因子VIII的抗原性的人氨基酸残基的取代的嵌合人/动 物因子VIII。尤其是，动物（例如，猪）残基取代可以包括，但不限于，以下一种或多种： R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、 P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、 1503M、L504M、P505A、G506A、E507G、1508M、1508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、K2227E 和/或L2251 (Lollar的第5859204号美国专利、Lollar的第6770744号美国专利和Lollar 的第2003/0166536号美国专利申请公开）。优选地，所述重组嵌合因子VIII包含如本文所 述的在位置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 L152 处的一个或多个 取代。
[0100] 在进一步的实施方式中，所述突变型因子VIII被修饰以凭借融合的A2和A3结构 域赋予活化的因子VIII更大的稳定性。特别是，因子VIII可以通过在位置664和1826处置 换半胱氨酸残基（即，Y664C、T1826C)导致形成共价连接A2和A3结构域的Cys664-Cysl826 二硫键的突变型因子 VIII 来修饰（Gale 等人，〃An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor Villa, 〃J. Thrombosis and Haemostasis 1 (9) : 1966-1971 (2003))。优选地，所述重组融合域（A2-A3)因子 VIII 包含 如本文所述的在位置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 L152 处的一 个或多个取代。
[0101] 在进一步的实施方式中，根据本发明的突变型因子VIII(例如，含有在位 置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个 取代）进一步被修饰以赋予改变的失活裂解位点。例如，Arg336或Arg562可被取代 用于降低突变型因子VIII的对通常使野生型因子VIII失活的裂解酶的易感性（参 见，例如，Amano 等人，''Mutation at Either Arg336 or Arg562 in Factor VIII is Insufficient for Complete Resistance to Activated Protein C(APC)-Mediated Inactivation:implications for the APC Resistance Test,''Thrombosis&Haemostasis 79(3) :557-63(1998)) 〇
[0102] 在进一步的实施方式中，根据本发明的突变型因子VIII(例如，含有在位 置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多 个取代）进一步被修饰以赋予对因子IXa(参见，例如，Fay等人，"Factor Villa A2 Subunit Residues 558-565 Represent a Factor IXa Interactive Site, 〃J. Biol.Chem.269(32):20522-7(1994) ;Bajaj 等人，"Factor IXa:Factor Villa Interaction. Helix 33〇-338of Factor IXa Interacts with Residues 558-565 and Spatially Adjacent Regions of the A2 Subunit of Factor Villa, ^J. Biol. Chem. 276 (19) :16302-9 (2001) ;and Lenting 等人，"The Sequence Glul811_Lysl818 of Human Blood Coagulation Factor VIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX，〃J. Biol. Chem. 271(4) :1935-40(1996))和 / 或因子 X(参见，例如，Lapan 等 人，''Localization of a Factor X Interactive Site in the A1 Subunit of Factor Villa, 〃J. Biol. Chem. 272:2082-88(1997))的增强的亲合力。
[0103] 在又一进一步的实施方式中，根据本发明的突变型因子VIII (例如，含有在位置 I86、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个取代）被 进一步修饰以进一步提高因子VIII的分泌（参见，例如，Swaroop等人，"Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding Site Enhances Secretion of Coagulation Factor VIII，"J. Biol. Chem. 272(39):24121-4(1997))〇
[0104] 在进一步的实施方式中，根据本发明的突变型因子VIII (例如，含有在位置186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个取代）进一 步修饰以赋予增加的循环半衰期。这可以通过各种方法来实现，所述方法包括，但不限于， 通过减少与硫酸乙酰肝素的相互作用（Sarafanov等人，"Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIII Catabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, "J. Biol. Chem. 276(15):11970-9(2001))和 /或低密度脂蛋白受体相关蛋白（"LRP"）（Saenko等人，〃Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor in Mediation of Factor VIII Catabolism, 〃J. Biol. Chem. 274(53) :37685-92(1999);和"The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, ^J. Biol. Chem. 274(34):23734-9(1999))。
[0105] 可以根据本发明修饰的合适的突变型因子VIII的第八个例子是由修饰成编码在 已知的现有的表位中的氨基酸以产生用于在天冬酰胺残基处糖基化的识别序列的核苷酸 序列来编码的修饰的因子VIII (参见，例如，Lollar的第6759216号美国专利）。此修饰能 够有效地逃避现有抑制性抗体的检测（低抗原性因子VIII)并减少出现抑制性抗体的可能 性（低免疫原性因子VIII)。在一个代表性的实施方式中，修饰的因子VIII被突变引入用 于N-连接糖基化的共有氨基酸序列，如N-X-S/T (见Lollar的第6759216号美国专利）。
[0106] 可以根据本发明修饰的合适的突变型因子VIII的第九个例子是作为具有各 种突变的促凝血活性的因子VIII的修饰的因子VIII (参见，例如，Kaufman等人的第 2004/0092442号美国专利申请公开）。该实施方式的一个例子涉及已被修饰成（i)使 von Willebrand因子结合位点缺失，（ii)在Arg740处加入突变，和（iii)在A2结构域 和A3结构域之间加入氨基酸序列间隔区（其中氨基酸间隔区是足够长的，使得在活化时 促凝血活性的因子VIII蛋白变为异源二聚体）的修饰的因子VIII (见Kaufman等人的第 2004/0092442号美国专利申请公开）。
[0107] 此外，所述突变型因子VIII可以被修饰成利用通常有关重组凝血因子的各种进 步（参见，例如，Saenko 等人，〃The Future of Recombinant Coagulation Factors, "J. Thrombosis and Haemostasis 1:922-930 (2003))〇
[0108] 本发明的重组因子 VIII 可以在位置 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、 H134、M147、L152处被修饰，以及可以被修饰成无 B结构域的、嵌合的、具有融合的A2-A3 结构域、具有改变的失活裂解位点、具有增强的因子IXa和/或因子X的亲合力、具有增强 的特异性活性、具有增加的循环半衰期、具有突变型糖基化位点、或除了在位置186、Y105、 A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的修饰之外还具备这样的修饰的 任何两个或更多个。
[0109] 本发明的另一个方面涉及制备相比于野生型因子VIII的特异性活性具有增加的 特异性活性的重组因子VIII的方法。此方法包括改变野生型因子VIII的氨基酸序列以 得到重组因子VIII。野生型因子VIII的氨基酸序列的改变可以包括，例如，在野生型因子 VIII的至少一个钙结合位点中或者在野生型因子VIII的至少一个钙结合位点附近引入至 少一个点突变。然后，利用本领域众所周知的蛋白质分析技术，能够确定重组因子VIII是 否相比于野生型因子VIII的特异性活性具有增加的特异性活性。
[0110] 重组因子VIII优选以基本上纯的形式产生。在一个具体的实施方式中，基本上纯 的重组因子VIII为至少约80%纯的，更优选至少90%纯的，最优选至少95%纯的，98%纯 的，99%纯的或99. 9%纯的。基本上纯的重组因子VIII可以通过本领域中公知的常规技术 获得。通常，基本上纯的重组因子VIII被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中。或者，基 本上纯的重组因子VIII被产生但不分泌到生长培养基中。在这样的情况下，为了分离基本 上纯的重组因子VIII，使携带重组质粒的宿主细胞增殖，通过超声处理、加热或化学处理裂 解，以及将匀浆离心以除去细胞碎片。然后对上清液进行连续的硫酸铵沉淀。使含有基本 上纯的重组因子VIII的级分在合适尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中进行凝胶过滤以分离 重组因子VIII。如果需要的话，蛋白质级分（含有基本上纯的重组因子VIII)可以进一步 用高效液相色谱（"HPLC"）进行纯化。
[0111] 本发明的另一个方面涉及一种分离的核酸分子，其编码如本文所述的重组突变型 因子VIII。所述编码重组突变型因子VIII的分离的核酸分子可以是RNA或DNA。核酸密 码子可被进一步优化以增强表达。
[0112] 在一个实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码用在本发明鉴定的位置 处的取代之一修饰的SEQ ID N0:2的氨基酸序列的核苷酸序列（即，在SEQ ID N0:1(前 57个核苷酸不计，因为它们编码信号肽）的86位密码子（nt256-258)、105位密码子 (nt:313-315)、108 位密码子（nt:322-324)、115 位密码子（nt:343-345)、117 位密码子 (nt: 349-351)、129 位密码子（nt: 385-387)、132 位密码子（nt: 394-396)、134 位密码子 (nt :400-402)、147 位密码子（nt :439-441)和 / 或密码子 152 (nt :454-456)中具有一至三 个核苷酸取代）。分离的核酸分子可以任何组合形式在这些位置中具有一个或多个电荷。
[0113] 在另一个实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码如用在位置186、Y105、 A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代修饰的如上所 述的类型的无 B结构域因子VIII的核苷酸序列。
[0114] 在另一个实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码如用在位置186、Y105、 A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代修饰的嵌合人 /猪的上述类型的核苷酸序列。
[0115] 在进一步的实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码如用在位置186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 处的一个或多个取代修饰的如 上所述的类型的融合的A2-A3结构域因子VIII的核苷酸序列。
[0116] 在另一个实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码如用在位置186、Y105、 A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代进一步修饰的 失活位点已被如上所述修饰的因子VIII的核苷酸序列。
[0117] 在又一个实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码连同在位置186、Y105、 A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代一起的对因子 IXa和/或因子X的亲合力已被增强的因子VIII的核苷酸序列。
[0118] 在更进一步的实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码对各种血清结合蛋 白的亲合力已被改变以增加其循环半衰期且用在位置186、Y105、A108、D115、Q117、F129、 G132、H134、M147和/或L152处的一个或多个取代进一步修饰的因子VIII的核苷酸序列。
[0119] 在进一步的实施方式中，所述分离的核酸分子可以具有编码如用在位置186、 Y