一例如，在埃罗替尼抗性HCC827细胞中上调的miRNA有助于对传统治疗 的抗性，并且下调的miRNA抑制化学抗性。两种miRNA(let-7b、miR-486)已经参与对西妥 昔单抗（一种抗EGFR的单克隆抗体）的抗性。参与埃罗替尼抗性对于全部miRNA是新型 的。对预期被这些miRNA抑制的基因产物的研究揭示，埃罗替尼抗性细胞中下调的miRNA 具有较高的倾向抑制已知的埃罗替尼抗性基因，包括RAS、EGFR、MET和HGF。定量逆转录 酶PCR(qRT-PCR)显示，MET和HGF在全部埃罗替尼抗性细胞系中均高度超表达。这与显示 HGF/MET轴在获得性埃罗替尼抗性中的作用的先前报告一致。MET和HGF超表达可能是如先 前报道的基因扩增的结果，或者可替代地，如我们的数据集所表明的抑制这些基因的miRNA 表达的损失的结果（进一步研究的主题）。附录A提供了图2A下面的定量数据。 实施例3 :埃罗替尼和微RNA的组合效果
[0085] 在组合研究中使用的肺癌细胞系包括对埃罗替尼具有抗性（H1299、H460、HCC827， 全部具有抗性）或敏感的（HCC827亲代）细胞系。组合的主要目的是获得埃罗替尼的强 化治疗效果（降低的IC5。）并降低埃罗替尼的剂量和毒性。按照"固定浓度模型（Fixed ConcentrationModel) "（Fiebig，H.H·，CombinationStudies)进行组合工作的评估。在 7-8个浓度下测试细胞毒性化合物A(埃罗替尼），并在一个低浓度下测试化合物B(miRNA)。 使用AlamarBlue测定（Invitrogen,Carlsbad,CA)来评估药物或miRNA对细胞增殖的影 响。使用GraphPad软件计算单独的及组合的埃罗替尼的IC5。值。
[0086] 首先，在细胞中测定单独埃罗替尼或单独miRNA的IC5。值。将miRNA在固定的、低 浓度（~IC25)下反向转染。所用的微RNA序列示于表1中。错义序列用作阴性对照。然 后，采用系列稀释的埃罗替尼处理细胞。在药物处理后3天通过AlarmaBlue测定分析细胞 增殖抑制。使用GraphPad软件确定与miRNA组合的埃罗替尼的IC5。值。通过目测剂量响 应曲线和IC5。值的位移对组合效果进行评价。单独的或与六个测试的miRNA中的每一个相 组合的埃罗替尼的IC5。结果分别记录在表4中。
实施例4 :埃罗替尼和miRNA的体内功效评估 [0087] 为了在体内测试埃罗替尼/微RNA组合的效果，使用例如基于稳定表达萤光素酶 报道基因的原位异种移植的肿瘤小鼠模型。典型的功效研究包括每组8只动物。埃罗替尼/miRNA组合之后，其他的研究组包括单独的埃罗替尼、单独的miRNA以及埃罗替尼/miR-NC 和非治疗对照。当肺中的肿瘤病变通过IVIS成像变得明显时，开始miRNA治疗。每隔一天 以允许检测埃罗替尼增强的适度有效剂量（l-l〇mg/kg)静脉内施用在纳米颗粒中复合的 miRNA。通过管饲法以在小鼠中显示良好耐受的每日剂量每日给予埃罗替尼。治疗持续时间 为2-4周，或直至对照小鼠变得垂死，以先到者为准。严密监测动物以检测毒性体征。处死 后，收集肺和肺肿瘤组织并对其进行组织病理学分析（H&E;ki67和casp3IHC，如果合理）。 从正常的肺、肺肿瘤、脾和全血中提取RNA以通过qRT-PCR测量miRNA模拟物的浓度。此外， 使用肿瘤样品来测试直接/经验证的miRNA革E标的敲减（qRT-PCR)。可通过H&E或人特异 性IHC染色（STEM121，StemCells，Inc.)来评估在主要器官中的转移水平。
[0088] 预期埃罗替尼/miRNA组合将显示比单独埃罗替尼更好的体内功效，并同时抑制 肿瘤组织中的已知miRNA靶标。还预期用埃罗替尼/miRNA组合物治疗的动物不太可能产 生转移并显不提尚的存活率。 实施例5 :EGFR-TKI和微RNA的体外功效的评估
[0089] 简介
[0090] 本实施例研究了miR34a与埃罗替尼的关系以及该组合在具有原发性和获得性埃 罗替尼抗性的NSCLC细胞中的治疗活性。还将该药物组合在一组肝细胞癌细胞（HCC) -一 一种已知对埃罗替尼为难治性的癌症类型中进行测试。通过使用多种分析方法，测定癌细 胞增殖的药物诱导抑制，以揭示加和、拮抗或协同效应。该数据显示了在所测试的全部癌细 胞中埃罗替尼与miR-34a模拟物之间强的协同相互作用。在整个剂量水平和药物比例范围 观察到协同作用，将对埃罗替尼和miR-34a的IC5。剂量需求分别降低了高达46倍和13倍。 在提供超出由单独药剂诱导并因此具有临床相关性的癌细胞抑制的尚水平癌细胞抑制的 剂量下检测到最大协同作用。该数据表明，大多数NSCLC，以及先前不适合EGFR-TKI治疗的 其他癌症，在与基于微RNA的治疗联合使用时证明了对该药物是敏感的。
[0091] 材料与方法
[0092] 细胞系：人类非小细胞肺癌（NSCLC)细胞系A549、H460、H1299、H226、HCC827亲 代和HCC827fes用于评估微RNA和EGFR-TKI的组合效果。根据EGFR-TKI在这些细胞中的 高IC5。值、它们的致癌特性和对miRNA的敏感性来选择特定的细胞系。这些细胞系是抗性 的（A549、H460、H1299、H226)或敏感的（HCC827)。此外，具有获得性抗性的细胞系通过经 十周施加增加的埃罗替尼的选择性压力而产生，以IQ。的等效量开始并以IC9。等效量结束。 由于细胞增殖在IC9。选择下显示正常的倍增速率，在低稀释度（HCC8271'，或高稀释度下接 种抗性细胞以产生几乎纯的抗性克隆（HCC827ras-#5、6和7)。为了研究在肝细胞癌（HCC) 细胞中的效果，使用了Η印3B、Huh7、C3A和Η印G2。Huh7细胞从日本研究生物资源细胞库 (JapaneseCollectionofResearchBioresourcesCellBank)获得。所有其他亲代细胞 从美国模式培养物保藏所（ATCC，Manassas，VA)购买并按照提供者的说明进行培养。
[0093]RNA分离和qRT-PCR:根据制造商的说明使用mirVANAPARISRNA分离试剂 盒（Ambion,Austin,TX)从细胞团（cellpellet)中分离总RNA。通过在Nanodrop ND-1000(ThermoScientific,Wilmington,DE)上的吸光度测量（A260)来确定RNA浓度。 为了通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR)来量化miRNA和mRNA，我们使用了商购可 得的试剂。使用MMLV-RT(Invitrogen,Carlsbad,CA)在以下条件下将RNA转化为cDNA: 在 4°C下 15min;在 16°C下 30min;在 42°C下 30min;在 85°C下 5min。cDNA合成后，使用 PlatinumTaq聚合酶（Invitrogen)在以下循环条件下在ABIPrism7900HTSDS(Applied Biosystems，LifeTechnologies，FosterCity，CA)上对 2yL的cDNA进行qPCR:在 95°C 下lmin(初始变性）；然后是在95°C下5秒、在60°C下30秒的50次循环。使用TaqMan基 因表达测定和TaqMan微RNA测定进行在所有肺和肝细胞系中mRNA和miRNA的表达分析。 对于miRNA表达，添加至制造商的试剂的试剂包括DMS0 (6%的最终浓度）和四甲基氯化铵 (TMAC;在RT和PCR中均为50mM的最终浓度），以改善miRNA测定的斜率、线性度和灵敏度。 通过对HCC827亲代细胞系的相对定量来确定miRNA和mRNA两者的表达水平。将miRNA和 mRNA靶标的原始Ct值对选择的管家基因进行归一化以产生△ -Ct值，转化为线性空间，并 随后表示为表达百分比。
[0094]miRNA和EGFR-TKI治疗：从LCLaboratories(Woburn,MA)购买盐酸埃罗替尼。 由LifeTechnologies(Ambion，Austin，TX)制备合成的miR_34a和miR-NC模拟物。为了 测定单独的每种药物的IC5。值，采用96孔板形式每孔接种2, 000-3, 000个细胞，并如下用 埃罗替尼或miR_34a进行处理。（i)使用来自Invitrogen的RNAiMax脂转染胺将miR_34a 模拟物在系列稀释液（〇.〇3_30nM)中一式三份进行反向转染。作为对照，还采用单独的 RNAiMax(模拟的）或与阴性对照miRNA模拟物（miR-NC)复合的RNAiMax对细胞进行转染。 在转染后4天或6天将细胞与AlamarBlue(Invitrogen) -起温育以分别确定肺癌或肝癌 细胞的细胞增殖。将增殖数据对模拟转染的细胞进行归一化。（ii)在接种后一天，以0.1 至100μΜ的最终浓度，向细胞中加入在二甲基亚砜（DMS0)中制备为10和20mM储备液的 埃罗替尼。向在单独的孔中的细胞中添加单独的溶剂（在H226和HCC827中0. 5%的最终 DMS0,在全部其他细胞系中1 %的最终DMS0)作为对照。此后三天，通过AlamarBlue测定细 胞增殖并将其对溶剂对照进行归一化。
[0095]回归趋势线和IC5。值：使用CompuSyn(ComboSyn,Inc,Paramus,NJ)和 Graphpad(Prism)软件分别产生线性和非线性回归趋势线。非线性趋势线提供了对于实际 数据更好的拟合并用于计算IC5。、1(：25和其他药物浓度（ICx)，尽管这两个软件程序产生了 相似的值。
[0096] 通过"固定浓度"法测定的组合效果。
[0097] 该"固定浓度"法用于具有获得性抗性的细胞系（HCC827ras)。如上所述使用在固 定的、低浓度（~IC25)下的miRNA，用miR-34a对细胞进行反向转染。第二天，用系列稀释 (0. 01-100μΜ)的埃罗替尼处理细胞。通过AlamarBlue在3天后分析细胞增殖抑制。为了测 量单一药剂的效果并校正由脂质载体或媒介物潜在导致的效果，还用与溶剂（在HCC827ras 中的0. 5 %DMS0,在全部其他细胞系中的1 %DMS0)组合的miR-34a或与模拟转染组合的 埃罗替尼来处理细胞。将全部增殖数据对用溶剂（DMS0)处理的模拟转染的细胞进行归一 化。通过目测埃罗替尼剂量-响应曲线和在存在或不存在miR-34a的情况下的IC5。值的位 移（使用Graphpad绘图并计算）来评价组合效果。
[0098] 通过"固定比例"法确定的组合效果
[0099] 用各自与7个浓度的miR34a组合的7个浓度的埃罗替尼处理细胞。每一种药物 在约等于其IC5。的浓度下以及在以上或以下2. 5倍（NSCLC)或2倍（HCC)增量之内的浓度 下使用。该基质产生了代表13个不同比例的总计49个不同组合。还在这些浓度下单独使 用每种药物。如上所述添加miR-34a和埃罗替尼，并且通过AlamarBlue来测定细胞增殖。 一式三份完成每一个数据点。
[0100] 组合指数（CI)值的计算
[0101] 确定基于Loewe加和性模型的CI值以评估药物-药物相互作用的性质，该性质针 对各种药物-药物浓度和有效水平（Fa，受影响的分数；癌细胞增殖的抑制）可以是加和性 的（CI= 1)、拮抗性的（CI>1)或协同性的（CI〈1)。使用线性回归和非线性回归趋势线两者 来计算和比较CI值。使用CompuSyn软件（ComboSynInc.，Paramus,NJ)按照Chou等人的 方法来完成基于线性回归分析的CI值，借此将双曲线和S形剂量-效应曲线转化为线性形 式（ChouTC(2010)Drugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusing theChou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6,还可在ComboSyn,Inc.，www.combosyn. com上获得说明）。使用等式1计算源自非线性回归趋势线的CI值，其中CA，X和CB，x是产生 效果X(Fa)的组合中药物A和药物B的浓度。ICx,dPICu是作为单一药剂用来产生同样 效应的药物A和药物B的浓度。
[0102] 使用Hill方程（方程式2)、IC5。和由非线性回归趋势线（Graphpad)产生的Hill 斜率值（η)来计算方程式1中确定CI值所需的药物浓度（CAiX、CBiX、ICXiA和1CΧιΒ)。
[0103] 等效线图
[0104] 为了描述埃罗替尼与miR_34a的剂量依赖的相互作用，生成了在对癌细胞增殖的 50%和80%抑制的有效水平下的等效线图。由于单一药剂一单独的或组合的一通常达到 50%的癌细胞抑制，因此50%等效线图提供了单一使用相对于所述组合的实际比较。使用 80%等效线图来说明在肿瘤学中具有实际意义的高效应水平下所述组合的效用。在这些中 的每一个中，通过从它的单一使用（IC5(]、ICJ外推组合形式中每一种药物的剂量需求来确 定加和性。加和性线以上或以下的数据点分别表示拮抗作用或协同作用。对于全部49个 组合，将组合中所需的药物浓度与达到相同效应的单独的单一药剂的浓度进行比较并表示 为倍数变化（剂量降低指数，DRI)。
[0105] 曲线位移分析
[0106] 为了允许剂量-响应曲线的直接比较以及鉴定协同药物-药物相互作用，将单独 或组合（IC50:IC50比值或其中所指示的其他比值）的每一种药物的非线性回归趋势线对 它自己的IC5。值进行归一化并称作1C5。等效值（1C5。等效）。该组合的1C5。等效值使用方 程式3进行计算，并描述于ZhaoL,AuJLWientjesMG(2010)Comparisonofmethodsfor evaluatingdrug-druginteraction.FrontBiosci(Elite编著）2:241-9 中。单一药剂和 组合的数据被绘制在同一幅图中以说明相对于单一药剂需要达到任何给定效果的较低的 药物浓度。这在剂量-响应曲线的左向位移中示出并指示协同作用。见上。
[0107] 统计分析
[0108]使用Excel(Microsoft)、CompuSyn和Graphpad软件进行统计分析。由三个重复 实验计算平均值和标准差。线性和非线性回归趋势线的拟合优度分别用R(CompuSyn)和 R2 (Graphpad)值来描述，并且由于限制药物不敏感性而对于除H226和Η印G2细胞外的大多 数细胞系为大于0.9。
[0109] 结果
[0110] miR_34a恢复了在非小细胞肺癌细胞中对埃罗替尼的敏感性
[0111] 为了研究具有获得性抗性的细胞中的抗药性，我们使用了表达激活EGFR突变（导 致氨基酸745-750缺失的外显子19的缺失）的HCC827细胞。HCC827对埃罗替尼高度敏感， IC5。值为0. 022μΜ(图4A)。通过在整个10周的过程中将亲代HCC827细胞暴露于增加的 埃罗替尼浓度直至培养物在相当于在亲代细胞系中的IC9。的浓度下不显示生长抑制的迹 象来发展埃罗替尼抗性细胞系（图4B)。在这个过程中，使单独的细胞克隆（HCC827ras-#5、 #6、#7)以及抗性细胞池（HCC827fes)进行繁殖。分离总RNA，并通过定量PCR探测其miR-34 家族成员和已知诱导抗性的基因的水平。埃罗替尼抗性HCC827细胞显示了MET及其推测 起到绕过EGFR信号传导作用的配体HGF的增加的mRNA水平（图8A-C)。相比之下，还与抗 性相关的其他基因如AXL、GAS6、KRAS、FGFR1、ERBB3、PIK3CA和EGFR本身的表达水平均未 提高。miR-34b/c家族成员的水平在若干抗性HCC827细胞中降低（图8A-C)。有趣的是， miR-34a在埃罗替尼抗性HCC827细胞中并未降低，表明miR-34a在这些细胞的抗性引发中 并没有起到因果作用，该抗性可通过MET基因的扩增独立于miR-34而发生。
[0112] 由于MET和AXL两者直接受miR-34抑制，并且由于对AXL的抑制可能拮抗埃罗替 尼抗性，因此引入合成的miR-34模拟物可以恢复埃罗替尼的敏感性。为了探索这种可能 性，在存在或不存在以固定的低浓度（0. 3nM)使用的miR-34a的情况下，将HCCS〗?1'，田胞暴 露于范围为0. 03-100μΜ的增加的埃罗替尼浓度。预期埃罗替尼的效果是浓度依赖性的， 使得与miR-34a组合的埃罗替尼产生了相对于单独埃罗替尼更低的IC5。值。如图4C所示， 埃罗替尼在HCC827ras细胞中并不是非常强力的（IC5Q= 25. 2μΜ)。然而，当与miR-34a联 合使用时，埃罗替尼IC5。值降低至0. 094μΜ。该结果表明，添加少量的miR-34a能够恢复 类似于