检测屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，特别是设及一种检测过敏原特异 性I姐抗体屋尘蛾的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] I姐抗体介导的I型过敏反应性疾病相当普遍，世界各国变态反应疾病的总发病 率约为15%-30%，我国大约有5-10%的人受过敏原的袭扰，是当前世界性的重大卫生学问 题，被世界卫生组织（WHO)列为二十一世纪重点防治的Ξ大疾病之一。
[0003] 过敏性疾病是患者吸入、摄食入或者注入含有致敏成分的物质，即称为过敏原或 变应原Allergen,后触发机体的B细胞产生特异性免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE， I姐)，从而引发过敏反应(或称变态反应，Allergy)的疾病及相关症状，如过敏性哮喘、枯草 热、等麻疹、过敏性鼻炎、湿疹、结膜炎及胃肠道I型过敏性疾病及严重过敏反应等。上述过 敏性疾病的发生，I姐抗体起关键作用。
[0004] 尘蛾中重要的致敏蛋白组分为Derpi和Derf2。尘蛾既有共同的过敏原组分， 也有种属特异性的过敏原组分。蛾的一些致敏蛋白组分与无脊椎动物具有广泛的交叉反应 性。 阳〇化]在国内，屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体（D1)检测临床上主要W国外进口试剂和免 疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在 基层普及。具有自主知识产权的国产屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体（D1)免疫化学发光检 测试剂盒目前还没有。
[0006] 因此，有待开发对屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体（D1)检测灵敏度高与可靠性并能 降低检测成本的检测技术。
【发明内容】
[0007] 本发明主要解决的技术问题是提供一种屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体的试剂盒 及方法，该试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用，能提高检测灵 敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
[0008] 提供一种检测屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体的试剂盒，包括校准品、质控品、生物 素标记的屋尘蛾过敏原溶液、碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗溶液、链霉亲和素标记的 纳米磁微粒悬浮液。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，所述生物素标记的屋尘蛾过敏原溶液的浓度为 0. 1~1. 0ug/ml;所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0. 1~1. 0mg/ml;所述 碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗溶液的浓度为0. 1~2. 0ug/ml。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，所述校准品的浓度为：〇iu/ml、0. 35IU/ml、0. 7 IU/ml、3. 5IU/ml、17. 5IU/ml、50IU/ml、100lU/ml，所述校准品是I姐蛋白与 0.IM、抑值 为7.4的Tris-肥1缓冲液配制得到的；所述质控品的浓度为：0. 7IU/ml、17. 5lU/ml，所述 质控品是I姐蛋白与0.IM、抑值为7. 4的Tris-HCl缓冲液配制得到的。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，所述屋尘蛾过敏原为能与人体内屋尘蛾特异性I姐 蛋白结合的抗原，所述生物素标记的屋尘蛾过敏原的配制方法为：将屋尘蛾过敏原按1:20 摩尔比加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，再用0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液透析 得到。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，所述标记的鼠抗人I姐二抗为能与人体内I姐蛋 白特异结合的抗体，所述碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗的配制方法为：将浓度为 1. 0-5.Omg/血的碱性憐酸酶溶液与鼠抗人I姐二抗按摩尔比为2-10 :1进行混合后并纯 化，得到碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗，所述纯化是用抑为8-9的碳酸氨盐缓冲液平 衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用0. 05M、抑值为6. 0的MES缓冲液对碱性憐酸 酶标记的鼠抗人I姐抗体稀释。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过 程为：将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀，再用0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐 缓冲液重悬，混匀磁分离沉出，并重复清洗，清洗后的纳米磁微粒分散于0. 01M、抑值为7. 4 的憐酸盐缓冲液。
[0014] 提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体的 方法，包括步骤为： (1) 将磁微粒试剂、生物素标记的屋尘蛾过敏原和待检样本混匀并反应，反应后置于磁 场中静置并去上清，得到第一溶液； (2) 向所述第一溶液中加入碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗混匀并反应，反应后置 于磁场中静置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入发光底物并反应，测发光强度； (4) 利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（3)得到的发光强度对照 所述标准曲线，计算得出待测血清样本中特异性I姐的含量。
[0015] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1)中所述反应的条件为37°C下反应15分钟， 所述静置的时间为3分钟；步骤（1)中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场 中静置并去上清，清洗重复2次；步骤（2)中所述反应的条件为37°C下反应15分钟，所述静 置的时间为3分钟；步骤（2)中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置 并去上清，清洗重复2次；步骤（3)中所述反应的条件为37°C下反应5分钟，在化学发光分 析/测定仪中测定发光强度。
[0016] 在本发明一个较佳实施例中，所述定量检测方法在全自动化学发光仪Lumiray系 列上进行，所述Lumiray系列为Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260 或Lumiray 1280ο
[0017] 在本发明一个较佳实施例中，所述定量检测方法包括的步骤为： (1) 将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别； (2) 将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓，识别校准品信息，分配校准品 位置； (3) 将质控物或待测样本置于仪器样本仓，编辑检测信息； (4) 启动运行程序，所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明的检测屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体的试剂盒及方 法，试剂盒中各试剂组分稳定性良好，有效期可至一年W上，检测灵敏度高、特异性能好、变 异小。经过大量实验的工艺优化，得到完善统一工艺，并严格按照标准生产操作规程和质量 控制规程进行生产。用户仅需按照操作说明进行规范操作，就可得到可靠的结果。在临床 研究中与国外进口试剂的符合相关性高达90%W上，且费用仅为其1/2。
【附图说明】
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明的实施例一中检测屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体的试剂盒的标准曲线 图； 图2是本发明的屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体（D1)检测试剂盒与进口试剂的性能对 比图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0021] 实施例一： 提供一种基于纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体 (D1)的试剂盒，包括如下试剂： (1) 生物素标记的屋尘蛾过敏原溶液，浓度为0. 1-1. 0ug/mL; (2) 链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，浓度为0. 1-1. 0mg/mL; (3)碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗溶液，浓度为0. 1-2. 0 Ug/mL ; (4) 6个不同浓度水平的校准品：0 111/1111，0.35 11]/1111，0.7 11]/1111，3.5 11]/1111，17.5 IU/ml,50lU/miaOOlU/ml； (5) 2个不同浓度水平的质控品：0. 7lU/ml，17. 5lU/ml。 W22] 实施例二： 本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清屋尘蛾过敏原特异性I姐抗体试剂盒的制备包括如下步骤： (1)配制缓冲液： 配制0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液，0. 1M、抑值为7. 4的Tris-肥1缓冲液，0. 05M、 抑值为6. 0的MES缓冲液。
[0023] 0.01M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子 水，称取2. 56g胞2册〇4，12&0、0. 44g胞&口〇4,2&0和9g化C1，加入到烧杯中，揽拌使其充 分溶解，用肥1或化0H调节抑值至7. 4 + 0. 05,加入质量分数为2%的甘露醇、质量分数为 1〇/〇的甘油，揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至IL。
[0024] 0. 1M、抑值为7. 4的Tris-肥1缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去 离子水，称取12.llgTris(Ξ径甲基氨基甲烧）加入到烧杯中，揽拌使其充分溶解，用肥1 或化0H调节抑值至7. 4 + 0. 05,加入质量分数为2%的BSA、质量分数为0. 3%的Proclin 300,揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至1L。 阳02引 0. 05M、抑值为6.0的MES缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子水， 称取9.76gMES(2-(N-吗嘟代）乙横酸)、9g化C1加入到烧杯中，揽拌使其充分溶液，用肥1或化0H调节抑值至6.0+0. 05,加入质量分数为1%的BSA、质量分数为0. 1%的Tween-20， 揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[00%] (2)制备生物素标记的屋尘蛾过敏原溶液 将屋尘蛾过敏原W1:20的比例加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，室溫条件下充 分混合反应30分钟，反应后的溶液用0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液透析。BCA法测 定生物素标记的屋尘蛾过敏原溶液的浓度，并调整其浓度到0. 1-1.0ug/ml。
[0027] (3)制备链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液 将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀出来，用0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐 缓冲液重悬，充分混匀15分钟后磁分离沉出，弃去上清，再用0. 01M、pH值为7. 4的憐酸盐 缓冲液重悬，如此重复清洗5次，清洗后的纳米磁微粒分散于0. 01M、抑值为7. 4的憐酸盐 缓冲液，浓度为0. 1-1. 0mg/ml。
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