式I的化合 物，也指其任何盐或酯。
[0048] 埃罗替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，即一种化学名为N-(3_乙炔基苯基）_6, 7-双 (2-甲氧基乙氧基）-4-喹唑啉胺的喹唑啉胺。在具体的实施方案中，该埃罗替尼是盐酸 埃罗替尼。用于口服给药的TARCEVA?片剂可以以三个剂量强度获得，其含有相当于 25mg、100mg和150mg埃罗替尼的盐酸埃罗替尼（27. 3mg、109. 3mg和163. 9mg)，以及下列非 活性成分：乳糖一水合物、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、羟乙酸淀 粉钠、月桂基硫酸钠和二氧化钛。所述片剂还包含痕量的色素添加剂，包括用于产物辨识的 FD&CYellow#6(仅25mg)。进一步的信息可从批准的药物标签上获得。
[0049] 埃罗替尼还描述于美国专利号6, 900, 221 (其通过引用并入本文）以及相应的PCT 公开TO01/34574 中。
[0050]用于NSCLC的TARCEVA?的批准推荐剂量是150mg/天；用于胰腺癌的批准 剂量为l〇〇mg/天。必要时可将剂量以50mg的递减量降低。
[0051] 在其中EGFR-TKI药剂是埃罗替尼的某些实施方案中，微RNA不具有miR-126的序 列（例如，与人类miR-126的序列或其种子序列有小于100%、95%、90%、85%或80%的同 一性）。
[0052] 在其他实施方案中，所述EGFR-TKI药剂是吉非替尼，即以商品名丨RESSA?销 售的药物的活性成分。除非另有明确说明，术语"吉非替尼"在本文中指的是式II的化合 物，也指其任何盐或酯。
[0053] 吉非替尼是化学名称为4-喹唑啉胺、N- (3-氯-4氟苯基）-7-甲氧基-6-[3-4-吗 啉）丙氧基]以及还称作ZD1839的酪氨酸激酶抑制剂。临床制剂作为250mg的片剂提供， 该片剂含有活性成分、乳糖一水合物、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、月桂基硫 酸钠和硬脂酸镁。作为单一治疗的推荐的剂量为每天一个250mg的片剂。进一步的信息可 在批准的药物标签上找到。
[0054] 其他EGFR抑制剂，如阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗，以及HER2抑制剂如拉帕 替尼、培妥珠单抗和曲妥珠单抗是本领域已知的，因此普通技术人员将容易知晓它们在将 要与本发明一起使用时所需的结构、配制、剂量和给药等（例如，基于公开的医学信息如批 准的药物标签）。 癌症
[0055] 本发明提供了用于处理癌细胞和/或组织（包括受试者的癌细胞和/或组织）的 方法和组合物，或者分离的癌细胞和/或组织的体外处理。如果在受试者体内，则待治疗的 受试者可以是动物，例如，人或实验动物。
[0056] 正在治疗的受试者可被诊断为患有癌症，例如，肺癌（非小细胞肺癌（NSCLC)，例 如，腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌）、胰腺癌或肝中的癌症或受益于EGRF抑制的任何其他类 型的癌症（包括乳腺癌、HCC、结肠直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌或膀胱癌）。在一 些实施方案中，所述细胞或受试者对EGFR-TKI药剂具有原发性或继发性抗性。
[0057] 所述受试者可能具有局部晚期、不可切除的或转移性癌症，和/或可能先前的一 线治疗已经失败。在一些实施方案中，所述受试者已经经历了持续至少2、4、6、8、10个月或 更长时间的采用EGFR-TKI药剂的先前治疗。在其他实施方案中，所述受试者具有EGFR中的 T790M突变（Balak等人.2006.ClinCancerRes, 12 (1):6494 - 501)。在其他实施方案中， 所述受试者是已经历对EGFR-TKI药剂的一个或多个显著不良副作用并且因此需要减少剂 量的患者。正在治疗的受试者还可以是具有以下之一的特征的受试者：（l)K-RAS突变；（2) c-Met的扩增和超表达；（3)BRAF突变；（4)ALK易位；（5)肝细胞生长因子（HGF)超表达； (6)其他EGFR突变（在外显子20中的小插入或复制：D770_N771、insNPG、insSVQ、ins G和N771T);以及（7)影响EGFR下游的信号传导的遗传损伤，包括PIK3CA，PTEN、IGF1R和 KDM5A的损失。
[0058] 在各个实施方案中，所述癌症是肝癌（例如，HCC)。该肝癌可能对EGFR-TKI药剂 不具有抗性。或者，该肝癌（例如，HCC)可能对EGFR-TKI药剂具有原发性或继发性抗性。 所述受试者可以是在不存在微RNA的情况下对EGFR-TKI药剂的响应者。该受试者可以是 在不存在微RNA的情况下对EGFR-TKI的非响应者。在一些实施方案中，该受试者已经经历 了持续至少2、4、6、8、10个月或更长时间的采用EGFR-TKI药剂的先前治疗。在其他实施方 案中，该受试者是已经历对EGFR-TKI药剂的一个或多个显著不良副作用并且因此需要减 少剂量的患者。
[0059] 在各个实施方案中，所述肝癌（例如，HCC)可以是中间期、晚期或末期的。该肝癌 (例如，HCC)可以是转移性或非转移性的。该肝癌（例如，HCC)可以是可切除的或不可切 除的。该肝癌（例如，HCC)可以包含单个肿瘤、多个肿瘤或具有浸润性生长模式（进入门静 脉或肝静脉）的非明确定义的肿瘤。该肝癌（例如，HCC)可包括纤维板层样、假腺性（腺 样）、多形性（巨细胞）或透明细胞模式。该肝癌（例如，HCC)可以包括良好分化形式，并 且肿瘤细胞类似于肝细胞，形成小梁、索带（cord)和巢，和/或在细胞质中含有胆色素。该 肝癌（例如，HCC)可以包括不良分化形式，并且恶性上皮细胞是松散的、多形性的、间变性 的和/或巨大的。在一些实施方案中，该肝癌（例如，HCC)与乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化 或2型糖尿病相关。
[0060] 在一些实施方案中，减少EGFR-TKI药剂的治疗有效剂量。例如，将EGFR-TKI药剂 的每周或每月剂量相对于最大推荐剂量或最大耐受剂量减少至少10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60 %、70%、80 %、90%或更多。在其他实施方案中，施用有效剂量的EGFR-TKI药剂， 该有效剂量比在不存在微RNA(或微RNA抑制剂）施用的情况下有效所需的剂量低至少 50%、60%、70%、80%、90%或更多。例如，埃罗替尼可以以每天50、40、30、2511^或更少的 剂量施用。在一些实施方案中，EGFR-TKI药剂的IC5。相对于在不存在微RNA治疗（或如果 将施用抑制剂情况下的微RNA抑制剂治疗）的情况下的IC5。降低了至少4、5、10、20、30、40、 50或100倍。例如，可以如实施例中所述确定IC5。。 联合化疗
[0061] 联合化疗或多重疗法使用多于一种药物或其他治疗（例如，不同于单独采用的任 何治疗的单一治疗）。如本文针对本发明所使用的，该术语指使用EGFR-TKI药剂和微RNA 的特定组合。
[0062] 如本文在描述例如比例、剂量、时间等的范围时所用的，术语"约"包含了在相关误 差界限之内、基本相同（例如，对于遵循正态或高斯分布的现象，在本领域接受的置信区间 如95%以内）或另外不会实质改变所定量的事物的效果的变化。
[0063] EGFR-TKI药剂的给药量和/或时间表可遵循临床批准的指导或实验指导。在各个 实施方案中，关于在EGFR-TKI药剂部分的描述，EGFR-TKI药剂的剂量可以是由FDA药物标 签或另一个机构的标签/说明规定的剂量。
[0064] 同样地，微RNA的给药量和/或时间表可遵循临床批准的指导或实验指导。在各 个实施方案中，微RNA的剂量为每天约 10、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225 或 250mg/m2〇
[0065] 在各个实施方案中，将微RNA经单周（7天）以1、2、3、4、5、6或7个日剂量施用于 受试者。可将微RNA经14天以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个日剂量施用于受 试者。可将微RNA经 21 天以 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21个日剂量施用于受试者。可将微RNA经28天以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 个日剂量施用于受试者。
[0066] 在各个实施方案中，微RNA:施用2周（共计14天）；施用1周停药1周（共计14 天）；施用连续3周（共计21天）；施用2周停药1周（共计21天）；施用1周停药2周 (共计21天）；施用连续4周（共计28天）；施用连续3周停药1周（共计28天）；施用2 周停药2周（共计28天）；施用1周停药连续3周（共计28天）。
[0067] 在各个实施方案中，微RNA:在7、14、21或28天周期的第1天施用；在21或28天 周期的第1和15天施用；在21或28天周期的第1、8和15天施用；或在21或28天周期的 第1、2、8和15天施用。微RNA可以每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。
[0068] EGFR-TKI药剂-微RNA治疗疗程可由临床医生规定。该联合治疗可施用1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 个周期。
[0069] 可继续EGFR-TKI药剂-微RNA治疗的疗程直到满足临床终点。在一些实施方案 中，继续治疗直到发生疾病进展或不可接受的毒性。在一些实施方案中，继续治疗直到获得 定义为没有癌症的病理完全缓解（PCR)速率。在一些实施方案中，继续治疗直到癌症部分 或完全缓解。向多个患有癌症的受试者施用微RNA和EGFR-TKI药剂可提高总生存率（0S)、 无进展生存率（PFS)、无病生存率（DFS)、响应率（RR)、生活质量（QoL)或其组合。
[0070] 在各个实施方案中，所述治疗减小了癌症肿瘤的大小和/或数目；阻止癌症肿瘤 的大小和/或数目的增加；和/或阻止癌症肿瘤转移。
[0071] 在本发明的方法中，施用不一定局限于任何特定的递送系统，并且可包括但不限 于肠胃外（包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射）、直肠、局部、经皮或口 月艮（例如，以胶囊、悬浮液或片剂）。向个体给药可以以单一剂量或重复给药的方式，以及 以多种生理上可接受的盐形式的任何形式，和/或以可接受的药物载体和/或添加剂作为 药物组合物的一部分而发生。生理上可接受的盐形式和标准的药物配制技术、剂量和赋形 剂是本领域技术人员公知的（参见，例如Physicians'DeskReference(PDR?) 20〇5，第 59 1? . ,MedicalEconomicsCompany, 2004 ;以及Remington:TheScienceandPractice ofPharmacy编著·Gennado等人.第 21 版·，Lippincott,Williams&Wilkins, 2005)。
[0072] 此外，在一种动物中获得的有效剂量可使用本领域已知的转换因子外推用于另 一种动物，包括人类。关于等效表面积剂量因子，参见，例如，Freireich等人，Cancer ChemotherReports50(4):219-244(1966)以及表 2〇 表2-等效表面积剂量因子
[0073] 在各个实施方案中，微RNA在EGFR-TKI药剂之前、与EGFR-TKI药剂同时、在 EGFR-TKI药剂之后或以其组合形式施用。微RNA可以静脉内施用。微RNA可以全身或局部 施用。
[0074] 本发明的联合治疗并非特别地局限于任何特定的过程或方案，并且可单独地或与 其他治疗方法（例如，化疗或放疗）联合地使用。
[0075] 除EGFR-TKI药剂和微RNA之外，根据本发明的联合治疗还可包括附加治疗（例 如，药物、放射等）。类似地，本发明可用作辅助治疗（例如，当与手术结合时）。在各个实 施方案中，受试者还通过手术切除、经皮乙醇或乙酸注射、经导管动脉化学栓塞、射频消融、 激光消融、冷冻消融、聚焦外束福射立体定向放射治疗（focusedexternalbeamradiation stereotacticradiotherapy)、选择性内部放射治疗、动脉内碘-131-碘油施用和/或高强 度聚焦超声进行治疗。
[0076] 微RNA和EGFR-TKI药剂的组合可用作辅助、新辅助、伴随、同时或姑息性治疗。微 RNA和EGFR-TKI药剂的组合可用作一线治疗、二线治疗或交叉治疗。
[0077] 在一些实施方案中，通过与微RNA组合减少了EGFR-TKI药剂的治疗有效剂量。 例如，EGFR-TKI药剂的每日、每周或每月剂量可相对于最大推荐剂量或最大耐受剂量减 少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在其他实施方案中， EGFR-TKI药剂以有效剂量施用，该有效剂量比在不存在微RNA(或微RNA抑制剂）施用的 情况下有效所需的剂量低至少50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些实施方案中， EGFR-TKI药剂的IC5。相对于在不存在微RNA(或微RNA抑制剂）的情况下的IC5。降低了至 少 4、5、10、20、30、40、50 或 100 倍。
[0078] 在下面的实施例部分提供了联合治疗的进一步描述和实施方案。
[0079] 如在以下实施例中讨论和进一步说明的，本发明提供了用于治疗癌症（例如，肺 癌或肝癌）的方法和组合物，其中EGFR-TKI药剂和微RNA以特别有效（例如，协同或大于 加和的）的组合形式施用。尽管协同作用和同义的术语在本领域中常用，但该特性并不总 是定义的或量化的（以及，因此，声称的协同作用可能实际上并不存在）。关于本发明和以 下实施例，使用组合指数（CI)值来量化EGFR-TKI药剂和微RNA的各种组合的效果。
[0080] 在各个实施方案中，EGFR-TKI药剂和微RNA的组合在癌症（例如，肺癌或肝癌）中 表现出CI〈1。该组合在癌症中可表现出CK0. 95、0· 90、0· 85、0· 80、0· 75、0· 70、0· 65、0· 60、 0· 55、0· 50、0· 45、0· 40、0· 35、0· 30、0· 25 或 0· 20。
[0081] 以下实施例提供了本发明的说明性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可在 不改变本发明的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本发 明的范围内。该实施例不以任何方式限制本发明。 实施例 实施例1 :埃罗替尼抗性细胞系的选择
[0082] 我们遵循了描述于Engelman等人（同上）中的方案来产生对埃罗替尼具有获 得性抗性的NSCLC系。简言之，将对埃罗替尼高度敏感（1(：5。^^#；0=〇.〇54以1)的亲代 HCC827细胞与埃罗替尼一起在增加的浓度下经10周温育直到细胞能够在含有相当于在亲 代HCC827细胞中的IC9。的浓度的埃罗替尼的培养基中增殖。经过选择过程，获得了来自单 独的细胞克隆的3个细胞系（HCC8275?5'6'7)。此外，我们获得了据推测起源于多个克隆的 异基因大量培养物（HCC827fttm )(参见图1)。
[0083] 表3提供了用于评估miRNA和EGFR-TKI的组合效果的4种NSCLC细胞的列表。根 据EGFR-TKI在这些细胞中的IC5。值、它们的致癌特性和它们对miRNA的敏感性来选择特定 的细胞系。该列表包含对埃罗替尼具有抗性的细胞系和敏感的细胞。示出了如在科学文献 中报道的埃罗替尼对这些细胞系中的每一个的IC5。值。在这些实施例中，1C5。值>1μΜ的 细胞系被认为是抗性的。 表3
*N/R=在科学文献中没有报道 实施例2 :控制埃罗替尼抗性的差异表达的微RNA候选物的鉴定
[0084] 全部四种细胞系以及亲代HCC827系用于RNA提取并经历mRNA(Affymetrix HG_U133Plus2.0)和miRNA(Agilent/Sangerl2_0)阵列分析。出乎意料地，相对较少的mRNA在抗性系与亲本系之间差异性表达（数据未示出）。相比之下，miRNA的表达水平显 著改变。抗性细胞与亲本系之间miRNA表达的比较显示克隆#7与HCC827关系最为密切 (R2= 0. 9347)，并且抗性池是最小相关的系（R2= 0.8308)。这与该池由多个克隆所产生 的假设一致。当与亲本系相比时，miRNA的无监督聚类鉴定了在全部抗性HCC827细胞中 的15种上调和23种下调的miRNA(图2A)。发现在基因簇中编码并表达为多顺反子转录 物miR-106b~93~25和miR-24~27b~23b的miRNA均分别上调或下调。这表明遗传 机制导致miRNA在埃罗替尼抗性细胞中的差异表达。许多差异表达的miRNA先前已与对其 他化疗的抗性相关