，其是 指从任何保留的痕量杂质或紧密相关的物质中纯化的C因子。
[0136] 在多种实施方式中，由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少 75%或至少80%的纯度，即，C因子组成总蛋白的至少75%或至少80%。在多种实施方式 中，由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少85%或至少90%的纯度，即， C因子组成总蛋白的至少85%或至少90%。在多种实施方式中，由本发明提供的或由本 发明的方法制备的C因子具有至少95%或至少96%的纯度，即，C因子组成总蛋白的至少 95%或至少96%。在多种实施方式中，由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具 有至少97 %或至少98 %的纯度，即，C因子组成总蛋白的至少97 %或至少98%。在多种实 施方式中，由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少99%或甚至100%的 纯度，即，C因子组成总蛋白的至少99%或甚至100%。
[0137] 抗体
[0138] 本发明也提供与由本发明提供的或从本发明的方法获得的C因子蛋白或其片段 特异结合的抗体或其片段。优选地，所述抗体与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:4的氨基 酸序列的全长C因子特异结合。
[0139] 在多种实施方式中，本发明的抗体选自由单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、Fab 片段、F(ab'） 2片段以及scFV片段组成的组。在多种实施方式中，根据本发明的所述抗体 是被标记的。优选地，所述标记选自由酶标记、放射性同位素、荧光标记和生物素组成的组。 本发明的C因子蛋白可以用于引起由本发明提供的多克隆或单克隆抗体。本发明的所述抗 体可以通过本领域可获得的以及本领域普通技术人员已知的各种方法中的任意一种进行 制备。
[0140] 由本发明提供的抗体片段（无论是否与其它序列连结）也可以包括具体区域或特 定氨基酸残基的插入、删除、替换或其它选择的修饰，条件是与非修饰的抗体或抗体片段相 比，所述抗体片段的活性没有显著的改变或减弱。这些修饰可以提供一些另外的性质，比如 去除/添加能够二硫键合的氨基酸。不管怎样，根据本发明的抗体片段必须具有生物活性 性质，比如与其同源的抗原特异结合。
[0141] 本发明的抗体或抗体片段的功能或活性区域可以通过对蛋白的特定区域进行突 变、随后表达并对所表达的多肽进行测试而确定。这种方法对于本领域的技术从业者来说 是十分明显的并且可以包括编码抗体或抗体片段的核酸的定点突变。
[0142] 组合物和溶液
[0143] 本发明提供含有根据本发明的方法制备的重组C因子蛋白的组合物。本发明也提 供含有本发明的多聚核苷酸或核酸分子的组合物。本发明也提供含有本发明的载体或质粒 的组合物。本发明进一步提供含有根据本发明的寄生原生动物宿主细胞的组合物。本发明 进一步提供含有根据本发明的融合蛋白或嵌合蛋白的组合物。
[0144] 在多种实施方式中，根据本发明的组合物是诊断组合物。
[0145] 在多种实施方式中，根据本发明的组合物是用于检测内毒素的组合物，优选为用 于检测样品中的内毒素的组合物。在多种实施方式中，所述样品为环境样品。在多种实施 方式中，所述样品为生物样品。在多种实施方式中，所述样品为测试样品，优选为生物或环 境测试样品。优选地，所述生物样品或生物测试样品是从哺乳动物获得的生物样品或生物 测试样品。优选地，所述哺乳动物为人类。本发明的范围包括样品中的内毒素的检测，所述 样品从动物（包括但不限于：狗、猫、猪、马、鸟和爬行动物）获得。
[0146] 本发明提供含有本发明的重组C因子蛋白的溶液，优选为诊断性溶液。本发明也 提供含有根据本发明的方法制备的重组C因子的用于清除内毒素的溶液。
[0147] 在多种实施方式中，由根据本发明的方法制备的或从本发明的方法获得的C因子 可以被指定为用于测量/检测内毒素的试剂（内毒素-测量/检测试剂）。在多种实施方 式中，由根据本发明的方法制备的或从本发明的方法获得的C因子可以被指定为用于清除 内毒素的试剂（内毒素-清除试剂）。
[0148] 除了由本发明的方法制备的重组C因子，含有本发明的C因子的本发明的组合物 和溶液可以进一步含有一种组分。具体地，所述试剂可以进一步含有用于检测的C因子底 物，只要所述试剂可以用于内毒素的测量/检测。
[0149] 本发明的含有C因子的组合物和溶液也可以含有，比如，pH缓冲剂和/或盐，优选 螯合盐。pH缓冲剂的例子包括但不限于：HEPES缓冲液、MES缓冲液以及Tris缓冲液。有 机溶剂（比如酒精、酯类、酮类以及酰胺类）也可以包含在本发明的组合物和溶液中。
[0150] 本发明的内毒素-测量/检测试剂和/或内毒素-清除试剂可以被配制成任何随 意的形式规定，该随意的形式包括但不限于：固体形式、液体形式以及凝胶形式。添加剂可 以用作配方载体，其包括但不限于：赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、调节剂和稀释 液以及溶剂。
[0151] 在多种实施方式中，含有本发明的重组C因子的本发明的组合物和溶液可以进一 步含有表面活性剂。因此，本发明提供用于检测内毒素的试剂，所述试剂含有根据本发明的 方法制备的或从本发明的方法获得的鲎C因子蛋白的以及表面活性剂。在多种实施方式 中，所述表面活性剂为两性表面活性剂。在多种其它实施方式中，所述表面活性剂为阳离子 型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。在多种其它实施方式中，所述表面活性剂为非离子 型表面活性剂。优选地，所述表面活性剂选自由ZWITTERGENT 3-14、Triton X-100、Triton X-114、辛基-0-D-硫代葡萄糖苷、Genapol C-100、吐温20以及吐温80组成的组。优选 地，所述表面活性剂在本发明的组合物或溶液中的浓度为〇. 001至〇. 5%，更优选为0. 001 至0. 025%的浓度，更优选为0. 001至0. 01 %的浓度。在多种实施方式中，所述表面活性剂 在本发明的组合物或溶液中的浓度为〇. 004至0. 006%。
[0152] 本发明的C因子蛋白可以以其原样用于测量/检测内毒素，或在被稀释、分散或溶 解在水、生理盐水、缓冲液或类似物中后被使用。"以其原样的C因子蛋白"包括从本发明的 方法直接获得的任何形式的C因子蛋白，包括从本发明的方法获得的分离的、浓缩的和/或 纯化的C因子。本发明的范围也包括通过层析的方式纯化后获得的"以其原样的C因子蛋 白"。这种实施方式也在本发明的范围内。
[0153] 内毒素检测方法
[0154] 由本发明提供的重组C因子形成用于内毒素的高通量筛选的内毒素诊断分析的 基础。内毒素激活的重组C因子酶原催化地水解合成的底物以形成可测量的产物，因此定 量内毒素。
[0155] 本发明提供通过根据本发明制备C因子的方法制备的C因子蛋白在用于内毒素检 测的方法中的用途。在多种实施方式中，本发明的C因子用于内毒素检测的方法中，所述方 法包括将待检测内毒素（LPS)或脂质A的存在的样品（优选为测试样品）与根据本发明的 重组C因子接触，并测量重组C因子的酶活性（即，丝氨酸蛋白酶活性）。所述重组C因子 的酶活性反映了其活性，由于其结合内毒素或脂质A，或结合本领域已知的另一种与鲎的C 因子结合的内毒素。C因子酶活性（特别是丝氨酸蛋白酶活性）通过本领域已知的任何已 知方法方便地测得，但优选地是通过发色或荧光的方法测量。这样的方法包括测量产物的 形成，该产物由重组C因子的蛋白酶活性分裂C因子底物而引起。所述测量是以由底物的 分裂引起的颜色（在发色底物的情况下）或荧光发射（在荧光底物的情况下）的变化为基 础的。本发明的范围包括发色和荧光C因子底物的应用，所述发色和荧光C因子底物包括 但不限于，发色的肽基对硝基苯胺底物和荧光的肽基-AMC、肽基-AFC以及肽基-MCA底物。 用于这种发色或荧光分析的优选底物为N-t-Boc-VPR-MCA、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC 以及 Boc-VPR-pNA。
[0156] 本发明进一步的实施方式包括用于分析样品（优选为测试样品）中内毒素或脂 质A存在的免疫方法。本发明的这些方法是以抗体与重组C因子特异结合、随后进行C因 子-抗体复合体的检测和/或量化为基础的。在一种优选的实施方式中，待测样品同与内 毒素或脂质A特异结合的被固定的抗体接触。被固定的配体（即，被固定的内毒素或脂质 A)然后与根据本发明的重组C因子接触，形成被固定的重组C因子（rFC)。所述被固定的 rFC然后同与被固定的rFC特异结合的第二抗体接触。然后可以用本领域已知的任何技术 测定含有与第二抗体结合的rFC的被固定的复合体的存在和/或量，比如，通过应用如经由 抗体的Fc部分与第二抗体特异结合的第三抗体。在一种可选的实施方式中，被固定的rFC 的酶活性不是采用第二抗体测量的。
[0157] 在本发明的另一种实施方式中，内毒素或脂质A与本发明的rFC的特异结合是应 用于商业可得的分析中，比如，BIACORE?分析（Pharmacia生物技术）。通过将rFC固定在 这种仪器的底物板上，可以检测样品中内毒素或脂质A的存在。本领域普通技术人员能够 优化对于样品中内毒素的指定载量的待固定的rFC的量。
[0158] 在多种实施方式中，根据本发明的检测内毒素的方法在测试样品上进行，所述测 试样品优选为从哺乳动物获得的测试样品。优选地，所述哺乳动物为人类。本发明的范围 也包括测试样品中内毒素的检测，所述测试样品从动物（包括但不限于：狗、猫、猪、马、鸟 和爬行动物）获得。
[0159] 在多种实施方式中，本发明的用于内毒素检测的方法包括内毒素选择性的、预包 被的固体负载的使用。具体地，内毒素（LPS)的选择性捕捉用噬菌体来源的受体蛋白实现， 所述噬菌体来源的受体蛋白针对于LPS的内核部分（即，内核低聚糖）或LPS的脂质A部 分。LPS的内核结构，连同脂质A部分，是高度保守的结构。外核结构有稍微变化，并且0-抗 原是高度异源的。优选地，将在本发明中使用的噬菌体来源的受体蛋白对于内毒素的保守 区域呈现出高亲和性和高特异性。被所述噬菌体来源的受体蛋白结合的内毒素的高度保守 区域既包括核心区域也包括脂质A。因此，所述噬菌体来源的受体蛋白与内核区域（即，内 核低聚糖）和/或脂质A结合。在多种实施方式中，所述噬菌体来源的受体蛋白为噬菌体尾 蛋白、有尾噬菌体的噬菌体头蛋白或无尾噬菌体的噬菌体外壳蛋白。优选地，所述噬菌体来 源的受体蛋白为噬菌体尾蛋白。优选地，所述噬菌体尾蛋白为短的噬菌体尾纤维的蛋白。在 多种实施方式中，所述短的噬菌体尾纤维选自K3、T2、T4、0x2、RB32-33、ARl、PP01和RB69。 在多种实施方式中，所述噬菌体尾蛋白被修饰以用于根据本发明的内毒素的检测。在多种 实施方式中，所述噬菌体尾蛋白可以连接到活性蛋白上。
[0160] 在样品内毒素（LPS)结合到用所述噬菌体来源的受体蛋白预包被的固体支撑物 后，将原始样品基质洗掉，由此除掉可能干扰检测反应的组分。接着，在包括C因子和C因 子底物的反应过程中通过本发明的C因子检测内毒素。在多种实施方式中，所述底物为发 色或荧光底物。
[0161] 在多种实施方式中，用噬菌体来源的受体蛋白预包被的固体支撑物为微量滴定 板、珠子（比如，硅珠或有机聚合物珠）、箔或膜。因此，本发明的用于内毒素检测的包括内 毒素选择性的、预包被的固体支撑物的使用的方法包括三个步骤：第一个步骤包括将样品 内毒素（即，样品中含有的内毒素）与固体支撑物结合，所述固体支撑物用对LPS的保守核 心区域呈现出高亲和性和高特异性的噬菌体来源的受体蛋白预包被。所述第一个步骤提供 样品内毒素的固定。第二个步骤是用于洗去原始样品基质的清洗步骤。第三个步骤包括用 本发明的C因子蛋白检测被固定的内毒素。所述第三个步骤包括C因子与针对C因子的底 物的反应，其形成可检测的信号。在多种实施方式中，在被固定的内毒素已经与C因子蛋白 接触后加入所述C因子的底物。在多种实施方式中，在C因子蛋白加入之前所述C因子底 物已经存在于分析中。这个三步骤分析形式的特异的技术效果是其具有从0. 〇5EU/ml上至 500EU/ml的检测范围。进一步地，对于已建立的异源检测方法，该分析形式呈现出明显的优 势，包括：较少的由比如葡聚糖、蛋白酶或磷脂引起的假阳性结果，较少的由样品的抑 制性成分引起的假阴性结果，较少的需要重新测试的无效结果，复杂样品中的较少干扰以 及因此的较高的灵敏性和宽的动态范围。
[0162] 由本发明提供的三步骤分析形式在人体的流体（比如，血液、血清和血浆）的内毒 素的检测中特别有用。优选地，上面描述的三步骤分析是用于分析临床生物样品。该分析 不直接应用在病人上，而是应用在从病人获得的测试样品上。
[0163] 在多种实施方式中，本发明提供检测样品中内毒素的方法，包括步骤（i)将待分 析样品与本发明的内毒素检测试剂接触以形成测试样品和内毒素检测试剂的混合物；（ii) 向所述混合物中加入C因子底物，其中C因子底物的分裂产生可检测的信号；以及（iii)分 析所述混合物中可检测信号的有或无，其中相对于不含有内毒素的对照样品增加的可检测 信号的量表明测试样品中内毒素的存在。
[0164] 在由本发明提供的内毒素分析中，C因子底物优选为发色或荧光C因子底物。在 多种实施方式中，所述C因子底物为发色的肽基对硝基苯胺底物。在多种其它实施方式中， 所述C因子底物为荧光的肽基-AMC、肽基-AFC或肽基-MCA底物。进一步示例性的C因子 底物包括但不限于：N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC 以及 Boc-VPR-pNA。
[0165] 在多种实施方式中，本发明提供检测样品中内毒素的方法，包括步骤（i)将待分 析样品与本发明的内毒素检测试剂以及C因子底物接触以形成测试样品、内毒素检测试剂 和C因子底物的混合物，其中C因子底物的分裂产生可检测的信号，和（ii)分析所述混合 物中可检测信号的有或无，其中相对于不含有内毒素的对照样品增加的可检测信号的量表 明测试样品中内毒素的存在。
[0166] 本发明也提供内毒素的分析，其包括：（i)将待分析的样品同与内毒素（LPS)或脂 质A特异结合的被固定的抗体接触以形成所述抗体和所述样品中内毒素间的复合体；（ii) 将所述复合体与由本发明的方法制备的重组C因子接触以形成含有所述抗体、内毒素和重 组C因子的被固定的复合体，（iii)将（ii)的所述被固定的复合体同与所述重组C因子特 异结合的抗体接触，以及（iv)测定与所述重组C因子特异结合的所述抗体的量。
[0167] 在本发明中，像"内毒素的检测方法"或"检测内毒素的方法"的术语可以与术语 "内毒素分析"交替地使用。
[0168] 清除内毒素的方法
[0169] 本发明提供由根据本发明的方法制备的C因子蛋白在清除内毒素的方法中的用 途。本发明的C因子在这些方法中的用途包括但不限于，从水、缓冲液以及细胞培养基中清 除内毒素。关于本发明的C因子在清除内毒素的方法中的用途的多种其它实施方式包括但 不限于：从生物和非生物制品中清除内毒素，优选从生物制品中清除内毒素，更优选从用于 动物研宄、细胞培养、移植、干细胞技术、细胞分选以及其它哺乳动物细胞治疗的生物制品 中清除内毒素。关于本发明的C因子在清除内毒素的方法中的应用的多种进一步的实施方 式包括但不限于，从医疗设备、医疗器械、化妆品、食物和饮料中清除内毒素。
[0170] 本发明的C因子可以用于制备无内毒素的制品，特别是无内毒素的生物和非生物 制品。本发明提供C因子在用于从（如，蛋白、抗体、疫苗、核酸、缓冲液和/或多种其它物 质的）生物制品中清除内毒素（LPS)的方法中的用途。优选地，根据本发明的生物制品是 液体生物制品，更优选为水性生物制品。液体或水性生物制品可以被认为是液体或水性生 物溶液，或是液体或水性生物组合物。
[0171] 在本发明的多种实施方式中，术语"生物制品"、"生物溶液"和"生物组合物"可以 交替地使用。
[0172] 在多种实施方式中，根据本发明的清除内毒素的方法包括固定到固体支撑物的本 发明的C因子的用途。优选地，所述固体支撑物为层析树脂。根据本发明的清除内毒素的 方法可以应用在通过重力流的柱或批量模式中，或应用在全自动液体层析系统上。
[0173] 当考虑到用于制药用途的生物产品必须毫不含有内毒素以能够施用于人的事实 时，从生物制品清除内毒素是特别重要的。因此，本发明提供本发明的C因子在制备不含内 毒素的制品（特别是用于制药用途的不含内毒素的制品）的方法中的用途。含有用于制药 用途的生物产品的制品可以直接产生于制药过程，即，所述制品为制药过程制品。因此，在 多种实施方式中，本发明提供用于从制药过程制品中清除内毒素的方法，其包括用本发明 的重组C因子处理制药过程制品。这样的制药过程制品可以含有药物或疫苗物质。在多种 实施方式中，所述药物或疫苗物质包括多肽，优选为糖蛋白。在多种实施方式中，所述药物 或疫苗物质为疫苗抗原。
[0174] 优选地，根据本发明的制药过程制品为液体制药过程制品，更优选为水性制药过 程制品。在本发明的多种实施方式中，术语"制药过程制品"和"制药过程组合物"可以交 替地使用。
[0175] 本发明的范围也包括在任何种类的样品上实施根据本发明的用于清除内毒素的 方法。具体地，本发明提供用于从样品中清除内毒素或脂质A的方法，其包括：（i)将被固 定的从本发明的方法制备的或获得的重组C因子与所述样品接触，使得所述样品中的内毒 素或脂质A与所述被固定的重组C因子结合，和（ii)从所述样品分离与所述内毒素或脂质 A结合的所述被固定的重组C因子。
[0176] 样品
[0177] 在包括内毒素的定量测量的应用中，可以使用具有已知浓度的内毒素标准样品以 产生与内毒素水平和用于检测的底物的反应程度（比如，着色程度、荧光发射等等）相关的 数据。在所获得的相关数据的基础上，这能够定量在根据本发明的待测样品中的内毒素。
[0178] 根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品没有特别限制，所述样品的例 子包括水样品、缓冲液样品以及来自细胞培养基的样品。在多种实施方式中，所述样品为测 试样品。在多种实施方式中，所述样品为在本文其它地方描述的生物制品的测试样品。在多 种实施方式中，所述样品包括但不限于：来自在本文其它地方描述的医疗设备、医疗器械、 化妆品、食物和饮料的测试样品。
[0179] 在多种实施方式中，根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品为从哺乳 动物获得的测试样品。优选地，所述从哺乳动物获得的测试样品包括但不限于：血液样品、 血清样品或唾液样品。优选地，所述哺乳动物为人。在多种实施方式中，所述测试样品因此 为人的血液样品、人的血清样品或人的唾液样品，优选为人的血液样品。
[0180] 在多种实施方式中，进行内毒素的检测和/或清除的测试样品包括但不限于，从 下面任何获得的测试样品：医疗用水、药物、输液剂、血液制品。优选地，所述血液制品从哺 乳动物获得，更优选地，从人获得。在多种实施方式中，所述测试样品为环境样品。
[0181] 在多种实施方式中，根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品包括但不 限于：来自比如蛋白、抗体、疫苗、核酸、缓冲液和/或多种其它物质的生物制品的样品。在 多种其它实施方式中，根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品包括但不限于： 来自在本文其它地方描述的制药过程制品来的样品。
[0182] 分析和试剂盒
[0183] 如在上文所描述的，像"内毒素的检测方法"或"检测内毒素的方法"的术语可以 与术语"内毒素分析"交替地使用。因此，本发明提供一种根据在本文其它地方描述的用于 内毒素的检测的方法的用于内毒素的分析，其包括由本发明的方法制备的重组C因子的应 用。基本上，根据本发明的用于内毒素的分析包括如根据本发明的用于内毒素的检测方法 一样的方法步骤。
[0184] 进一步地，本发明提供内毒素的检测的试剂盒，其包括本发明的重组C因子，即， 由根据本发明的方法制备的C因子。优选地，所述试剂盒进一步包括用于本发明的内毒素 检测的方法或内毒素的分析的操作指南。优选地，所述操作指南为以手册的形式