[0128] 3.每个孔加入100 μ L的测定稀释液RD 1W。
[0129] 4.每个孔加入100 μ L标准、样本或对照。用提供的粘合带覆盖。在室温下培养2 小时。提供板布局以记录测定的标准和样本。
[0130] 5.抽吸每个孔并清洗，重复该过程三次以达到四次清洗的总数。通过使用喷水瓶、 歧管分液器（manifold dispenser)、自动清洗机以清洗缓冲液（400 μ L)填充每个孔来清 洗。在每个步骤完全移除液体对于良好的性能是必不可少的。在最后一次清洗之后，通过 抽吸或倾倒来移除任何剩余的清洗缓冲液。倒置板并将其置于干净的纸巾上。
[0131] 6.每个孔加入200 μ L的IL-6缀合物（Conjugate)。用新的粘合带覆盖。在室温 下培养2小时。
[0132] 7.在步骤5中重复抽吸/清洗。
[0133] 8.每个孔加入200 μ L的基质溶液。在室温下培养20分钟。避光保存。
[0134] 9.每个孔加入50 μ L停止溶液（Stop Solution).孔中的色彩应当从蓝色变为换 色。如果孔中的色彩是绿色，或者色彩变化不统一，则轻拍板以确保彻底混合。
[0135] 10.在30分钟内确定每个孔的光密度，使用设置为450nm的微板读取仪。如果波 长修正可用，则设置为540nm或570nm。如果波长修正不可用，则从450nm处的读数减去 540nm或570nm处的读数。该减法将修正板中的光学缺陷（optical imperfections)。在 450nm处直接得出的、未修正的读数会更高，并且不太精确。
[0136] 以下内容为所获得的实验数据：
[0137] 通过控制抗-IL-1 β抗体的IL-6产生的抑制：
[0138] 1. MRC5细胞（第5代）以2χ 103细胞每孔、0· 4ml每孔被平板接种入48-孔板 (Costar, Cat#3548)上，且被培养24小时；
[0139] 2.在测定的那天，来自孔的培养基被抽吸并且用10% FBS补充的0. 4ml的DMEM 代替，培养10-15分钟并且再次用相同量的相同的新鲜的培养基来代替；
[0140] 3.整个实验使用了最终浓度为50pg/ml的IL-1 β ;
[0141] 4.使用了最终浓度为〇.192、〇.96、4.8、24、12〇和6〇〇即/1111的抗-人11^10抗 体；
[0142] 5. IL-1 β和抗-人IL-1 β抗体都被制备成10倍浓度的溶液；
[0143] 6.在将测试物质加入细胞之前，55 μ 1的10倍IL-1 β与55 μ 1的10倍相应的 抗-人IL-1 β抗体溶液混合（或适当的对照），并且在室温下培养30分钟；
[0144] 7.在培养之后，将每种混合物的100 μ 1加入含有0. 4ml生长培养基的孔中；
[0145] 8.在测试物质存在的情况下，细胞被培养24小时，并且上清液被收集，以300x g 离心分离10分钟并用于IL-6ELISA测定；
[0146] 9.为了检测在抗-IL-1 β抗体存在的情况下IL-6的复原，使用最终浓度为 600ng/ml的抗-IL-1 β抗体，并且加入IL-6标准以达到20pg/ml的最终浓度。
[0147] IL-6产生测定的IL-1抗体介导抑制中所获得的校正曲线在图7中示出。 IL-1 β -介导的IL-6产生和从实验中的培养基中复原的IL-6的测量结果在图8和图9中 示出。所获得的用于IL-6产生的数值连同它们的标准差在表5中给出。
[0148] 表5 :IL_6产生值的概要
[0149]
[0150] 前述实验揭示了 ：（1)对照抗-IL-1 β抗体是IC50值约为2. lng/ml或约为14pM 的IL-Ιβ信号传导路径的非常有力的抑制剂；（2) 2x 103个细胞每孔的平板细胞密度在测 定启动之前24小时是足够的；（3)以20pg/ml的最终浓度加入培养基中的IL-6的复原约 为 114%〇
[0151] 通过ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体制备物对IL-6产生的抑制：
[0152] 1.MRC5细胞（（第6代））以2x 103个细胞每孔、0. 4ml每孔被加入48-孔板 (Costar, Cat#3548)上，并培养 24 小时；
[0153] 2.将用于该实验的平板接种重复执行。每次平板接种复制都在ELISA板上的复制 中测量，导致每次处理具有4个实验点；
[0154] 3.在测定的那天，来自孔的培养基被抽吸并且用以10% FBS补充的的0.4ml的 DMEM代替，培养10-15分钟并且再次用相同量的相同的新鲜的培养基代替；
[0155] 4.整个实验使用了最终浓度为50pg/ml的IL-1 β ;
[0156] 5.使用 了最终浓度为 0· 0536、0· 134、0· 335、0· 839、2· 097、5· 24、13· 1、32· 8、 81. 9、204· 8、512、1280、3200 和 20000ng/ml 的 ILlR-FcV-RAcP-FcII 异源二聚体；
[0157] 6. IL-1 β和ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体都被制备成10倍浓度的溶液；
[0158] 7.在将测试物质加入细胞之前，120 μ 1的10倍IL-1 β /IL-1F2与120 μ 1的10 倍相应的ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体溶液混合（或适当的对照），并且在室温下培养 30分钟；
[0159] 8.在培养之后，将每种混合物的100 μ 1加入含有0. 4ml生长培养基的孔中；
[0160] 9.在测试物质存在的情况下，细胞被培养24小时，并且上清液被收集，以300x g 离心分离10分钟并用于IL-6ELISA测定。
[0161] IL-6产生测定的ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体介导抑制中所获得的校正曲线 在图10中示出。ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体-介导的IL-6产生和从实验中的培养基 中复原的IL-6的测量结果在图11和图12中示出。所获得的用于IL-6产生的数值连同它 们的标准差在表6中给出。
[0162] 表5 :IL_6产生值的概要
[0164] R_表示测定校正范围之外的值
[0165] 每个实验点都以复制形式被平板接种，并且IL-6产生以复制形式被进一步测量， 这导致每个浓度点具有4个实验读取。所获得数据证明了实验程序和测定的高复制性。前 述实验揭示了用于该实验的ILlR-FcV-RAcP-FcII heterodimer异源二聚体的IC50值约为 0· 3mg/ml 或约为 2· 4pM。
[0166] 实施例5:在小鼠皮下沣射ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体之后的药代动力学 (PK)
[0167] ILlR-FcV-RAcP-FcII 异源二聚体的多肽（SEQ ID NO. land SEQ ID N0. 2)如前文 实施例中所述被实质上共表达和纯化。为了注射到动物中，多肽配置到以下缓冲液中：1% W/V鹿糖、lOOrnM氯化钠、20mM左旋盐酸精氨酸（L-Arginine Hydrochloride)、25mM碳酸氢 钠 ，pH 6. 3。使用的配量物料浓度为0. 5mg/mL的多肽。
[0168] 在研究的第0天，基于体重将十四只雌性无胸腺裸鼠（Balb/c nu/nu)小鼠随机分 为七组，其中每组两只动物。在第0天多肽（5mg/kg)的单一处理被皮下注射（背部）到除 了第1组中的小鼠之外的所有组，第1组中的小鼠通过心脏穿刺被放血（bled)以用于第0 天的血浆制备。
[0169] 在处理日（第0天）为所有的动物记录了体重，然后每组每周三次，包括终止日。
[0170] 几组小鼠在特定时间点被挑选出来，以用于血浆制备。用于样本收集所挑选出来 的组的体重变化在〇小时和剂量注射的36小时之内不被测量。所有其他小鼠获得体重，并 且在研究周期过程中没有报告不利的临床症状。
[0171] 在研究的存活期（in-life phase)之后，血衆样本通过ELISA for Hu-Fc蛋白质 被分析。通过ELISA的小鼠血衆样本中定量的Hu-Fc被用作读出信息（read-out)，以用于 多肽的循环水平。测定在来自研究中的所有小鼠的样本上执行。
[0172] 在注射后1小时，多肽在动物的血浆中被检测到。接着使用一个具有Prism 5. 0c (美国加利福尼亚州的拉荷亚的GraphPad软件公司）的衰变模型方程，以确定如由 Hu-Fc ELISA检测的多肽的药代动力学。Hu-Fc(CmaX)的尖峰循环水平被确定为1.65yg/ mL，并且到达尖峰循环水平的时间（Tmax)是处理之后36小时。半衰期（T1/2)为88. 15小 时，并且速率常数（K)为0. 0079hr-l。Hu-Fc水平在未处理的第1组动物的血浆中可以忽 略。该研究的结果在表7中概述。
[0173] 表7 :注射后各时间的平均人-Fc蛋白质浓度土SEM( μ g/mL)
[0174]
[0175] *不能计算为Hu-Fc的水平的SEM低于用于组中的一个样本的ELISA的可检测出 的限度。
[0176] 人_Fc蛋白质浓度基于三重样本（triplicate samples)的平均吸收率通过Prism 软件来确定。
[0177] '通过眶窦放血
[0178] #通过终端心脏穿刺来放血
[0179] 实施例6:28天重复给药之后ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体在C57BL6小鼠中 的毒性的估算。
[0180] 在重复剂量之后，鼠毒性估算研究产生了概述。C57BL6小鼠用 TLlR-FcV-RAcP-FcII 异源二聚体的多肽（SEQ ID NO. land SEQ ID N0. 2)测试样品以 10、 30和lOOmg/kg的剂量水平进行每周两次的皮下注射的处理与毒性的发病率或临床症状无 关。对于体重，没有一致的性别或处理有关的影响。发现摄食量增加了，这被认为是处理的 可能影响，当时这并不被认为是不利的。
[0181] 尽管证明了涉及临床生物化学的参数的功能变化，但是这些并不被认为是毒理学 的标志，因为存在大多数这些参数可逆的证据，尽管在某些中不完全。缺少毒理动力学评估 时，不可能评价这些区别中的其中一些的表面不可逆性的标志。然而，没有区别于组织病理 学变化有关，或者被认为是不利的。该观察到的区别属于这种类型：典型可逆，并且可能可 逆性周期不足以证明这些。
[0182] 可以得出结论，在老鼠28天ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体给药研究的无明显 有害作用水平（N0AEL)由此被认为是100mg/kg。
[0183] 这里所提及的所有公开物和专利都以其全文以引用的方式结合于此，如同每篇单 独的公开物或专利都被具体且单独地表明以引用的方式结合于此。
[0184] 虽然已经描述了主题的特定实施例，上述说明书是说明性的且不是限制性的。对 于本领域技术人员来说，基于该说明书和下文的权利要求书，许多变化将是显而易见的。本 发明的整个范围应当通过权利要求书及其等同物的整个范围以及说明书及这些变化的内 容确定。
【主权项】
1. 一种能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物，其特征在于，所述蛋白质组合 物包含： 第一多肽，其包含 第一氨基酸序列，其包含人IL1-R1的18至333位氨基酸，以及 第二氨基酸序列，其包含人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第一突变体； 第二多肽，其包含 另一第一氨基酸序列，其包含人ILl-RAcP的21至358位氨基酸，以及 另一第二氨基酸序列，其包含人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第二突变体；并且 其中所述第一和第二突变体被筛选为利于所述第一与第二突变体之间的异源二聚体 组装，而不利于任何同源二聚体组装。2. 根据权利要求1所述的蛋白质组合物，其特征在于，所述蛋白质组合物显示出在酶 联免疫吸附法测定中的人IL-1β的结合活性，EC50约为50ng/ml。3. 根据权利要求1所述的蛋白质组合物，其特征在于，所述第一多肽包含SEQIDNO. 1 的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQIDNO. 2的氨基酸序列。4. 一种治疗组合物，其特征在于，该组合物包含能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白 质组合物，所述异源二聚体蛋白质组合物包含： 第一多肽，其包含 第一氨基酸序列，其包含人IL1-R1的18至333位氨基酸，以及 第二氨基酸序列，其包含人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第一突变体； 第二多肽，其包含 另一第一氨基酸序列，其包含人ILl-RAcP的21至358位氨基酸，以及 另一第二氨基酸序列，其包含人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第二突变体； 其中所述第一和第二突变体被筛选为利于所述第一与第二突变体之间的异源二聚体 组装，而不利于任何同源二聚体组装。5. 根据权利要求4所述的治疗组合物，其特征在于，在皮下给药5mg/kg的剂量之后，通 过人Fc酶联免疫吸附法的测定，小鼠的体循环中的所述异源二聚体蛋白质组合物的半衰 期为至少约88小时。6. -种治疗组合物，其特征在于，该组合物包含异源二聚体蛋白质组合物，所述异源二 聚体蛋白质组合物包含含有SEQIDNO. 1的氨基酸序列的第一多肽以及含有SEQIDNO. 2 的氨基酸序列的第二多肽。7. -种分离的核酸，其特征在于，其编码包含SEQIDNO. 3的氨基酸序列的多肽。8. -种分离的核酸，其特征在于，其编码包含SEQIDNO. 4的氨基酸序列的多肽。9. 根据权利要求7或8所述的核酸，其特征在于，密码子使用被优化为使所述多肽在哺 乳动物细胞中高效表达。10. 根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，核酸序列包含SEQIDNO. 5的序列。11. 根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，核酸序列包含SEQIDNO. 6的序列。12. 根据权利要求10或11所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含表达载体。13. -种分离的核酸，其特征在于，其是SEQIDNO. 7的分离的核酸。14. 一种异源表达系统，其特征在于，该表达系统具有表达载体，所述表达载体包含 编码第一多肽的核酸序列以及编码第二多肽的另一核酸序列，其中第一多肽包含SEQID NO. 3的氨基酸序列，第二多肽包含SEQIDNO. 4的氨基酸序列。15. 根据权利要求14所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体包含在哺乳动物细 胞中。16. 根据权利要求15所述的表达系统，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CH0细胞。17. 根据权利要求15所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统能够表达包含第一 多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质，其中第一多肽包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列，第二 多肽包含SEQIDNO. 2的氨基酸序列，并且其中所述异源二聚体蛋白质的表达水平为每升 细胞培养基中至少300mg。18. 用于制造治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病的药物的物质的用途， 其特征在于，所述物质包含含有第一多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质，其中第一多肽 包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列，第二多肽包含SEQIDNO. 2的氨基酸序列。19. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为关节炎。20. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为痛风。21. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎。22. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为冷吡啉相关周期性综合征 (CAPS)〇23. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为硬皮病。24. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为糖尿病。25. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为动脉硬化。26. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为干眼症。27. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为眼部过敏。28. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病为葡萄膜炎。29. -种用于治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病或状况的方法，其特征 在于，所述方法包含为需要治疗或预防与人IL-Ιβ的活性的调节有关的疾病的患者给药 治疗上有效量的药物组合物，所述药物组合物包含含有第一多肽和第二多肽的异源二聚体 蛋白质，其中第一多肽包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列，第二多肽包含SEQIDNO. 2的氨基 酸序列。30. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为关节炎。31. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为痛风。32. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎。33. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为冷吡啉相关周期性综合征 (CAPS)〇34. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为硬皮病。35. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为糖尿病。36. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为动脉硬化。37. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为干眼症。38. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为眼部过敏。39. 根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述疾病为葡萄膜炎。
【专利摘要】本发明描述了可用于治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病的治疗组合物。在某些方面，所公开的本发明基于能够结合至人IL-1β并削弱其功能的异源二聚体蛋白组装的设计。该异源二聚体蛋白组装包含人IL1-R1和人IL-1RAcP的细胞外部分或者它们的功能片段。分别地，IL1-R1部分和IL-1RAcP部分融合至人Ig？Gamma-1的Fc片段的不同突变体。异源二聚体蛋白质组装中的两个不同的Fc突变体被设计为利于在两个Fc突变体之间形成异源二聚体，而不是同源组装。本发明还提供了用于哺乳动物细胞中的多肽的过量产生的DNA表达载体和表达系统。
【IPC分类】C07K14/00, C07K19/00, A61P3/10, C12N15/09, A61P19/02, C12N15/117, C12N15/66, A61P9/06, A61K38/20, A61K38/16, C07K14/545
【公开号】CN105431448
【申请号】CN201380075648
【发明人】严·拉夫罗夫斯基, 许婷, 阿列克谢·雷皮克, 徐涛, 瓦西里·伊格纳提夫, 米哈伊尔·萨姆索诺夫
【申请人】R-Pharm股份公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2013年2月15日
【公告号】EP2956471A1, WO2014126582A1