专利名称：克伦特罗elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
克伦特罗ELISA检测试剂盒
(一) 技术领域 本实用新型涉及检测克伦特罗残留量的试剂盒，特别是检测动物组织、尿液、饲料
等样本中克伦特罗残留量的酶联免疫试剂盒。
(二) 背景技术 克伦特罗(Clenbuterol)属于P _兴奋剂。近年来被非法添加到饲料中以提高脂 肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，因其添加剂量是治疗剂量的5-10倍，以至于在动物体 内残留量高而给消费者带来危害。 目前国内外有关食品中克伦特罗检测方法大都采用高效液相色谱法、液相色 谱_质谱法和气相色谱_质谱法的等进行检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂 贵，检测过程繁琐，不适合现场监控和大量样本筛查。 0实蕭謝泉- 本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的克伦特罗残留量检测试剂盒， 其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一 次连续多个样品中克伦特罗含量的测定，减少了检测样本所需要的时间。 本实用新型的技术方案是一种检测动物源性食品中克伦特罗残留量的酶联免疫 试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的15个下 凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯试剂板 作为固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个 可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被克伦特罗偶联抗原 制成检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为 盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将13瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料 瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封 装在硬纸盒内，以便于携带和运输。13瓶试剂分别为6瓶lml梯度浓度的标准品溶液，浓 度分别为0ii g/L、0. 1 ii g/L、0. 3ii g/L，2. 7ii g/L、8. 1 y g/L、lml高浓度标准品溶液、7ml酶 标二抗、10ml克伦特罗抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓 縮洗涤液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次 连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封， 这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的克伦特罗将和酶标板微孔条上 预包被的克伦特罗偶联抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本 吸光度值与样本中所含克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍 数，即可得出样品中克伦特罗的含量，其操作简便易行。 经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度尿液样本的最低检测限为0. 1 ii g/L ;饲 料样本的最低检测限为10iig/kg;低脂肪肌肉、肝脏组织样本处理方法(a)的最低检测限
为0. 1 i！ g/kg ;低脂肪肌肉、肝脏组织样本处理方法(b)的最低检测限为0. 4i! g/kg ;高脂
肪肌肉组织的最低检测限为0. 1 il g/kg。尿液样本的回收率为90% ±15% ;饲料样本的回收率为95% ±15% ;组织样本的回收率为70% ±10% ;相对于其他克伦特罗检测方法，本
试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮气吹干装置、均质器、涡旋仪、离心机、振荡机和微 量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。 本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于克伦特罗残留量的检
(四)
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm); 图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm); 图3为本实用新型酶联板的俯视图； 图4为本实用新型盖板膜平面图； 图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图； 图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图； 图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2) 预包被克伦特罗偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可 随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透 明帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓縮洗涤液；白色帽(6)的白色PE塑料试 剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显 色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑 料试剂瓶(8)用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装10ml克 伦特罗抗体工作液，白色帽的棕色PE玻璃试剂瓶(9)用于封装lml/瓶的标准品溶液及lml 高浓度标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓縮洗涤 液瓶位(18) ， 7ml显色液A液瓶位(14) ， 7ml显色液B液瓶位(13) ， 7ml终止液瓶位(12)， 10ml克伦特罗抗体工作液瓶位(16) ， 12ml酶标二抗瓶位(15) ，6种lml/瓶各种浓度的标准 品溶液及1瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
—、样本的前处理 配液1 :50mM盐酸溶液(低脂肪的肉、肝样本专用) 量取4. 17ml浓盐酸加去离子水混匀定容至1L。 配液2 :pH3. 050mM磷酸二氢钾缓冲液(过柱方法专用) 称取3. 40g磷酸二氢钾加去离子水溶解定容至500ml (用磷酸或氢氧化钠调节pH 值至3. 0)。 配液3 :pH3.0500mM磷酸二氢钾缓冲液(低脂肪的肉、肝样本专用) 称取34. 02g磷酸二氢钾加去离子水溶解定容至500ml (用磷酸或氢氧化钠调节pH
值至3. 0)。 配液4 :pH8. 550mM Tris-Base缓冲液(高脂肪的肉、肝样本专用) 称取3. 03g Tris-Base加去离子水溶解定容至500ml (用盐酸调pH至8. 5)。 配液5 : 1M盐酸溶液(饲料样本专用)[0026] 量取8. 3ml浓盐酸加去离子水混匀定容至lOOml。 配液6 :1M氢氧化钠溶液(低脂肪的肉、肝和饲料样本专用) 称取4. 0g氢氧化钠加去离子水混匀溶解定容至100ml 。 配液7 :0. 1M盐酸溶液(组织不过柱方法专用) 量取0. 83ml浓盐酸加去离子水混匀定容至100ml。 配液8:4%氯化钠溶液 称取4. 0g氯化钠加去离子水溶解定容至100ml 。 配液9 :4% NaCl-O. 1M HC1-甲醇混合液 量取70ml 4X氯化钠溶液、20ml 0. 1M盐酸溶液和10ml甲醇混合均匀。 配液10 :洗涤工作液 用去离子水将20X浓縮洗涤液按1 : 19体积比进行稀释(1份20X浓縮洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4t:环境可保存一个月。 2.样本处理步骤 尿液样本处理 取20 iil清亮尿样直接测定(如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，15。C离心 10min直至清亮)，暂不使用的样本应冷冻保存。 低脂肪的肌肉、肝脏样本处理 方法(a) 称取5. 0±0. 05g粉碎的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入25ml 50mM盐酸溶液混合，用振荡器振荡1. 5h，以达到均质的目的；称取6. 0±0. 05g均 质物至50ml聚苯乙烯离心管中；3000g以上，10-15t:离心15min ;移取全部上清液至另一 个洁净的50ml聚苯乙烯离心管中，加300 iU 1M氢氧化钠溶液，使用振荡器振荡15min ;加 入4ml pH3. 0500mM磷酸二氢钾缓冲液，混合后，4。C保存，至少1. 5h或过夜；3000g以上， 10-15t:离心15min，分离全部上清液，使其升至室温(20_25°C );然后用RIDA C18柱纯化 (见RIDA C18柱纯化步骤)。 RIDA C18柱纯化步骤用3ml甲醇洗涤柱子，流速为1滴/秒；用2ml pH3. 050mM磷酸二氢钾缓冲液洗涤
柱子；样本进柱(组织样本的全部上清液，15滴/分钟)；用2ml pH3. 0 50mM磷酸二氢钾缓冲液洗涤柱子；用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹
2min，干燥柱子；用lml甲醇洗脱样本，流速为15滴/分钟；于50 6(TC的弱空气或氮气
流下完全蒸发溶剂；用lml去离子水溶解干燥的残留物；取20iU用于分析。 方法(b) 称取2. 0±0. 05g匀桨样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入6ml 4% NaCl-O. 1M HC1-甲醇混合液，用振荡器振荡摇至均匀；静置10min，3000g以上离心5min ;肝脏样本取 lml上清液加入20 iil 1M氢氧化钠溶液混匀(测定pH值，大约为8);肌肉样本取lml上 清液加入30 iU 1M氢氧化钠溶液混匀(测定pH值，大约为8);取20 iU用于分析。 高脂肪的肌肉样本处理 称取5. 0±0. 05g粉碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中加入25ml pH8. 550mM Tris-Base缓冲液混合，用振荡器振荡0. 5h，以达到均质的目的；加入15ml正己烷，用振荡器振荡5min以除去脂肪；3000g以上，10-15。C离心15min ;用移液器除去上层的正己烷相 及中间薄薄的脂肪层；再加入15ml正己烷，用振荡器振荡5min除去脂肪；向均质液中加入 0. 5ml浓盐酸振荡lh ;称取6. 0g±0. 05g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中；3000g以上， 10-15t:离心15min ;移取全部上清液至另一个洁净的50ml聚苯乙烯离心管中，加300 yl 1M氢氧化钠溶液，使用振荡器振荡15min ;加入4ml pH3. 0500mM磷酸二氢钾缓冲液，混合 后，4t:保存，至少1. 5h或过夜；3000g以上，10-15t:离心15min，分离全部上清液，使其升至 室温(20-25°C );再用RIDAC18柱以下列方式纯化(要严格控制过柱时的流速)。 饲料样本的处理 用研钵研碎饲料样本，称取2. 0±0. 05g研碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加 入2ml 1M盐酸溶液，加入16ml去离子水用均质器进行均质；用涡旋仪涡动3min，放振荡器 上振荡15min ;3000g以上，离心20min，转移出全部上清液至10ml聚苯乙烯离心管中，并加 入2ml 1M氢氧化钠溶液混合均匀，检查pH值是否在6. 5-7. 5之间；(用盐酸或氢氧化钠溶 液调节pH值)；3000g以上，离心20min，取100 yl上清液至2ml干净的聚苯乙烯离心管中， 加入900 ii 1去离子水混合均匀；取20 iU用于分析。 二、使用试剂盒的操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种液 体试剂使用前均须摇匀。 2、取出板架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗涤液在使用前也需要回温。 5、编号将样本溶液和标准品工作液对应微孔按序编号，每个样品溶液和标准品 工作液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 6、加标准品工作液/样本溶液、酶标二抗、抗体工作液加标准品工作液/样本溶 液20 iil到对应的微孔中，随即加入酶标二抗50 ii 1/孔，再加抗体工作液80 ii 1/孔，轻轻 振荡混匀，用盖板膜盖板，25t:环境中反应30min。 7、取出微孔板，甩出孔内液体，用洗涤液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头剌破)。 9、显色每孔先加入底物液A液50iil，再加B液50ia，轻轻振荡混匀，25t:环境 中避光显色20min。 10、测定每孔加入终止液50 ii 1，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔0D (若无酶标仪，则不加终止液用 目测法可进行判定)。 三、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与克伦特罗含量成负相关。 1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(P g/L)。 假设样本1的吸光度值为0. 301，样本2的吸光度值为0. 712，标准液吸光度值分别是 0 y g/L为1. 952 ;0. 1 y g/L为1. 420 ;0. 3 ii g/L为0. 980 ;0. 9 ii g/L为0. 464 ;2. 7 ii g/L为 0. 256 ;8. 1 y g/L为0. 152。则样本1的浓度范围是0. 9 y g/L_2. 7 y g/L乘以其对应的稀释 倍数；样本2的浓度范围是0. 3 ii g/L-0. 9 y g/L乘以其对应的稀释倍数。[0065] 2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) = - x 100%
B0 B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L标准溶液的平均吸光度值 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度(P g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应 的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际含量。 四、测定前的注意事项 1、室温低于2(TC或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的0D值 偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性， 重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。 4、反应终止液为2mol/L硫酸，避免接触皮肤。 5、储存条件 保存试剂盒于2-『C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 6、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、0D值的变化。
不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 7、试剂变质的迹象 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。 8、加A、 B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过 30min。 9、该试剂盒最佳反应温度为25t:，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求一种克伦特罗ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被克伦特罗偶联抗原制成的检测板，13瓶试剂分别6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液，下凹瓶位共15个。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料 瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液 用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓縮洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫 制成。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔 预包被克伦特罗偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，lml/ 瓶，浓度分别为0 ii g/L， 0. 1 ii g/L， 0. 3 ii g/L， 0. 9 ii g/L， 2. 7 y g/L， 8. 1 y g/L ;高浓度标准 品溶液1瓶，lml ;酶标二抗1瓶，7ml ;抗体工作液1瓶，10ml ;显色液A液1瓶，7ml ;显色液 B液1瓶，7ml ;终止液1瓶，7ml ;浓縮洗涤液1瓶，40ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源食品中克伦特罗含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、克伦特罗抗体工作液、克伦特罗6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的克伦特罗将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中克伦特罗的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中克伦特罗的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N1/34GK201488999SQ20092010854
公开日2010年5月26日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者万宇平, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 刘平, 刘福林, 张建军, 朱亮亮, 李勇, 汪善良, 罗贵昆, 赵正苗, 陈炜琳 申请人:北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司