培养破囊壶菌目微生物的方法

培养破囊壶菌目微生物的方法
【专利摘要】本发明涉及通过培养属于原生藻菌(Stramenopiles)的微生物来生产PUFAs的最适化方法，培养在使用碳酸钙稳定pH的发酵培养基中进行，该培养基含有3-15g/L?CaCO3，然后从微生物和/或培养基中分离PUFAs。本发明特别涉及含有不同CaCO3含量的新的最适化培养基。通过使用足够量的CaCO3，所述方法可以极大地简化生酵，同时在生物质中油含量增加了，从而可以获得较大量的DHA。这允许属于原生藻菌的微生物在不控制pH的情况下得到发酵，从而明显地提高并显著简化了PUFA的生产。
【专利说明】培养破囊壶菌目微生物的方法
[0001] 本申请为国际申请日2004年11月10日、国际申请号PCT/EP2004/012715 于2006年6月2日进入中国国家阶段、申请号200480035830. 2、发明名称"培养 Thraustochytriales属微生物的方法"的分案申请。
[0002] 各种不同的PUFAs(多不饱和脂肪酸），特别是ω-3脂肪酸（n-3脂肪酸）是人类 营养的必需成分。
[0003] 然而，已知在大多数工业化国家中，n-3脂肪酸的供给是不足的。与此相反，饮食中 的总脂肪比例以及饱和脂肪酸和n-6脂肪酸的摄入太高。这是由于我们的饮食结构发生的 变化，特别是在最近的大约150年间发生的变化所引起的，并与各种不同的文明化所带来 的慢性病，例如工业化国家主要的死亡原因-心血管疾病的出现相关联（Simopoulos, A. P.，1999, Am. J. Clin. Nutr. 70, 560-569)。同时，大量的研究显示，通过定向地增加 n-3脂 肪酸，特别是二十碳五烯酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)的摄入，可能极大地降低心 血管病的风险（GISSI-Prevenzione 研究人员（Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico), 1999，心肌梗塞后在饮食中供应n_3多不饱和 脂肪酸和维生素 E :GISSI_prevenzione 试验的结果，Lancet354, 447-455 ;Burr 等，1989， 脂肪、鱼类和纤维摄取量的变化对死亡和心肌梗塞的影响：饮食和再次梗塞试验（DART)， Lancet 2,757-761)。因此，许多不同的组织（1!10、?40、4撤、155?41^、不列颠营养基金会等） 推荐大量增加 n-3脂肪酸的摄入量（Kris-Eherton等，鱼类消费量、鱼油、ω-3脂肪酸和心 血管疾病，Circulation 2002, 2747-2757)。
[0004] 生产PUFAs以及特别是n-3脂肪酸的源泉为上述所有海洋冷水鱼类以及从它 们中提取的油，此外还包括海洋微生物，这些海洋微生物与鱼类相比的优势在于它们可 在成本效应和受控条件下进行发酵以生产PUFAs。发酵生产不存在任何污染的危险， 而对于鱼类或从其中提取的鱼油来说却经常被描述发生这样的问题（Olsen SF.Int J Epidemiol. 2001:1279-80)。此外，提取的鱼油的成分必然会受到对鱼的种类和培养条 件的选择的影响，而不易受到季节变化的影响，正如对于鱼类和鱼产品所描述的那样 (Gamez-Meza et al. Lipids 1999:639-42)。
[0005] 已经发现了许多适合于生产n-3PUFA的微生物，例如弧菌（Vibrio)属的细菌（例 如海产弧菌（Vibrio marinus))或甲藻（Dinophyta)，特别是隐甲藻（Crypthecodinium) 属中的微生物例如寇氏隐甲藻（C. cohnii)，或原生藻菌（Stramenopiles)例如 Pinguiophyceae 中的微生物例如 Glossomastix、Phaeomonas、Pinguiochrysis、 Pinguiococcus和Polydochrysis。优选的用于发酵生产PUFA的微生物属于原生藻菌 (Stramenopiles)(或网粘菌门（Labyrinthulomycota)),特别是 Thraustochytriales 目（Thraustchytriidea)中的微生物，又特别是 Japonochytrium、Schizochytrium、 Thraustochytrium、Althornia、Labyrinthuloides、Aplanochytrium 和 Ulkenia 属中的微 生物。
[0006] 已经知道一些上面提到的微生物可以用于工业化生产脂肪酸，相应的工艺方法已 经被描述。因此，国际专利申请WO 91/07498A1公开了使用破囊壶菌（Thraustochytrium) 和裂壶菌（Schizochytrium)属的生物来生产PUFAs。WO 91/11918A1公开了使用寇氏隐 甲藻（Crypthecodinium cohnii)生产 PUFAs，W0 96/33263A1 和相应的欧洲专利申请 EP 0 823 475 A1描述了使用裂壶菌（Schizochytrium)属的微生物生产PUFAs，而专利申请W0 98/03671公开了使用吾肯氏壶菌（Ulkenia)属的微生物生产PUFAs。
[0007] 上面描述的微生物特别是网粘菌门（Labyrinthulomycota)的自然栖息地是 海洋栖息地。因此，这些微生物通常培养在含盐的培养基中，对本发明来说，海水的 盐浓度被定为32-35g/L和90-95%含量的钠和氯。用于培养海洋微生物例如破囊壶 菌（Thraustochytrium)或裂壶菌（Schizochytrium)的典型培养基是基于海水（例如 ATCC(美国典型培养物保藏中心）的790By+培养基[酵母提取物l.Og，蛋白胨1.0g，D+葡 萄糖5. 0g，海水1L])。但是，也已经知道破囊壶菌目（Thraustochytriales)的微生物可以 在具有非常低盐度的培养基中存活。但是，当盐含量低于7. 5-15g/L的限度，对应于盐度 7. 5-15%。时，它的生长被描述为只是非常低，在低盐度范围内没有中间最大值。最适生长速 率只在高于上面提到的限度时才能获得（Fan等，Botanica Marina 45,2002,第50-57页）。
[0008] 在发酵过程中经常发生的问题是培养过程中强烈的pH变动，这是由于代谢产物 的出现和/或单一培养基成分的消耗的结果。这特别会发生在用于发酵海洋微生物的富 盐培养基中。为此，这样的发酵通常需要能够调节pH的方式。但是，在大规模发酵的情况 下，pH控制导致了很多附加的费用。这时，需要添加酸和碱的附加容器，它们本来可以用在 别处用于补加其它的成分。此外，用于pH值调节的滴定需要技术上的控制。对于网粘菌门 (Labyrinthulomycota)的发酵以在生产规模上获得PUFA来说，pH控制的培养方法现有技 术已经使用。
[0009] 然而在细胞培养中惯常使用的通过缓冲液系统控制pH值的方法有一些缺点。因 此，在PUFA发酵所需的pH范围内例如TRIS、HEPES和MOPS的缓冲容量是不足的，因为它们 的pK a值大于7。此外，在低于7. 5的pH范围TRIS不是一种好的缓冲液，会产生具有潜在 反应性的伯胺，积极参与多种生物反应。另一种也是经常使用的缓冲液--磷酸缓冲液，在 存在二价阳离子的情况下具有从溶液中沉淀出来的特点，因此对于需要或消耗磷酸的发酵 过程来说也是一种坏的选择。乙酸盐缓冲液也不适合，因为它们的缓冲范围狭窄，并且它们 在发酵过程中被代谢。此外，许多可以选择的缓冲系统由于高的费用而不够经济。
[0010] 因此，根据本【技术领域】的现状，本发明的一个目的是提供一种新的、简单而经济的 培养海洋微生物的方法。据此应该使工艺控制得到相当的简化。除了经济上合算之外，该 方法应该能够高产量地生产高纯度的PUFAs。 toon] 该任务以及其它虽没有明确地描述但可以从引言所述的关系中毫不费力地得出 或推演出的任务，可以通过在本发明权利要求中限定的目标来实现。
[0012] 权利要求1中限定的方法提供了一种有优势的培养破囊壶菌目微生物的方法。该 方法包括在其pH值完全通过CaC0 3进行稳定的培养基中培养，该培养基中的CaC03，其含量 是3-15g/L，并且如果适用，从微生物和/或培养基中分离PUFAs。
[0013] 本发明还包括了生产高纯度PUFAs的方法。
[0014] 按照本发明，优选的PUFAs是DHA、DPA和EPA。
[0015] 具体来说，通过上述方法培养的微生物表现出大于10%，优选情况下大于14%和 非常特别优选情况下大于18% DHA/干生物质的产量。
[0016] 具体来说，通过上述方法培养的微生物表现出大于1%，优选情况下大于2%和非 常特别优选情况下大于3% DPA/干生物质的产量。
[0017] 通过在培养后从微生物（生物质）和/或培养基中分离PUFAs，可以获得高产量和 高纯度的TOFAs。
[0018] 此外，本发明包括了生产生物质的方法，其中生物质是通过本发明的培养方法提 供的。
[0019] 该生物质可以以所有可以想象得到的方式使用。具体来说，该生物质可以以例如 干燥的形式（干生物质）使用，直接作为食品或动物饲料使用。
[0020] 此外，本发明还包括油状的形式，它是通过实施本发明的培养方法，然后从微生物 和/或培养基中分离该油状物而获得的。
[0021] 具体来说，这是除了许多其它优选应用之外，可以方便地用于人类营养的油状物。
[0022] 在本发明的条件下，微生物表现出每单位重量的干生物质大于30%，优选情况下 大于35%油状物的产量。
[0023] 根据本发明，油状物被理解为含有至少70%中性脂和至少2%磷脂，与本领域的 专业人员所熟知的正常的破囊壶菌目脂肪酸形式相一致。其中的中性脂组成为至少80%的 甘油三酯和其它化合物例如二酰基甘油、留醇等。此外甘油三酯的重量分数包括大约95% 的脂肪酸和5 %甘油。
[0024] 在没有极端的pH值调控的情况下，特别是在能够以高葡萄糖消耗进行快速生长 的条件下发酵海洋微生物生产PUFA的可能性，是绝对令人吃惊的。在缺少适当的pH控制 的条件下发酵海洋微生物确实会很快地导致培养基酸化，并导致生长停止（参见实施例1 以及 Wen, Z.-Y.和 Chen, F·，2003, Biotechnology Advances 21,273-294)。
[0025] 没有利用其它的pH值稳定方式，本发明的方法令人吃惊地成功了。在本发明中， pH值稳定方式被理解为从补料罐中根据培养过程中达到的pH值调节酸或碱的加入，也被 理解为在培养基本身中使用缓冲液系统，尽管本发明人没有了解到任何使用缓冲液系统例 如TRIS或磷酸盐缓冲液的经济上可利用的培养方法。
[0026] 根据本发明，CaC03是用于稳定pH值的主要方式。即使如此，在某些条件下可能也 需要向培养基中加入酸或碱来调整pH值。这种加入也包括在本发明中，只要CaC0 3仍然是 稳定pH值的主要方式就行。例如，如果在培养过程中由于微生物格外快速的生长使得pH值 下降到低于特定的靶值，可以暂时通过加入酸或碱调整到这个靶值，而这种添加不是pH值 调控的主要方式。
[0027] 术语pH值调控和pH值控制或pH值稳定在本发明中使用时具有同样的意义。
[0028] 根据本发明添加了 CaC03的各种情况下，当加入和不加入酸时测量的pH值的差值 小于或等于1时，优选小于或等于〇. 75时，特别优选小于或等于0. 5时，非常特别优选小于 或等于0. 2时，最特别优选小于或等于0. 1时，主要的方式仍然是CaC03。这样的酸和/或 碱的添加在本发明中被理解为少量地添加酸和/或碱，它们被包括在本发明中。
[0029] 优选的培养系统不需要使用任何酸和/或碱的添加。
[0030] 此外，任何可以替换的缓冲液系统由于与使用碳酸钙相比需要较高的花费，因而 都是不经济的。
[0031] 碳酸钙在培养破囊壶菌目的微生物时作为缓冲剂的高效能是令人吃惊的，因为唯 一形成的二氧化碳在水中只有有限的溶解度，这导致在发酵过程中缓冲能力的降低。
[0032] 令人吃惊的是，发酵不仅可能达到完全的葡萄糖消耗，而且除此之外当本发明使 用碳酸钙稳定培养基时，生物质中PUFA的比例也明显地增加了。更令人吃惊的是，葡萄糖 的利用以及与此相关的PUFA的生产加速了，从而导致空间-时间产率的提高。
[0033] 在本发明以前，没有已知的发酵工艺可以使用碳酸钙稳定pH的培养基在破囊壶 菌目的微生物中生产n-3脂肪酸，而不需要其它的pH值稳定方式。
[0034] PUFAs是多不饱和长链脂肪酸，链长大于C12,含有至少两个双键。可以按照本发 明的方法生产的PUFAs具体来说是n-3脂肪酸和n-6脂肪酸。
[0035] 在本发明中，n-3脂肪酸（ω-3脂肪酸）被理解为多不饱和长链脂肪酸，链长大于 C12,含有至少两个或以上双键，其中第一个双键位于从烷基末端开始的C3和C4碳原子之 间。因此，对于n-6脂肪酸来说，第一个双键位于从烷基末端开始的C6和C7碳原子之间。
[0036] 属于Labyrinthulomycota组的微生物被考虑用于按照本发明的方法生产PUFAs。 Thraustochytriales (Thraustchytriidea)目的微生物是优选的（Lewis, Τ· Ε·，Nichols, Ρ· 0.，1^]^61^11，1'.4.，111四1181:〇(31171：1'丨(18的生物技术潜力，海洋生物技术，1999,580-587 页； 和Porter, D.，原生生物手册中的Labyrinthulomycota门：动物、植物和真菌之外的真核 微生物及其后裔的结构、培养、栖息地和生活史：藻类、纤毛虫、有孔虫、sprorozoa、水霉和 其它原生生物指南。Margulis，L, Corliss, J.0.，Melkonian, M.和 Chapman, D.J.主编， McKhann，H.I.协编，Jones and Bartlett Publishers, ISBN 0-86720-052-91990, 388-398 页）° 特别优选的是 Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium Althornia ，Labyrinthuloides, Aplanochytrium 和 Ulkenia 属的微生物。其中，Schizochytrium、 Thraustochytrium 和 Ulkenia 是最特别优选的。特别优选的是：Japonochytrium sp.ATCC 28207,Thraustochytrium aureum(特别是ATCC 28211 和ATCC 34304)，Thraustochytrium roseum ATCC 28210, Thraustochytrium sp.ATCC 20890, ATCC 20891, ATCC 20892 和 ATCC26185,Schizochytrium aggregatum ATCC 28209,Schizochytrium sp.ATCC 20888 和 ATCC 20889, Schizochytrium SR21，以及 Ulkenia sp. SAM 2179 和 SAM 2180。
[0037] 适合用于本发明方法的微生物可以是野生型的，也可以是突变体和从它们衍生的 菌株以及相应生物体的重组菌株。本发明特别包括了用于提高PUFA产量的突变或重组菌 株。
[0038] 本发明的微生物通过用这些生物体的预培养物接种液体或固体培养基来进行培 养。
[0039] 适合于破囊壶菌目的微生物的培养技术对本【技术领域】的专业技术人员来说是众 所周知的。一般但不是绝对地来说，培养是通过在相应的容器中进行含水发酵来完成的。用 于这种类型发酵的典型容器的例子包括摇瓶或生物反应器，例如STRs (搅拌釜式反应器） 或泡罩塔。培养一般在温度为l〇°C到40°C之间，优选为20°C到35°C之间，特别优选为25°C 到30°C之间，更特别优选为27°C和29°C之间进行，特别是在28±0. 5°C下进行。
[0040] 在本发明的一个优选实施方案中，pH稳定的培养基中碳酸钙的含量相当于3g/L 到15g/L，优选4g/L到12g/L，特别优选5g/L到10g/L范围内的值。非常特别优选的碳酸 钙含量是7. 5±0. 5g/L。
[0041] 在优选情况下pH稳定的培养基还含有一种或多种碳源，以及一种或多种氮源。对 于本【技术领域】的专业技术人员来说，可用做培养破囊壶菌目的微生物的碳源和氮源的物质 是众所周知的。
[0042] 可以使用的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶淀 粉、岩藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、谷氨酸、糖蜜、甘油或甘露醇、或脂肪和油类或植物水解产 物。
[0043] 可以使用的天然氮源例如蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白 氨基酸、玉米浆或大豆，可以使用的有机氮源例如谷氨酸和尿素，无机氮源例如乙酸铵、碳 酸氢铵、硫酸铵或硝酸铵也可以被用做氮源。
[0044] 除了碳酸钙之外，pH稳定的培养基可以含有本领域的专业技术人员所熟知的能够 协助破囊壶菌目的微生物培养的所有其它成分，特别是例如Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo 或Zn的无机盐。可以列举的例子有磷酸盐例如磷酸氢钾，或氯化物例如氯化镁，硫酸盐例 如硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁或硫酸钠。其它可以使用的无机盐例如卤化物，例如溴化钾或碘 化钾，以及其它的碳酸盐例如碳酸氢钠。
[0045] 在适合的情况下，培养基可以含有添加的大量或微量营养素，例如氨基酸、嘌呤、 嘧啶、玉米浆、蛋白水解物、（水溶性和/或水不溶性的）维生素，以及其它本领域的专业技 术人员所熟知的培养基成分。如果需要也可以加入消泡剂。培养基可以含有复杂成分，或 者是化学上确定的。
[0046] 每种成分的量可以变化，只要对微生物的生长或生产率没有负面影响就行。本领 域的专业技术人员可以根据微生物的需要容易地确定每种情况下所需的成分。一般来说， 碳源的添加浓度不超过300g/L，氮源的添加浓度为1到30g/L。在优选情况下，氮的含量依 赖于培养基中碳的含量来进行调整。
[0047] 特别优选的pH值稳定的培养基含有葡萄糖、酵母提取物、玉米浆（CSL)、氯化镁、 碳酸钙、氯化钙、硫酸钠和磷酸钾。
[0048] 培养基的pH值在开始发酵之前通过加入相应的酸或碱被设定在3到10的范围 内，优选为4到8,特别优选为5到7,非常特别优选为大约6。
[0049] 然后将培养基灭菌。对培养基进行灭菌的技术对本领域的专业技术人员来说是熟 知的，可以举出的例子有高压灭菌和除菌过滤。
[0050] 正如本领域的专业技术人员通常所了解的那样，培养可以以分批培养、补料分批 培养或连续培养的方式进行。
[0051] 分批培养或补料分批培养通常进行的时间为1到12天，优选为2到10天，特别优 选为3到9天。
[0052] 培养基成分可以单独地或作为混合物加入到培养基中，事先制备的混合物也能够 使用。培养基成分，特别是碳源和氮源或特异性培养基添加物可以在培养前或培养过程中 加入。成分的加入可以重复一次或几次，也可以连续地进行。
[0053] 生产出的PUFA -般为中性脂肪的形式例如三酰甘油，或极性脂的形式例如磷脂 酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇。
[0054] 对于本发明来说，术语PUFA、n-3脂肪酸或n-3活性物质被理解为其中可以存在 相应脂肪酸的所有可能的形式，即游离脂肪酸、酯、甘油三酯、磷脂或其它衍生物。所有这些 物质都在下文中进行了概述，使用的术语具有同样的意义。此外，在从培养物中分离之前或 之后，PUFAs可以通过化学的或生物催化的转酯反应方式进行转化和浓缩，例如在适当的酶 (脂酶）的帮助下。
[0055] 从发酵的微生物或培养基中分离PUFAs以及分析脂肪酸形式可 以使用本领域的专业技术人员所熟知的常用方法来进行（Wanasundara，U. N.，Wanasundara, J.，Shahidi, F.，ω-3脂肪酸浓缩物：生产技术综述，海洋食品-质量、 技术和营养药物应用，2002,157-174页）。
[0056] 构成了本发明方法的基础的pH稳定的发酵培养基在下文中以一些实施例的方式 进行描述。然而，发酵培养基以及本发明并不限于这些实施例。
[0057] 实施例1 :在完全用不同量CaC03稳定pH的不同培养基中发酵吾肯氏壶菌SAM 2179(Ulkenia sp.SAM 2179)菌株生产 PUFA
[0058] Ulkenia sp. SAM 2179菌株被培养在含有50ml培养基的300ml带有挡板的锥形烧 瓶中。
[0059] 培养基组成：
[0060] 发酵培养基：
[0061] 葡萄糖 150 g/L 玉米浆 3.75 g/L KH2P〇4 3 g/L Na2S04 1 g/L MgC：l2x6H20 1 g/L CaCl2x2H20 0.3 g/L (NH4)2S04 5 g/L
[0062] 每个50 mL摇瓶中添加的CaC03: 培养基1.1 0 g/L 培养基1.2 1 g/L 培养基1.3 2 g/L 培养基1.4 5 g/L 培养基1.5 10 g/L
[0063] 用NaOH将pH值调整到6. 0并高压灭菌。
[0064] 培养条件：
[0065] 温度（°C): 28
[0066] 转速（rpm) : 150
[0067] 在培养96小时后通过离心收获细胞。然后将细胞冷冻干燥并确定干生物质。通过 在10%甲醇盐酸中于60°C热处理2小时（同时搅拌）来进行细胞裂解和脂肪酸测定。酯 通过气相色谱进行分析以测定脂肪酸的组成。
[0068] 表1 :不同碳酸钙浓度时的发酵参数
[0069]
【权利要求】
1. 一种培养破囊壶菌目（Thraustochytriales)微生物的方法，其特征为将微生物培 养在包含CaC0 3作为主要pH值稳定方式的发酵培养基中，所述CaC03在发酵培养基中的含 量在3g/L到15g/L的范围内。
2. 权利要求1的方法，其中的微生物每单位重量干生物质产生多于25wt%的油。
3. 权利要求1的方法，其中的微生物每单位重量干生物质产生多于10%的DHA。
4. 前述权利要求任何一个的方法，其中的微生物每单位干生物质产生多于1%的DPA。
5. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为培养基含有葡萄糖、玉米浆、氯化镁、氯化 钙、碳酸钙、硫酸钠、硫酸铵和磷酸氢钾。
6. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为培养基的pH值在3到10之间。
7. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为培养发生在10°C到40°C之间。
8. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为培养进行1到10天。
9. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为微生物属于裂壶菌（Schizochytrium)、 破囊壶菌（Thraustochytrium)或吾肯氏壶菌（Ulkenia)属。
10. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为微生物是吾肯氏壶菌SAM 2179 (Ulkenia sp. SAM 2179)。
11. 权利要求1到3任何一个的方法，其特征为微生物是裂壶菌SR 21 (Schizochytrium sp. SR 21)〇
12. 包含CaC03作为主要pH值稳定方式的发酵培养基用于培养破囊壶菌目 (Thraustochytriales)的微生物，所述CaC03在发酵培养基中的含量在3g/L到15g/L的范 围内。
【文档编号】C12R1/645GK104195186SQ201410369836
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2004年11月10日 优先权日:2003年11月10日
【发明者】马尔库什·卢伊, 马西亚斯·鲁辛 申请人:努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司