【附图说明】
[0022] 图1示出了具有继发性（获得性）抗性的细胞系的产生。通过在低浓度的埃罗替 尼（IC1(])下处理亲代细胞并继续将浓度经2-3个月提高至IC9。来产生HCC827抗性细胞。
[0023] 图2A-2C示出了控制埃罗替尼抗性的新型miRNA候选物的鉴定。从埃罗替尼抗 性HCC827细胞中分离RNA，并在Agilent/Sangerl2_0miRNA阵列上对该RNA进行测试以鉴 定在HCC埃罗替尼抗性细胞与亲代埃罗替尼敏感性细胞系中差异表达的miRNA。在浅色框 (box)和深色框中的miRNA分别在同一基因簇上编码。CP，顺铂；VC，长春新碱；DA，柔红霉 素；TZ，替莫唑胺（temozolodime) ;DR，多柔比星；PT;紫杉醇；IFN，干扰素；MDR，多药；A，凋 亡；C，西妥昔单抗；G，吉西他滨；T，他莫昔芬；M，甲氨蝶呤；5-FU，5-氟尿嘧啶；AM，阿霉素。
[0024] 图3A-3C显示了埃罗替尼和特定miRNA的组合效果。图3A:单独埃罗替尼的IC5。 值的确定。图3B:单独miRNA的IC5。（或IC2。或1C25)值的确定。图3C:miR-34a与埃罗替 尼的组合效果的确定。将miR-34在固定的低浓度（~IC25)下反向转染。然后，用系列稀 释的埃罗替尼处理细胞。通过目测剂量响应曲线和IC5。值的位移来评价组合效果。
[0025] 图4A-D示出了恢复癌细胞中的EGFR-TKI敏感性的微RNA模拟物的示例。图4A: 埃罗替尼在亲代HCC827细胞中的剂量依赖性效应。用系列稀释的埃罗替尼处理细胞3天， 并通过AlarmaBlue来测定细胞增殖。图4B:通过经10周的过程将细胞与浓度增加的埃罗 替尼一起温育来发展对埃罗替尼具有抗性的HCC827细胞（HCC827ras)，直到细胞在等于亲 代HCC827中的IC9。的浓度下正常生长。图4C和4D:将HCC827…和H1299细胞用0. 3nM miR-34a或miR-NC(阴性对照）反向转染，并在补充有系列稀释的埃罗替尼的培养基中温 育。3天后，测定细胞增殖。图中示出了单独的或与miRNA组合的埃罗替尼的IC5。值。
[0026] 图5A-C示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI药剂之间，特别是在NSCLC 细胞中miR-34a模拟物与埃罗替尼之间的协同效应的示例。图5A:组合指数（CI)分析。CI 值通过线性回归和非线性回归方法产生。趋势线指示在任何给定效果下的CI值（Fa，受影 响的分数，％抑制），并且符号表示源自实际数据点的CI值。CI= 1，加和性；CI>1，拮抗 作用；CI〈1，协同作用。图5B:等效线图分析。虚线对角线指示加和性，并且正方形符号显 示了分别达到50%和80% (A549、H1299、H460)或30%和50% (H226)癌细胞抑制的剂量 要求。加和性线下面的数据点表示协同作用，以上的数据点表示拮抗作用。图5C:曲线位 移分析。将源自非线性回归趋势线的数据对单一药剂的IC5。值进行归一化（IC5。等效）并 绘制在同一幅图中。组合的剂量响应曲线（虚线）相对于单一药剂的剂量响应曲线的向左 和向右的位移（灰、黑）分别表示协同或拮抗作用。示出了实际的实验数据点。
[0027] 图6A-D示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI之间的协同效应的示例，特 别是埃罗替尼与miR-34a的某些比例如何在A549细胞中协同配合。图6A:汇总表，显示了 以各种浓度和比例组合的埃罗替尼和miR-34a的效能（Fa)、CI和DRI值。示出了miR-34-埃 罗替尼摩尔比 1:533、1:1333、1:3333(1(：5。：1(：5。比）、1:8333 和 1:20833。图68:各种药物 比例的组合指数图。来自实际数据点的CI值用符号表示。图6C:在80%癌细胞抑制下的 等效线图。正方形符号表示各种比例的80%等效线。虚线表示源自产生80% (±2%)抑 制的实际埃罗替尼-miR_34a组合的等效线。图6D:各种药物比例的曲线位移分析。
[0028] 图7A-C示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI之间的协同效应的示例，特 别是埃罗替尼与miR-34a如何在HCC细胞中协同作用。图7A:组合指数分析。图7B:等效 线图分析。图7C:曲线位移分析。对该图的解释参见图5。
[0029] 图8A-C示出了控制NSCLC细胞中埃罗替尼抗性的基因的内源miR-34和mRNA水 平。在一式三份的qRT-PCR中使用总RNA来测量参与埃罗替尼抗性的基因的miR-34a/b/c 和mRNA水平。将数据分别对管家miRNA和mRNA进行归一化，并表示为相比于HCC827细胞 中的水平的变化百分比。u，未检测的。
[0030] 图9A-B示出了单一药剂在对埃罗替尼具有抗性的NSCLC细胞中的剂量-响应曲 线。单独采用埃罗替尼或miR-34a在所指示的浓度下一式三份处理细胞。分别在埃罗替 尼处理或miR-34a反向转染后3天或4天测定细胞增殖。使用Graphpad产生非线性回归 趋势线，并计算IC5。和1(：25值。用R2值表示非线性回归趋势线的拟合优度。星号表示由剂 量-响应曲线（H226)的外推得到的理论IC5。值。
[0031] 图10A-D示出了汇总表，其显示在NSCLC细胞中以各种浓度和比例组合的埃罗替 尼和miR-34a的效能、CI和DRI值。产生Fa>65%、CI〈0. 6、DRI>2的组合以灰色突出显示 并被认为是相关的。Fa，受影响的分数（细胞增殖的％抑制）；CI，组合指数；DRI，剂量降低 指数。
[0032] 图11示出了控制HCC细胞中埃罗替尼抗性的基因的miR-34和mRNA的内源性表 达。在一式三份的qRT-PCR中使用总RNA来测量参与埃罗替尼抗性的基因的miR-34a/b/c 和mRNA水平。分别将数据对管家miRNA和mRNA进行归一化，并表示为相比于在HCC827细 胞中的水平的变化百分比。u，未检测的。
[0033] 图12A-B示出了单一药剂在对埃罗替尼具有抗性的HCC细胞中的剂量-响应曲 线。单独采用埃罗替尼或miR-34a在所指示的浓度下一式三份处理细胞。分别在埃罗替 尼处理或miR-34a反向转染后3天或6天测定细胞增殖。使用Graphpad产生非线性回归 趋势线，并计算IC5。和1(：25值。用R2值表示非线性回归趋势线的拟合优度。星号表示由剂 量-响应曲线（Hep3B、C3A、HepG2)的外推得到的埃罗替尼的理论IC5。值。
[0034] 图13A-D示出了汇总表，其显示在HCC细胞中以各种浓度和比例组合的埃罗替尼 和miR-34a的效能、CI和DRI值。产生Fa>65%、CI〈0. 6、DRI>2的组合以灰色突出显示并 被认为是相关的。Fa，受影响的分数（细胞增殖的％抑制）；CI，组合指数；DRI，剂量降低指 数。
[0035] 图14示出了显示在全部四种测试的乳腺癌细胞系（BT-549、MCF-7、MDA-MB-231、 T47D)中与拉帕替尼协同作用的miR-34-Mim的数据。符号表示源自实际数据点的CI值。 CI，组合指数；Fa，受影响的分数（=增殖的抑制）；CI= 1，加和性；CI>1，拮抗作用；CI〈1， 协同作用。
【具体实施方式】
[0036] 本发明部分地基于以下发现：某些微RNA可在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地上调 或下调，以及微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合可具有有利的和/或出乎意料的结果，例 如由于它们在处理某些细胞中尤其有效（例如，协同作用或具有大于累加效应的效果）。因 此，本发明在各个方面和实施方案中包括使细胞、组织和/或生物与微RNA和EGFR-TKI药 剂的特定组合相接触。更具体地，本发明可包括使癌细胞、癌组织和/或患有癌症的生物与 微RNA和EGFR-TKI药剂的这样的组合相接触。所述方法可以是实验性的、诊断性的和/或 治疗性的。所述方法可用于抑制或减少细胞（包括组织或生物中的细胞）的增殖。微RNA 可以是例如在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地下调或上调的微RNA的模拟物或抑制剂。 微RNA
[0037] 微RNA(miRNA)是天然存在的小的非编码RNA分子，它在转录后调苄基因表达并 通过调节多种基因产物和细胞途径来决定细胞命运（Bartel,Cell, 2004. 116(2) :281-97)。 miRNA通过经由阻断蛋白质翻译机制降解mRNA转录物来干扰基因表达（Cartel，同 上）。miRNA靶向至具有这样的序列的mRNA，该序列完全或仅部分互补，赋予这些调节 性RNA靶向至范围宽但特异性的一组mRNA的能力。迄今为止，存在在多种过程如细胞 增殖、分化、凋亡、干细胞发育和免疫功能中发挥作用的约1，500个人类注释的miRNA基 因（Costinean等人，ProcNatlAcadSciUSA, 2006. 103(18) :7024-9)。通常，miRNA 的误调节可能导致包括癌症在内的人类疾病的发展（Esquela-Kerscher等人，NatRev Cancer, 2006. 6(4) :259-69;Calin等人，2006. 6(11) :857-66)。在癌症中解除调节的 miRNA可用作真正的肿瘤抑制基因或癌基因。单一miRNA可靶向至多个癌基因和致癌信号 途径（Forgacs等人，PatholOncolRes, 2001. 7(1):6-13)，并且将这种能力转化为将来 的治疗可能有希望产生对抗肿瘤异质性有效的治疗方法。因此，miRNA具有成为针对癌症 的强力治疗剂的潜力（Volinia等人，ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(7):2257-61; Tong等人，CancerGeneTher，2008. 15 (6) : 341-55)，根据我们目前对癌症的理解，该癌症 充当仅在采取多个癌症途径干预时才能被成功治疗的"途径疾病"（Wiggins等人，Cancer Res, 2010. 70 (14) : 5923 - 5930Jones等人，Science, 2008. 321 (5897) : 1801-6;Parsons等 人，Science, 2008. 321 (5897) : 1807-12) 〇
[0038] 截至2013年3月，MirnaTherapeutics(Austin，TX)已完成了临床前开发项目，以 支持cGMP材料的生产和基于miR-34的补充治疗（MRX34)的IND授权研究（IND-enabling studies)的进行。Mirna在非GLP初步研究中使用小鼠、大鼠和非人灵长类动物评估了含 有miR-34模拟物的制剂的毒性以及药代动力学特性。这些实验在预测的MRX34的治疗水 平下没有显示不良事件，如通过临床观察、体重、临床化学（包括LFT、RFT以及其他）、血液 学、总体病理学、选择器官的组织病理学和补体（CH5。）所测定的。此外，配制成脂质纳米颗 粒的miRNA模拟物并不诱导先天免疫系统，如在完全免疫活性的小鼠、大鼠、非人灵长类动 物以及人全血样本中所显示的。在Bader,FrontGenet. 2012 ;3120中提供了对临床前数据 的更详细的评述。
[0039] 在本发明的方法中，将特定微RNA(例如，合成的微RNA模拟物或抑制剂）作为与 EGFR-TKI药剂的联合治疗的一部分施用于受试者。在具体的实施方案中，这样的微RNA选 自SEQIDN0:1-179。这些微RNA是本领域公知的，并且本领域技术人员将会理解它们包括 传统的天然存在的序列（本文所提供的）及其任何化学修饰的形式和序列同源物。
[0040] 在各个方面和实施方案中，本发明采用不通过转染递送至细胞的微RNA模拟物或 抑制剂。相反，在各个实施方案中，可以通过诸如注射或输注的方法来施用微RNA。在一些 实施方案中，受试者可以是哺乳动物（例如，人或实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、非人 灵长类动物等），而非分离的细胞、组织或其培养物。
[0041] 与本发明结合使用的微RNA可以是7-130个核苷酸长的双链RNA分子，其具有两 个独立的链或发夹结构。例如，微RNA可以是7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、7-30、7-25、15-30、15-25、17-30或17-25个核苷酸长。两条 链中被称作"引导链"的一条链含有与下表中所示的亲本微RNA序列的种子序列（核苷酸位 置2-9)相同或基本相同的序列。如本文所用的"基本相同"意指最多允许1或2个置换和/ 或缺失。在一些实施方案中，所述引导链包含与本文提供的相应全长序列至少80%、85%、 90%、95%相同的序列。两条链中被称作"随从链（passengerstrand)"的第二条链含有与 相应的给定微RNA的种子序列互补或基本互补的序列。如本文所用的"基本互补"意指最 多允许1或2个错配和/或缺失。在一些实施方案中，所述随从链包含与本文提供的相应 的全长序列的互补序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%相同的序列。在 一些实施方案中，该微RNA是miR_34a、miR_34b、miR_34c、miR_449a、miR_449b、miR_449c、 miR-192、miR-215、miR-126、miR-124、miR-147或其类似物或同源物的模拟物。在一些实施 方案中，该微RNA包括这些微RNA中的一个的种子序列。 表1-微RNA序列和序列标识号
表示缺失或任何核苷酸。种子序列以粗体突出显示。
[0042] 微RNA(例如微RNA模拟物）可配制在脂质体中，例如在美国专利号7, 858, 117和 7, 371，404 ;美国专利申请公开号2009-0306194和2011-0009641中所述的那些脂质体中。 其他的递送技术是本领域已知的并且可获得的，包括表达载体、脂质或各种配体偶联物。
[0043] 在某些实施方案中，本发明的方法包括施用选自在附录A中以SEQID NO: 123-167,优选SEQIDNO: 156-167,更优选SEQIDNO: 159、164 和 165 列出的微RNA的 微RNA的抑制剂。微RNA的抑制剂是本领域公知的并且通常是与靶微RNA互补的反义分子， 然而，也可使用其他类型的抑制剂。例如，在美国专利号8, 110, 558中描述了微RNA的抑制 剂。在某些实施方案中，微RNA的抑制剂含有9-20、10-18或12-17个核苷酸长的序列，该序 列与在附录A中以SEQIDN0:123-167,优选SEQIDN0:156-167,更优选SEQIDN0:159、 164和165列出的相应上调的微RNA序列互补或基本互补。
[0044] 也可对微RNA及其抑制剂进行化学修饰，例如，微RNA可具有在随从链上的5'帽 (例如，NH2-(CH2)6-0-)和/或在同一条链的第一和/第二核苷酸处的错配。其他可能的 化学修饰可包括骨架修饰（例如，硫代磷酸酯、吗啉代）、核糖修饰（例如，2' -0Me、2' -Me、 2' -F、2' -4' -锁糖/桥糖（例如，LNA、ENA、UNA)以及核碱基修饰（参见，例如，Peacock 等人，2011.JAmChemSoc.，133 (24) :9200 - 9203)。在某些实施方案中，微RNA，尤其是 miR-34和miR-124,具有如在美国专利号7, 960, 359和美国专利申请公开号2012-0276627 和2012-0288933中所述的修饰。
[0045] 微RNA可以作为缓慢团注以范围为每剂0· 001-10. 0mg/kg，例如，每剂0· 01-3. 0、 0. 025-1. 0或0. 25-0. 5mg/kg的剂量，每周一、二、三个或更多个剂量地静脉内施用2、4、6、8 周或必要时更长的时间。 EGFR-TKI药剂
[0046] 本发明的方法包括向受试者施用EGFR-TKI药剂。表皮生长因子受体（EGFR)的家 族包括四种结构相关的细胞表面受体酪氨酸激酶，这些细胞表面受体酪氨酸激酶响应于表 皮生长因子（EGF)家族的成员结合并引发功能。在人类中，这包括EGFR(也称为Her-Ι和 ErbBl)、Her-2 (也称为Neu和ErbB2)、Her-3 (ErbB3)和Her-4 (ErbB4)。ErbB信号传导的 超活化与很多种实体瘤的发展有关。因此，在各种其他实施方案中，本发明包括微RNA与埃 罗替尼以及其他EGFR抑制剂如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗以及HER2抑制 剂如拉帕替尼、培妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合。
[0047] 在某些实施方案中，所述EGFR-TKI是埃罗替尼，即目前以商品名TARCEVA?· 销售的药物的活性成分。除非另有明确说明，本文中的术语"埃罗替尼"指的是