分泌IL-10的⑶4+T细 胞克隆中比在⑶4+TIL1363辅助性细胞中高（图2C)。这些数据合起来表明TIL108T细胞 克隆表达标志物和细胞因子通常与⑶4+调节性T细胞有关。Treg细胞分泌可溶性因子介 导CD4+T细胞的免疫抑制。
[0052] 符合上述表型特征，所有的TIL108Treg细胞克隆对比TIL1363辅助性效应细胞， 以剂量依赖的方式强烈抑制抗CD3诱导的效应CD4+T细胞增殖，TIL1363辅助性效应细胞增 强而不是抑制初始型⑶4+T细胞增殖（图3A)。为了确定这些TIL108Treg细胞是如何抑 制初始型T细胞增殖，我们进行了侵袭实验。正如图3B所示，孔里的TIL108Treg细胞克 隆仍然能够抑制孔外的初始型CD4+T细胞的增殖，此过程不受孔内对照T细胞的影响。因 此，Treg细胞克隆的抑制功能不需要细胞-细胞接触。
[0053] 我们接下来研究了Treg细胞克隆产生的大量IL-10是否参与免疫抑制。在试验 培养基中添加抗10,抗10R或两者都有（每种10μg)不能恢复初始型CD4+T细胞的增殖活 性（图3C)。添加大量抗体（30μg)或使用抗体包被的培养板（数据未展示）也获得了类 似结果。第三种抗体，抗TGF-β，也不会对初始型CD4+T细胞的增殖活性产生任何影响（数 据未展示）。这些结果表明IL-10和TGF-β不参与由TIL108Treg细胞克隆介导抑制初始 型T细胞增殖的过程中。
[0054] 为了直接测试细胞培养上清液是否能够抑制初始型CD4+T细胞的增殖，我们发现 在功能性试验培养基中仅仅添加10μ1来自TIL108Treg细胞克隆的细胞培养上清液，就 能抑制90%以上的初始型CD4+T细胞增殖，然而添加相同量来自TIL1363辅助性细胞或初 始型CD4+T细胞培养上清液增强而不是抑制初始型CD4+T细胞增殖（图3D)。滴定实验表明 抑制活性随上清液量增加而增加（图3E)。这些结果表明TIL108Treg细胞分泌的可溶性 因子与其抑制功能直接相关。因此，TIL108Treg细胞系/克隆也许代表了一类新的Treg 细胞亚群，这群细胞介导免疫抑制通过一种不同于自然发生的⑶4+⑶25+Treg或Trl/Th3细 胞产生的免疫抑制机制（Levingsetal·，2002 ;Sakaguchi，2004 ;Shevach，2002)。随着评 估大量肿瘤患者来源的临床样品的增加，很可能新型Treg亚群将被发现。除了⑶4+Treg细 胞，其他Treg细胞亚群，包括⑶8+Treg细胞，NKT和γSTCRT细胞也可能在调节不同疾 病类型（自体免疫疾病和癌症）的宿主免疫反应中起重要作用（Cortesinietal.，2001 ; HaydayandTigelaar，2003;JiangandChess，2004)，表明存在一系列具有不同的抑制机 制或表型的Treg亚群。 由TIL108Treg细胞抑制效应T细胞功能
[0055] 我们接着测试了Treg细胞上清液是否能够抑制抗原特异性CD8+效应细胞的增 殖。如图4A所示，上清液也可以强烈抑制⑶8+TIL1359T细胞的增殖。为了确定由TIL108 Treg细胞克隆分泌的可溶性因子是否能够抑制TIL1363辅助性效应细胞分泌IL-2的活性， 我们用TIL1363辅助性细胞与1363黑色素瘤细胞（刺激物）在150μ1新鲜培养基中共培 养，添加50μ1来自TIL108T细胞克隆的细胞上清液，加或不加抗⑶3 (0ΚΤ3)抗体刺激。来 自TIL108Treg细胞的培养上清液用0ΚΤ3刺激抑制TIL1363-C1细胞分泌IL-2,对比来自 无任何活性的0KT3刺激的TIL1558效应细胞培养上清液或来自不加0KT3刺激的TIL108 Treg细胞培养上清液，。为了进一步检测TIL108Treg细胞与TIL1363辅助性T细胞和 1363黑色素瘤细胞共培养是否能更好抑制IL-2,我们发现0KT3刺激的TIL108Treg细胞 强烈抑制TIL1363辅助性T细胞分泌的IL-2对比不加0KT3刺激的TIL108Treg细胞（图 4C)。TIL1558辅助性T细胞用0KT3抗体刺激不能抑制TIL1363辅助性T细胞分泌IL-2。 这些数据表明抑制⑶4+辅助性T细胞分泌IL-2需要激活TIL108Treg细胞。 逆转TIL108Treg细胞的抑制功能
[0056] 我们接下来测试TIL108Treg细胞的抑制功能是否可以被Poly-G寡核苷酸抑制。 将TIL108Treg细胞用P〇ly-G10预处理可导致TIL108Treg细胞的抑制功能被逆转且初始 型⑶4+T细胞增殖能力恢复，然而不处理TIL108Treg细胞，其抑制功能仍然存在（图5A)。 更重要的是，从P〇ly-G10处理的TIL108Treg细胞收集的上清液增强初始型⑶4+T细胞的 增殖能力，对比来自未处理的TIL108Treg细胞，这些细胞仍然保留抑制能力（图5Β)。表 明由TIL108Treg细胞分泌的可溶性因子可被Poly-G介导的信号通路直接控制。
[0057] 我们接下来寻求确定Poly-G寡核苷酸逆转TIL108Treg细胞功能是否需要TLR8 信号通路。因此，我们用表达GFP的siRNA慢病毒载体敲除了存在于TIL108Treg细胞的 TLR8信号通路的一些关键分子如TLR8，MyD88和IRAK4,表达GFP的siRNA慢病毒载体能够 抑制相应基因的表达（Pengetal.，2005)。TIL108Treg细胞转染靶基因特异性的siRNA 病毒粒子被分为GFP+(转染）和GFP(未转染）细胞并测试它们对P〇ly-G10寡核苷酸的反 应。正如图5C所示，用siRNA特异性敲除TLR8，MyD88和IRAK4破坏Poly-G10寡核苷酸逆 转TIL108Treg细胞的功能。相比之下，当TIL108Treg细胞转染TLR7和TLR9特异性的 siRNA病毒时，抑制活性和可逆性都不会受到影响。筛选的GFP-TIL108Treg细胞具有与未 转染的亲本细胞相同的可逆转的抑制功能（图5C)。与这个结果一致，两个人TLR8的天然 配体（ssRNA40和sssRNA33)也能逆转TIL108Treg细胞的抑制功能，然而TLRs的其他配 体在Treg细胞存在时，不能恢复初始型型⑶4+T细胞的增殖（图。尽管SSRNA33配体 效果欠佳，但是用P〇ly-G2和SSRNA40处理的TIL108Treg细胞上清液也获得了类似结果 (图 。
[0058] 由于像自然发生的CD4+CD25+Treg细胞和LAGE1-特异性CD4+Treg细胞一样， TIL108Treg细胞分泌的可溶性因子的抑制活性也直接受TLR8信号控制。不管抑制的具体 机制，我们推测TLR8-MyD88信号通路特异性控制负责Treg细胞抑制作用的分子功能。尽 管还不清楚为什么是TLR8而不是其他TLR信号通路，控制Treg细胞的抑制活性，Treg细 胞中TLR的表达模式可以部分解释TLR8信号通路的独特性质。 另外一种情况是Treg细胞中的TLR8-MyD88-IRAK4复合物在MyD88-IRAK4的下游，可 能招募一种独特的信号通路，这种信号通路被用于控制Treg细胞的功能。 通过独特的TLR配体调节小鼠Treg细胞功能
[0059]由于小鼠TLR8没有功能（Jurketal.，2002)，逆转小鼠的Treg细胞抑制可能与 人的Treg细胞抑制不同。为了试验Poly-G寡核苷酸是否能小鼠TLR8逆转Treg细胞的 功能，我们分离并纯化了小鼠CD4+CD25+Treg细胞，评价它们对TLR配体的应答能力。小鼠 Treg细胞能够抑制初始型⑶4+T细胞的增殖，而单独的Treg细胞或APCs细胞加入抗⑶3 抗体后不会增殖（图6A)。然而，Poly-G寡核苷酸对逆转小鼠Treg细胞的抑制活性不起作 用（图6B)。
[0060] 有趣的是，TLR2,TLR7和TLR9的TLR配体能够逆转小鼠Treg细胞对初始型T细 胞增殖的抑制作用（图6B)。LPS，一种TLR4配体，对逆转Treg细胞的抑制作用有轻微作 用，然而TLR3和TLR5的配体对抑制功能毫无作用。这些数据确定特异性TLR信号在小鼠 Treg细胞存在下控制初始型T细胞增殖，阐述了通过改变CD4+Treg和T辅助细胞的平衡来 增强抗肿瘤免疫的基本原理。 构建人TLR8转基因模型
[0061] 由于小鼠TLR8不起作用，我们最近生产了转基因（Tg)小鼠。人TLR8在脾脏，胸 腺，淋巴结和CD4+T细胞中，但是在B细胞，CD8+T细胞或其他被分析的组织中不表达（图 7A)。因此，在⑶4人TLR8转基因小鼠的⑶4+T细胞的人TLR8准确可靠表达及其功能将大 大方便我们控制体内的Treg细胞功能。用Poly-G3而不是Poly-ΤΙΟ(对照组）处理表达 人TLR8的Treg细胞，可以逆转它们的抑制功能（图7B)。这些研究表明通过Poly-G3可以 逆转表达人TLR8的小鼠Treg细胞的抑制功能。 通过阻断Treg细胞功能增强抗肿瘤免疫
[0062] 为了测试Poly_G3处理是否可以通过阻断Treg细胞功能增强体内抗肿瘤免疫，我 们在day-2和day-Ι将Poly-G3,Poly-ΤΙΟ或CpG寡核苷酸通过尾静脉注入C57BL/6野生 型（对照组）和⑶4-人TLR8转基因小鼠体内，开发了一种保护性肿瘤模型。这种经过处 理的小鼠在dayO皮下注射B16肿瘤细胞（IX105细胞/小鼠），每2天监测肿瘤生长。我 们发现P〇ly_G3处理增强CD4-人TLR8转基因小鼠而不是C57BL/6小鼠的抗B16肿瘤免疫 反应（图8)。Poly-ΤΙΟ和CpG处理不能抑制C57BL/6小鼠和CD4-人TLR8转基因小鼠的 肿瘤生长，表明P〇ly-G3诱导的抗肿瘤免疫需要⑶4+T细胞表达TLR8。重要的是，我们发现 Poly-G3处理抑制⑶4-人TLR8转基因小鼠的前列腺RM1肿瘤细胞生长（图8)。在一些其 它肿瘤类型包括淋巴瘤，MCA28肉瘤，和RM1前列腺癌肿瘤细胞中也获得了类似结果。 鉴定能够逆转人Treg细胞抑制功能的新化合物
[0063] 由于目前我们对TLR8信号通路的认识还很有限，一种替代方法将是筛选小分子 化合物。为了解释这种方法的可行性，我们已经从Timtec股份有限公司购买数百个小分子 化合物，将如图9描述进行试验中筛选。
[0064] 尤其是，用可溶性抗⑶3抗体和抗原提呈细胞（APCs)进行了功能筛选试验。用磁 珠（MiltenviBiotec)纯化PBMCs得到初始型⑶4+T细胞。DCs用PBMC中的单核细胞在 IL-4(500ng/ml)和GM-CSF(800ng/ml)条件下培养7天。lxlO5的初始型CD4 +T细胞与调 节性T细胞在包含2xl04DCs和抗⑶3抗体（lOOng/ml)的200μ1的培养基中以1 : 0. 2， 1 : 0.1和1 : 0.05不