专利名称：一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备及应用的制作方法
技术领域：
一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备及应用，属于生物技术领域。
背景技术：
食品过敏原的安全问题已引起广泛的关注，其潜在的过敏原性是急需研究 的新课题。过敏症是在全世界广泛流行的一类常见变态反应性疾病，由于其症 状复杂，种类繁多，危害广泛且难以根治，成为长期以来医学界的一大难题。
在过去的20年里，过敏症发病率显著上升，随着转基因作物的推广和转基因食 品的普及，食品过敏原已成为食品安全隐患之一。但由于科技进步、管理水平 和社会发展的不平衡，对食品过敏原的安全问题的理解在不同国家、不同地区 各不相同，公众对它的认同意识也有较大差异。我国对食品过敏的研究和关注 与国外发达国家相比也有较大差距，但随着经济的发展和人民生活水平的提高， 人们对过敏症的关注和重视大为提高。
花生油料作物是一常见过敏食品。世泰教授在我国常用食品致喘40例分析 中指出，花生等油料作物居过敏原的前列。花生过敏通常会产生严重的变态反 应，有时会引起致命性的休克并危及生命。研究表明，食物过敏人群中有30%的 人对花生过敏，花生所引起的过敏严重影响了部分人群的生活质量。在英国总 人口中，0.5% 1.0%的人口患有致命危险的食物过敏症，而0.5%的人口是对坚 果和花生产生过敏的。美国的研究表明，1.1%的美国人对花生过敏，其中包括 占总人口数0.4%的儿童和0.7%的成年人。在法国的一项包括54名新生儿(小于 lld)和71名婴儿(11d到4个月)调查中发现，8%的儿童对花生的皮试实验呈现 阳性。中国协和医科大学变态反应科通过对就诊人群的调査表明，北京约4%的 食物过敏患者对花生过敏。与此同时，相对于其他过敏原，如牛奶、鸡蛋而言， 花生过敏通常是终生的，只有10%的过敏儿童会随年龄的增长产生耐受性。
海产品是另一种常见的致敏性食物，它在各个年龄段的人群中都可发生， 没有年龄的特异性。海产品中虾类等甲壳类动物在海产品中引起过敏疾病比较 普遍。它的过敏原主要是存在于肌纤维中的一种原肌球蛋白(Penal)，分子量 34 36kD，等电点为4.5，现己确定几种软体动物的过敏原均为原肌球蛋白，它们 之间具有交叉反应特性，甲壳类动物的主要过敏原也是原肌球蛋白，但其中还有 其它的含有原肌球蛋白中具致敏特性的蛋白小肽段。我国学者赖荷等报道中国 罗氏虾除Penal夕卜，还含有分子量为78.2kD、 66.2kD、 46.5kD的几种过敏原，他们食物过敏在相当大的程度上危害着过敏人群的健康，保护消费者食品安全 已经成为食品安全管理部门及食品生产企业所面临的重要问题。它是食品安全 领域的 -个重要方面，其检测日益显出重要的意义。现在，虽有许多过敏原检 测方法可供借鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。
体内实验方法(双盲安慰剂对照的食物攻击试验以及皮肤试验)可提供最为 直接的证据，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进 行，而且费用昂贵、风险大；与此相比，体外实验方法，主要包括组胺释放实 验，放射过敏原吸附实验，酶标记过敏原吸附实验，荧光和化学发光标记的检 测技术，酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫印记试验及CAP变应原检测系统等有 着方便，安全等优点，但却存在着准确性差的缺点。
我们研制的此传感器是一种压电免疫传感器，其原理是石英晶片在振荡电 路中振荡时有一个基础频率，当样品中的抗原或抗体与包被在晶片上的抗体或 抗原结合时，由于负载增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附质 量有相关性。这种相关性可用sauerbrey方程表示，即AF二-KF、AM/A,式中 △F为晶体吸附外来物质后振动频率的变化(Hz)， K为常数，等于2.26xl(T6， AM 为晶片的质量变化值(g)， A为有效压电面积(cm2)， F为晶片的基础频率(Hz)， 它表明晶体表面的质量变化(AM)与其引起的晶体谐振频率变化(AF)之间存在 简单的线性函数关系。如果设法将晶体选择性地吸附待测物，便能制备压电传 感器，先将抗原或抗体涂布在晶体表面，测得一个基础的频率F,，然后将其放 到待测气体或液体中，使其与被测物发生抗原一抗体反应形成复合物，对吸附 被测物后的晶体再进行频率检测得到频率F2，根据频率变化AF^F2-F,，就可得
到待测物的量。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备及应 用，本发明以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，建立了食品过敏原 的压电型免疫传感快速检测方法，成功建立了快速、特异、灵敏的检测花生或 河虾过敏原的检测传感器。
本发明的技术方案 一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备方法 以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，建立了食品过敏原的压电
型免疫快速检测传感器，该检测传感器由CHI400C型电化学工作站，三电极体 系铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，金电极需经修饰作为修 饰电极、再经包被抗体作为工作电极，金电极修饰和包被抗体的过程为； (1)电极的清洗
金电极是传感器的主要元件；0=4mm金电极用Piranha溶液清洗10min， 保证金电极表面的清洁和高疏水性，然后依次用水和乙醇各清洗3次，利用三电极系统在电化学工作站仪器CHI400C上进行扫描验证；将清洗过的电极在
0.5mol/L的H2SO4溶液中于-0.8V 0.9V范围内进行循环伏安扫描至稳定，扫描 后的电极再用超纯水清洗十净，晾干后在4"C条件下保存待用； (2)电极的修饰
向检测反应池中分别注入浓度为20mM戊二醛的50%乙醇溶液、浓度为 20mM的L-半胱氨酸L-Cys的50%乙醇溶液和浓度为20mM的1， 6-己二硫醇 (HDT)的50%乙醇溶液，室温下静置L5h，然后用超纯水清洗0.5h，晾干后 将电极放入2.5mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)4+0.1mol/L KNO3+0.01mol/L PBS溶 液中于-lV lV范围内循环伏安扫描至稳定，扫描后的电极再用超纯水清洗干 净后继续浸泡在纳米金溶胶中自然沉积，于室温下过夜；
所述纳米金溶胶的配置用新制双蒸水配制lOOmL质量浓度为0.01%氯金 酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下， 迅速加入预先在37。C保温的质量浓度1%柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转 速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4'C冰 箱保存备用；
G)电极的包被抗体
花生或河虾经正己垸4。C浸提过夜，冷冻离心，收集上清液；用30%-50% 饱和度硫酸铵沉淀的蛋白质组分溶解在PBS中，分别加硫酸至pH 5.2或pH4.5 等电点，离心后沉淀物溶解在PBS中，分别得花生过敏原或河奸过敏原；
花生或河虾过敏原免疫得到检测抗体；修饰后的电极超纯水冲洗后浸泡 30min，花生抗体用PBS缓冲液以1:4000稀释或河虾抗体用PBS缓冲液以1:6000 稀释，作为包被液，包被温度4°C，包被时间3h，包被后的电极用超纯水冲洗 后浸泡30min，再在ly。BSA37"C下浸泡3h，超纯水清洗。
所述方法制备的花生或河虾过敏原快速检测传感器的应用方法
(1)待测液制备
(a)花生或含花生样品待测液制备
称取花生或含花生样品30g，按重量体积比g/mL为1 : IO浸入正己烷中脱 脂，4'C浸提过夜，冷冻离心，收集上清蛋白浸液；10mL蛋白浸液缓慢加至质 量终浓度30%饱和硫酸铵，4t:下静置过夜，离心使沉淀，对上层清液再缓慢加 至质量终浓度50°/。饱和硫酸铵，静置30min，离心，将30%-50%饱和度沉淀的 蛋白质组分溶解在PBS中，加硫酸至pH5,2等电点，离心后沉淀物溶解在PBS 中，装入透析袋对蒸馏水透析4h，期间换透析液一次，然后转至PBS中继续透 析，即得花生过敏原待测液；取待测液lmL加入传感器反应池中进行检测；
或(b)河虾或含河虾样品
称取去头去壳的新鲜河虾或河虾样品30g，组织捣碎后浸提，等电点沉淀的pH值为4.5;其他步骤同(a)花生的处理，得河虾过敏原待测液；取待测液lmL 加入传感器反应池中进行检测；
(2)检测利用二电极系统在电化学工作站仪器CHI400C上进行检测，在 检测反应池中加入过敏原待测液，检测时间为500s。
相关性用sauerbrey方程表示，即AF二-KF、AM/A，式中AF为晶体吸附 外来物质后振动频率的变化(Hz)， K为常数，等于2.26x10—6， AM为晶片的质 量变化值(g)， A为有效压电面积(cm2)， F为晶片的基础频率(Hz)。
本发明的有益效果本发明以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础， 建立了食品过敏原的压电型免疫传感快速检测方法，成功建立了快速、特异、 灵敏的检测花生或河虾过敏原的检测传感器。
图l花生过敏原浓度-频率变化的曲线图。
图2河虾过敏原浓度-频率变化的曲线图。
具体实施例方式
实施例1:花生过敏原的检测
1、 前处理
称取花生30g，热烫去红衣，组织捣碎机捣碎得花生粉末。将花生粉末按l
:10 (W/V)浸入正己垸中脱脂。用预冷的PBS、 B-巯基乙醇和EDTA.2Na混合 溶液将花生脱脂粉高速捣碎10min， 4"C下静置过夜，浸提液冷冻离心后去沉淀， 收集上清液。取10mL花生蛋白浸液缓慢加入30%饱和硫酸铵，4t:下静置过夜， 离心所得沉淀即为30%饱和度硫酸铵沉淀组分。对上清液缓慢加至50%硫酸铵， 静置30min，离心得到50%饱和度硫酸铵沉淀。将30%-50%饱和度沉淀的蛋白 质组分溶解在PBS中，力[]"/c(v/v)的硫酸溶液至pH 5.2(花生过敏原Arah2等电 点)，离心后沉淀物溶解在PBS中。将其装入透析袋对蒸馏水透析4h，期间换透 析液一次，然后转PBS中继续透析过夜。
2、 花生过敏原快速检测传感器的使用方法
常温下，向反应池中加入lmL 15mMHDT，包被90min，倒掉HDT溶液后 用超纯水冲洗，加超纯水浸泡30min，再加纳米金吸附110min，倒去纳米金后 用超纯水冲洗后浸泡30min，取花生抗体5|iL稀释4000倍，4'C条件下包被3h， 超纯水冲洗后浸泡30min， 1%BSA在37。C下浸泡3h，纯水冲洗后倒置放入冰箱， 半小时后加入所得待测液，检测时间为500s。
3、 检测结果
花生蛋白的最低检测限为0.2pg/mL。 实施例2:河虾过敏原的检测 1、前处理
称取去头去壳的新鲜河虾或河虾样品30g，组织捣碎后浸提，等电点沉淀的 pH值为4.5;其他步骤同上述花生的处理①，得河虾过敏原待测液
2、 河虾过敏原快速检测传感器的使用方法
常温下，向反应池中加入lmll5mM HDT，包被90min,倒掉HDT溶液后 用超纯水冲洗，加超纯水浸泡30min，再加纳米金吸附110min，倒去纳米金后 用超纯水冲洗后浸泡30min，河虾抗体5iiL稀释6000倍，4。C条件下包被3h， 超纯水冲洗后浸泡30min， 1%BSA在37'C下浸泡3h，纯水冲洗后倒置放入冰箱， 半小时后加入所得待测液，检测时间为500s。
3、 检测结果河虾蛋白的最低检测限为0.03pg/mL。
权利要求
1、一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备方法，其特征在于以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，建立了食品过敏原的压电型免疫快速检测传感器，该检测传感器由CHI400C型电化学工作站，三电极体系铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，金电极需经修饰作为修饰电极、再经包被抗体作为工作电极，金电极修饰和包被抗体的过程为；(1)电极的清洗金电极是传感器的主要元件；金电极用Piranha溶液清洗10min，保证金电极表面的清洁和高疏水性，然后依次用水和乙醇各清洗3次，利用三电极系统在电化学工作站仪器CHI400C上进行扫描验证；将清洗过的电极在0.5mol/L的H2SO4溶液中于-0.8V～0.9V范围内进行循环伏安扫描至稳定，扫描后的电极再用超纯水清洗干净，晾干后在4℃条件下保存待用；(2)电极的修饰向检测反应池中分别注入浓度为20mM戊二醛的50％乙醇溶液、浓度为20mM的L-半胱氨酸L-Cys的50％乙醇溶液和浓度为20mM的1，6-己二硫醇HDT的50％乙醇溶液，室温下静置1.5h，然后用超纯水清洗0.5h，晾干后将电极放入2.5mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)4+0.1mol/L KNO3+0.01mol/L PBS溶液中于-1V～1V范围内循环伏安扫描至稳定，扫描后的电极再用超纯水清洗干净后继续浸泡在纳米金溶胶中自然沉积，于室温下过夜；所述纳米金溶胶的配置用新制双蒸水配制100mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37℃保温的质量浓度1％柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4℃冰箱保存备用；(3)电极的包被抗体花生或河虾经正己烷4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上清液；用30％-50％饱和度硫酸铵沉淀的蛋白质组分溶解在PBS中，分别加硫酸至pH5.2或pH4.5等电点，离心后沉淀物溶解在PBS中，分别得花生过敏原或河虾过敏原；花生或河虾过敏原免疫得到检测抗体；修饰后的电极超纯水冲洗后浸泡30min，花生抗体用PBS缓冲液以1:4000稀释或河虾抗体用PBS缓冲液以1:6000稀释，作为包被液，包被温度4℃，包被时间3h，包被后的电极用超纯水冲洗后浸泡30min，再在1％BSA37℃下浸泡3h，超纯水清洗。
2 如权利要求1所述方法制备的花生或河虾过敏原快速检测传感器的应用方法，其特征是(1) 待测液制备(a) 花生或含花生样品待测液制备-称取花生或含花生样品30g，按重量体积比g/mL为1 : IO浸入正己烷中脱 脂，4"C浸提过夜，冷冻离心，收集上清蛋白浸液；10mL蛋白浸液缓慢加至质 量终浓度30%饱和硫酸铵，4"C下静置过夜，离心使沉淀，对上层清液再缓慢加 至质量终浓度50%饱和硫酸铵，静置30min，离心，将30%-50%饱和度沉淀的 蛋白质组分溶解在PBS中，加硫酸至pH5.2等电点，离心后沉淀物溶解在PBS 中，装入透析袋对蒸馏水透析4h，期间换透析液一次，然后转至PBS中继续透 析，即得花生过敏原待测液；取待测液lmL加入传感器反应池中进行检测；(b) 河虾或含河虾样品 称取去头去壳的新鲜河奸或河奸样品30g，组织捣碎后浸提，等电点沉淀的pH值为4.5;其他步骤同(a)花生的处理，得河虾过敏原待测液；取待测液lmL 加入传感器反应池中进行检测；(2) 检测利用三电极系统在电化学工作站仪器CHI400C上进行检测，在 检测反应池中加入过敏原待测液，检测时间为500s。
全文摘要
一种花生或河虾过敏原快速检测传感器的制备及应用，属于生物技术领域。本发明以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，建立了食品过敏原的压电型免疫快速检测传感器，该检测传感器由CHI400C型电化学工作站，三电极体系铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，金电极需经修饰作为修饰电极、再经包被抗体作为工作电极所组成。当样品中的抗原或抗体与包被在工作电极晶片上的抗体或抗原结合时，由于负载增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附质量有相关性。解决了现有检测方法如ELISA、PCR的操作繁琐，往往需要酶标反应物，检测时间长，很难满足现场快速检测等缺点，成功建立了快速、特异、灵敏的检测花生或河虾过敏原的检测传感器。
文档编号G01N27/327GK101458222SQ200810242878
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者孙秀兰, 炜 宁, 平 张, 朱卫娟, 沈丽燕, 和 钱, 顾晓峰 申请人:江南大学