价为15000，从而获得抗克伦特罗单抗；用胶体金颗粒标记抗克伦特罗单抗形成金标抗克伦特罗单抗2；抗克伦特罗单抗免疫羊得到羊抗鼠IgG抗体4。
将金标抗克伦特罗单抗2、克伦特罗偶联抗原3、羊抗鼠IgG抗体4间隔3-5mm顺序敷于底板7中部的的硝酸纤维素膜6上，与硝酸纤维素膜6表面形成复合层。
图2是将下吸水垫1粘贴于底板7靠金标抗克伦特罗单抗2一端，并与硝酸纤维素膜6表面的金标抗克伦特罗单抗2部分交叠；上吸水垫5粘贴于底板7靠参照带4一端，并与硝酸纤维素膜6一端交叠。
图3是将下吸水垫1粘贴于底板7靠金标抗克伦特罗单抗2一端，并与硝酸纤维素膜6部分交叠；上吸水垫5粘贴同图2。
在下吸水垫1、金标抗克伦特罗单抗2及上吸水垫5表面有不干胶纸。
3、试纸要求(1)阴性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)配制浓度为100ng/ml的肾上腺素国家标准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)配制浓度为100ng/ml的特布他林国家标准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)配制浓度为100ng/ml的沙丁胺醇国家标准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
(2)阳性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)配制浓度为10、50、100ng/ml的克伦特罗国家标准品进行平行检测，各浓度进行10次平行实验，反应时间在5min时观察结果，不得出现阴性。
(3)最低检出量用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)分别配制浓度为0、0.5、1、2、5、10ng/ml的克伦特罗国家标准品溶液，各浓度进行10次平行实验，反应时间在5min时，以正常或矫正目力观察结果，最低检出量不高于1ng/ml。
(4)再现性用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，Ph7.4)分别配制浓度为10ng/ml的克伦特罗国家标准品溶液，进行10次平行实验，反应时间在5min时，以正常或矫正目力观察结果，结果一致，显色度均一。
(5)稳定性测试37□放置10天后，各项指标应符合以上要求。
4、试纸使用方法(1)样品制备血清抽取待检动物血液，离心或静置后取透明上清夜使用；若血清有过度溶血现象，将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验，否则试剂片红色太深，影响测试结果。
尿液用尿液直接进行测试，如浑浊，先离心取上清夜或蒸馏水1∶1稀释。
饲料取1g一磨碎的待测饲料加入10ml稀释液，其间每隔2min用力震荡；10min时，摇均后静置1min取上清夜100μl，用稀释液做10倍稀释后用试纸分析。
(2)操作将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫1。浸入30sec取出放平，10min读取结果。
(3)检测结果阴性两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明样品中不含盐酸克伦特罗。
两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明样品的盐酸克伦特罗含量低于1ppb(1ng/ml)。
阳性两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中盐酸克伦特罗含量超过1ppb(1ng/ml)。
检测带不显色，参照带显色，说明样品中的盐酸克伦特罗含量高于5ppb(5ng/ml)。
以上结果如下表所示
上表均以ppb或ng/ml为检测量的单位。检测带＞、≈、＜、0是与参照带颜色比较。
权利要求
1.盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸，包括固定于底板(7)的硝酸纤维素膜(6)，其特征是金标抗克伦特罗单抗(2)、盐酸克伦特罗偶联抗原(3)、抗鼠IgG抗体(4)，间隔地顺序与硝酸纤维素膜(6)形成复合层。
2.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸，其特征是底板(7)中部固定硝酸纤维素膜(6)，硝酸纤维素膜(6)一端与上吸水垫(5)串联；而另一端或者与下吸水垫(1)串联，或者与通过固定于硝酸纤维素膜(6)一端的金标抗克伦特罗单抗(2)与下吸水垫(1)相连。
3.根据权利要求1、2所述的盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸的制备方法，其特征是下吸水垫(1)、金标抗克伦特罗单抗(2)及上吸水垫(5)表面有不干胶纸。
4.盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸的制备方法，包括与底板(7)连接的硝酸纤维素膜(6)，其特征是(1)克伦特罗与动物大分子蛋白结合成克伦特罗偶联抗原(3)，用抗原(3)免疫鼠细胞的克隆得到抗克伦特罗单抗，(2)分别将抗克伦特罗单抗用胶体金颗粒标记形成金标抗克伦特罗单抗(2)及用抗克伦特罗单抗免疫种属相异动物获得抗鼠IgG抗体(4)，(3)将金标抗克伦特罗单抗(2)、克伦特罗偶联抗原(3)、抗鼠IgG抗体(4)间隔地顺序附着于硝酸纤维素膜(6)上，其中，以克伦特罗偶联抗原(3)作为检测带，以抗鼠IgG抗体(4)作为参照带。
5.根据权利要求4所述的盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸的制备方法，其特征是底板(7)中部固定硝酸纤维素膜(6)，上吸水垫(5)和下吸水垫(1)分别贴于底板(7)上与硝酸纤维素膜(6)串联；下吸水垫(1)或者与固定于硝酸纤维素膜(6)一端的金标抗克伦特罗单抗(2)部分交叠。
6.根据权利要求4、5所述的盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸的制备方法，其特征是下吸水垫(1)、金标抗克伦特罗单抗(2)及上吸水垫(5)表面贴有不干胶纸。
全文摘要
盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸及制备方法，属于生物学免疫方法的测定试纸及制备。盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride)，即瘦肉精，是饲料和养殖生产禁止使用的β－兴奋剂类药品。本发明试纸用胶体金标记的克伦特罗单抗2、克伦特罗偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4固着在硝酸纤维素膜6和底板7上制成，并以克伦特罗偶联抗原3为检测带和抗鼠IgG抗体4为参照带。本发明用层析式一步竞争法原理，通过上下带比色，能以1ppb(1ng/ml)的精度、在5－10min内，半定量检测血清或尿液样品中的克伦特罗残留量。本发明是一种快速、准确、半定量检测克伦特罗残留量的试纸，能满足食品安全、饲料、屠宰企业及政府检测机构检测需求。
文档编号G01N33/558GK1818656SQ20061001072
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者马岚, 袁航, 葛长荣, 张曦 申请人:云南大学, 昆明云大生物技术有限公司, 马岚