同比例共培养，该培养基同时包含多种小分子化合物（ΙμΜ)。经 过56h的培养，向每孔加入[3Η]胸苷，终浓度为1μCi/孔，接着培养16h。[3Η]胸苷的插入 通过液体闪烁计数器测量。所有实验一式三份。此外，用抗⑶3抗体不加APCs进行筛选： lxl〇5初始型⑶4T细胞与调节性T细胞在抗⑶3单克隆抗体包被（2μg/ml)的96孔板中 加或不加多种小分子化合物（1μM)，以1 : 0. 2,1 : 0. 1和1 : 0. 05不同比例共培养。经 过56h的培养，向每孔加入[3Η]胸苷，终浓度为1μCi/孔，接着培养16h。[3Η]胸苷的插入 通过液体闪烁计数器测量。
[0065] 我们鉴定出11个化合物可有效逆转Treg细胞的抑制功能（图10和表1)。这些 结果表明小分子化合物能够逆转人Treg细胞的抑制功能。 药物诱导阻断Treg细胞抑制功能的持久性取决于药物的处理时间 [0066] 为了确定药物诱导逆转Treg细胞抑制功能的持久性，我们在药物（低浓度）存在 条件下分别培养Treg细胞（每份lxlO6) 1，3, 5天。Treg细胞不加药物培养作为对照组。Treg细胞在第1，3,8天收集并用PBS清洗3次除去残余药物。一些细胞（0. 5-lxlO6)被用 于功能检测，而剩余T细胞在包含IL-2的培养基中培养，且每隔4天被用于功能检测直至 满3周。如图11所示，用化合物#1，#4和#7药物处理Treg细胞1天然后清洗后培养在不 含药物的培养基中直至被用于检测。经过预处理的Treg细胞丧失抑制功能并维持没有抑 制功能的状态5-6天。用药物处理Treg细胞3天后，其维持没有抑制功能的状态3-4周， 然后再次恢复抑制功能。类似的，Treg细胞接受预处理8天，丧失抑制功能然后恢复抑制 功能（图11)。因此，最有潜力的化合物，是由恢复至少50%的初始型T细胞增殖（例如阻 断50%Treg细胞的抑制活性）所需的最低药物浓度以及维持没有抑制功能的状态来获得 足够的时间诱导效应T细胞产生免疫反应的能力来确定，这对于进一步实验非常有用。由 于药物诱导阻断Treg细胞抑制功能的持久性取决于药物的处理时间，我们可以在自体免 疫反应风险最小时，控制时间窗来诱导最大抗肿瘤免疫。我们也希望鉴定小分子化合物增 强Treg细胞的抑制功能。总之，我们的研究表明Treg细胞抑制功能肯以通过不同化合物 /药物调节，这可能对于治疗许多类型的疾病非常重要。 表1化合物列表
[0067] 本专利引用的所有出版文献，专利和专利申请通过参考并入本申请中适用于所有 目的。在不偏离本发明的范围的情况下，任何具体实施方案的一个或多个特征可和任何其 他具体实施方案中的一个或多个特征合并。上述描述是说明性的，而不是限制性的。本发 明的许多变动对于本领域技术人员是显而易见。因此，本发明的范围不应根据上面的说明 决定，而应根据所附权利要求及等同权利要求的全部范围决定。 参考文献 Audiaetal. . 2007.Clin.Exp.Immunol. 150 :523-530. Berendtetal. . 1980.J.Exp.Med. 151 :69-80. Buonerbaetal. . 2011.ExpertRevAnticancerTher11 :25-28. Cortesinietal. . 2001.Immunol.Rev. 182 :201-206. Curieletal. . 2004.Nat.Med. 10 :942-949. DiLorenzoetal. . 2011.NatRevClinOncol8 :551-561. Ghiringhellietal. . 2007.CancerImmunol.Immunother. 56 :641-648. Haydayetal. . 2003.NatRevImmunol3 :233-242. Hodietal..2010.N.Engl.J.Med. 363:711-723. Jiangetal. . 2004.Adv.Immunol. 83 :253-288. Jurketal· · 2002.NatImmunol3 :499. Kantoffetal. . 2010.TheNewEnglandjournalofmedicine363 :411-422.Kiniwaetal. . 2007.ClinicalCancerRes. 13 :6947-6958. Lesterhuisetal.. 2011.NatRevDrugDiscov10:591-600. Levingsetal. . 2002.Int.Arch.AllergyImmunol. 129 :263-276. Mahnkeetal. . 2007.Int.J.Cancer120 :2723-2733. Morseetal.. 2008.Blood112:610-618. Mukherjietal. . 1989.J.Exp.Med. 169 :1961-1976. Pengetal.. 2005.Science309:1380-1384. Pengetal. . 2007.Immunity27 :334-348. Powelletal. . 2008.J.Immunother. 31 :189-198. Rechetal. . 2009.Ann.N.Y.Acad.Sci. 1174 :99-106. Rosenberg，2011.NatRevClinOncol Rubinsonetal. . 2003.Nat.Genet. 33 :401-406. Sakaguchi?S. 2004.Annu.Rev.Immunol. 22 :531-562. Schwartzentruberetal. . 2011.TheNewEnglandjournalofmedicine364 ： 2119-2127. Shevach?E.M. 2002.NatRevImmunol2:389-400.vonBoehmer?H. 2005.NatImmunol6:338-344. Wangetal. . 2004.Immunity20 :107-118. Wangetal. .，2005.J.Immunol. 174 :2661-2670. Wangetal· ·，2007.Curr.Opin.Immunol. 19 :217-223. Wangetal. . ? 2002.J.Exp.Med. 195 :1397-1406. Wooetal..，2001.CancerRes. 61 :4766-4772.ffrzesinskietal. . ?Curr.Opin.Immunol. 17 :195-201. Zou，W. 2006.NatRevImmunol6:295-307.
【主权项】
1. 一种药物组合物，包含药学有效量的化合物和药学上可接受的赋形剂，所述化合物 选自化合物号为 1，2, 3,4, 5,6, 7,13, 22, 23, 24 或 25。2. 权利要求1的药物组合物，进一步包含抗原。3. 权利要求1的药物组合物，进一步包含佐剂。4. 权利要求1的药物组合物，其中所述抗原为肽抗原，蛋白抗原，多核苷酸抗原，或多 糖抗原。5. 在有需要的哺乳动物中抑制调节性T(Treg)细胞介导的免疫抑制或增强免疫应答 的方法，所述方法包括给予哺乳动物药学有效量的、包含能激活MyD88-IRAK4信号通路的 人Toll样受体（TLR) 8配体的药物组合物。6. 权利要求5的方法，其中所述配体选自ssRNA40，ssRNA33，CpG，Poly_G10,瑞喹莫德， 洛索立宾，鞭毛蛋白，LPS，Pam3CSK4。7. 权利要求5的方法，其中所述配体选自化合物号为1，2, 3,4, 5,6, 7,13, 22, 23, 24或 25〇8. 权利要求5的方法，其中所述哺乳动物为人。9. 根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物患有癌症或具有患癌症的风险，并且进 一步给予所述哺乳动物致免疫量的、含有癌症特异性抗原的癌症疫苗。10. 根据权利要求9的方法，进一步给予哺乳动物佐剂。11. 根据权利要求10的方法，其中所述的癌症佐剂与抗原一起给予或偶联到抗原上。12. 权利要求11的方法，进一步包含给予有效量的化疗药物。13. 权利要求12的方法，进一步包含给予有效量的化疗药物。14. 根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物感染了传染病或处于患传染病风险。15. 筛选对Treg细胞的宿主免疫反应抑制性活性的抑制剂的方法，包括1)提供候选化 合物，2)提供CD4+Treg细胞，3)在候选化合物存在或不存在的条件下，将初始型CD4+T细胞 与CD4+Treg细胞共培养，4)在候选化合物存在或不存在的条件下，检测初始型CD4+T细胞 的生长速率，以及5)比较在候选化合物存在与否的条件下CD4+T细胞的生长速率，其中化 合物存在的条件下CD4+T细胞的生长速率比化合物不存在时更高，说明此化合物可以逆转 CD4+Treg细胞的免疫抑制，并选择作为所述抑制剂。16. 根据权利要求15的方法，其中所述CD4 +Treg细胞表达CD25,GITR和FoxP3 ;分泌 IL-10,并能够抑制宿主免疫应答。17. 根据权利要求15的方法，其中所述CD4 +Treg细胞具有抗原特异性。18. 根据权利要求17的方法，其中所述CD4+T细胞进一步与抗原提呈细胞（APCs)共培 养。19. 根据权利要求18的方法，其中所述APCs是用于呈递抗原。20. 根据权利要求19的方法，其中所述APCs是树突状细胞。21. 根据权利要求15的方法，其中所述生长速率由[3H]-胸苷掺入CD4+T细胞的速率 决定。
【专利摘要】药物组合物包含一个从化合物号为1，2，3，4，5，6，7，13，22，23，24和25中选择出的化合物(如表1所述)，和一个药学上可接受的赋形剂。本发明的药物组合物可进一步包含一个抗原，和/或一个佐剂。也提供了一种抑制调节性T细胞(Treg)介导免疫抑制的方法，或笼统地说通过使用含有一个能够激活MyD88-IRAK4信号通路的人Toll样受体(TLR)8配体的药物组合物，提供了一个增强免疫应答的方法。本发明进一步提供一种筛选Treg细胞抑制宿主免疫应答抑制剂的方法，其中所述Treg细胞表达CD25，GITR和FoxP3，分泌IL-10，能够抑制CD4+T细胞活性。
【IPC分类】A61K39/00
【公开号】CN105263513
【申请号】CN201480015177
【发明人】王荣福
【申请人】王荣福
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2905363A1, EP2968501A2, US20160030443, WO2014152092A2, WO2014152092A3