Nprcp、pfdnc和它们的应用
【专利说明】
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年2月13日提交的美国临时申请号US 61/598, 069的优先权， 将其全部内容通过引用结合在此。
技术领域
[0003] 本发明的实施方式涉及高度再生的哺乳动物颗粒组合物和它们的组装产品。
【背景技术】
[0004] 对于再生药物研宄中的核心挑战是开发其可以有助于重构受损的组织和器官的 细胞组合物。用于使受损的组织再生或修复的方法可以用于解决特征在于特定的细胞类型 或具有多种细胞类型的组织缺失或缺陷的多种疾病、病症和损伤。这类细胞缺失可以与创 伤、缺血性损伤、代谢性疾病、或退行性病症相关。通常使用器官移植来替换受损或患病的 组织。遗憾的是供体器官来源有限。即使当有可用的供体器官时，还会发生排斥移植的生 物材料。用于细胞治疗的干细胞也诱导排斥，并且因此必须检测来自供体和受体的血液用 于组织配型。
【发明内容】
[0005] 提供该
【发明内容】
来呈现本发明的概述以简要地指出本发明的本质和性质。提交该
【发明内容】
应理解，其将不会用于解释或限制权利要求的范围或含义。
[0006] 本发明的实施方式特别地涉及哺乳动物非血小板包含RNA的颗粒（哺乳动 物包含 RNA 的非血小板颗粒，mammalian non-platelet RNA-containing particles， NPRCP)的分离、培养和应用，以及由NPRCP组装的颗粒融合物衍生的无核细胞 (particle-fusion-derived non-nucleated cells， PFDNC)(ATCC 专利保藏名称： PTA-13396)。
[0007] NPRCP包含小RNA(smallRNA)和蛋白质并且具有约0. 1ym至约10ym的直径，并 且由薄膜包围。NPRCP是包含蛋白质、小RNA和微小RNA(microRNA)的小囊泡，并且从小于 约1 ym生长最高达约7 ym。通过从薄膜外摄入营养和颗粒，尺寸可能增加。
[0008] 在优选的实施方式中，识别出至少5种类型的不同的NPRCP(图2-6)。它们被列 出为：1)包含大的核心样颗粒（微粒、粒体、粒质，granulose)类型的颗粒（particle)(图 2)。这个类型的颗粒包含大的核颗粒（nuclear granule)(箭头）。这些核颗粒具有致密的 核样结构并且尺寸不同（〇. 1 - 〇. 5 ym)。该类型NPRCP的尺寸范围为2 ym至5 ym。2)松 散膜类型。这个类型的颗粒在外部具有极薄的膜并且在膜内包含分散的致密核颗粒。它们 在内部还具有分层的结构。由于膜结构的柔韧性，它们的形状可以是非常不同的。3)固体 颗粒类型。这个类型的颗粒不具有松散膜。它们包含小的颗粒、致密的核物质和低致密区 域。它们是圆形。大部分的核颗粒定位于颗粒的一边（见4-5 ym)或在膜下。4)致密物质 类型。这个类型的颗粒包含均匀分布于该成分中的致密物质。在膜下面可以看见一些核颗 粒。此外，它们的膜是厚的并且具有不规则突起。5)均匀并且非致密类型。这个类型的颗 粒包含均匀分布于该成分中的小的核颗粒和纤维样结构。这些颗粒是具有薄膜的圆形。 [0009] 在优选的实施方式中，除了小RNA和微小RNA外（图7)，NPRCP表达包含⑶29 (整 联蛋白M)、CXCR4、c-kit、⑶45、⑶34、肌动蛋白或它们的组合（图8A-图8D至图10)的 表面标志物。在它们的成分中，它们还包含DDX4/VASA、Oct4、 S〇x-2和微管蛋白（图8A-图 8D) 〇
[0010] 在另一优选的实施方式中，少于5%的分离NPRCP在表面表达E-钙粘蛋白。
[0011] 在实施方式中，从较大尺寸的表达0ct4的无核前细胞（pre-cell)释放NPRCP (图 13、图15、图16)，然而，这些前细胞可以分化为有核（nucleated)细胞，其依赖于它们的分 化阶段（图15左，图17)。识别出至少两种不同的释放NPRCP(NPRCP-relea Sing)的前干细 胞（图13)。这些前干细胞不具有不同的细胞质成分，并且也不具有不同的细胞核。它们可 以释放几百个小尺寸的NPRCP，其在细胞外环境中通过采集循环的微小RNA、小RNA和蛋白 质可以进一步变得更大。这些释放NPRCP的前干细胞，在培养的条件下，其特征在于由不同 尺寸的大量NPRCP围绕的小的细胞结构（图17)。然而，在血液中，释放NPRCP的前细胞被 表征为不具有细胞核的纺锤形或圆形细胞结构（图13中的箭头）。
[0012] 在实施方式中，NPRCP包括至少3种不同的形状：纺锤形、圆形和短杆形（图14)。
[0013] 在其他实施方式中，依赖于融合的NPRCP的数量（图31A、31B)，NPRCP融合在一起 并成为具有尺寸为从约7 y m至约15 y m的细胞结构（图19-图20)。在其他地方从未描述 过这些细胞结构，并且因此，这些结构被称为"颗粒融合物衍生的无核细胞"(PFDNC)。PFDNC 表现出阿米巴样运动（图21A-图21F)。PFDNC表达0ct4、SOX2,整联蛋白M、微管蛋白、 肌动蛋白和DDX4(图22)。PFDNC可以扭动其主体（body)并且使用松散薄膜以捕获大的或 小的颗粒以增加其主体尺寸。此外，PFDNC挤压自身以进入真核细胞去采集用于谱系发展 的遗传物质（图27)。
[0014] 在其他实施方式中，PFDNC不具有细胞质膜和细胞核。PFDNC衍生自由NPRCP采集 的细胞质物质。2个前细胞结构的电子显微镜图，每个约5 ym(A)和8 ym(B)，在中央具有 NPRCP (箭头），其证明PFDNC的核心是衍生自NPRCP (图23A，图23B)。
[0015] 在其他实施方式中，可以由一些大的细胞结构释放PFDNC，细胞结构从多个NPRCP 融合，并且表达0ct4、sox2和微管蛋白（图32,图33A-图33C)。
[0016] 在实施方式中，从真核细胞采集物质后（图23A，图23B)，PFDNC的尺寸增加至为 约10 ym至约20 ym的直径并且成为更加分化的PFDNC (图21G-图211)。这些更加分化 的PFDNC随后彼此融合并且获得细胞质膜，其可以来自受损的细胞（图28)、循环膜囊泡的 融合物或其他分化的PFDNC ;它们转化为间充质样（mesenchymal-like)前细胞（图28-图 30)。细胞的遗传物质即PFDNC挤入并且采集的物质，决定了 PFDNC转化的细胞的谱系类型 (图23A，图23B)。PFDNC衍生的新细胞是瞬时表达0ct4的干细胞（图26)。
[0017] 不希望受理论的束缚，NPRCP和PFDNC的细胞形成是通过至少三种方式。一种是 直接的转分化（transdifferentiation)，即通过PFDNC转化为有核细胞（图25-图26)，由 间质（interstitial)细胞、内皮细胞和其他细胞代表。另一种方式是通过融合-分化，由 数个或由数百个NPRCP融合进入大的补丁样结构（图31A，图31B，图33A-图33C)其经历 核编程（nuclear programming)并成为组织，由肾导管、胰岛|3细胞和腺泡（acina)导管、 肠隐窝、神经元、平滑肌纤维、心肌纤维和其他代表。第三种方法是通过NPRCP或PFDNC与 有核细胞融合并且释放〇ct4、sox2、DDX4和其他蛋白质和RNA以诱导这些有核细胞成为干 细胞或健康的细胞（图92)。
[0018] 在其他实施方式中，在急性缺血条件下，例如在大的组织损伤情况下，多个NPRCP 还可以融合为大的补丁样结构，其进一步经历核编程并分化为具有多个细胞的大的结构， 如肾导管（图42A-图42J，图43A-图43B，图44A-图44F)、神经元（图57-图60)、心脏成 肌细胞（cardiac myoblast)(图77-图79)、毛囊（图69-图70)和其他。
[0019] 在毒性化学诱导的细胞损伤中，即，细胞损伤不限制于某些区域中，分散的NPRCP 可以迀移至损伤的细胞并且与这些细胞融合。NPRCP改变其形状成为具有长尾的短杆（图 92)，其可以释放oct4、sox2、DDX4和其他未识别的蛋白质。通过作用于下游蛋白以重编程 (reprogramming)毒性细胞或应激细胞，释放的sox2、DDX4可以诱导毒性或应激细胞成为 健康细胞或干细胞。不希望受到理论的束缚，认为NPRCP的功能是通过NPRCP自然释放的 RNA和蛋白质而不是通过基因转染。
[0020] 在实施方式中，NPRCP和PFDNC使缺血性损伤的肾脏再生（图39A-图39G，图 40-图50)。NPRCP通过循环迀移至缺血性损伤的肾脏。NPRCP可以渗出至受损的区域并且 使间质细胞、肾小球和肾导管再生。NPRCP可以融合并直接转分化为间质细胞。它们可以在 肾小球中形成新的内皮细胞。多个NPRCP聚集并且融合成为大的团块，其进一步分化为具 有多个细胞的肾导管。
[0021] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使缺血性损伤的大脑神经元再生（图51-图 65)。NPRCP通过循环迀移至缺血性损伤的大脑（图51-图52)。在大脑中，多个NPRCP外 渗并且聚集（图53-图54)。在移植后的第7天，聚集的NPRCP开始伸出树突。同时，点状 的巢蛋白已经连接在一起并且形成纤维样结构（图55-图59)。除了形成树突外，NPRCP还 聚集以形成轴突。然而，轴突形成看上去较缓慢并且还以不同的模式。移植后的第12天， 识别出被一层有核细胞包围的聚集的NPRCP (图60-图61)。进一步，聚集的NPRCP融合进 入细胞结构（图62)。NPRCP移植10后周表现出轴突形成。图像显示在NPRCP移植后10 周，GFP和巢蛋白在轴突样结构中共表达（图64-图65)。该数据表明NPRCP可以使轴突再 生，然而，是以更缓慢的过程。
[0022] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使受伤的皮肤再生（图66-72)。NPRCP形成为 已经迀移至创伤的毛球。包裹在透明层中的毛球状无核细胞被包埋于创伤边缘的血浆中， 说明这些毛球是渗出的（图66-图67)。NPRCP使表皮层再生。NPRCP出现在表皮层中，不 仅在基底层并且还在表面层（图68)。NPRCP使毛囊（图69-图70)和皮肤结缔组织或真 皮（图71-图72)再生。
[0023] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使平滑肌再生（图73-图74)。
[0024] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使缺血性损伤的心脏再生（图75-图80)。在 移植后2周，静脉注射的NPRCP以聚集的形式或在血管内出现在缺血性损伤的心脏中（图 75-图76)。聚集的NPRCP融合为成心肌细胞（cardioblast)，其还表达平滑肌肌动蛋白（干 细胞标志物）。平滑肌肌动蛋白染色为颗粒状，而不是纤维样，表明纤维样表达在分化的细 胞上。DAPI染色表明新融合的NPRCP正形成细胞核（图76中箭头）。聚集的NPRCP形成 心脏成肌细胞。移植后4周之前，未检测到聚集的NPRCP，相反，在4周的心脏和8周的心脏 中发现表达GFP的成心肌细胞（图77-图80)。
[0025] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使肠再生（图81-图85)。通过尾静脉注射移 植NPRCP。在NPRCP移植后7天采集小肠。在低放大倍数下，仅在隐窝区域发现聚集的表达 GFP的NPRCP (图81)。更高放大倍数的图（图82)表明0ct4并不共定位于NPRCP(在上图 中的箭头），而sox2(下图中的箭头）仅在聚集阶段、但不在融合阶段共定位于NPRCP。以 微小的点状的聚集的NPRCP穿过细胞间的空隙进入隐窝（图83)。在到达隐窝后，它们保持 它们的聚集的形状，在隐窝处它们起始它们的融合并且进一步分化（图84)。NPRCP衍生的 细胞具有高的增殖率（图85)。
[0026] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使毒性损伤的肝脏再生（图86A-图86D)。移 植后4天，在毒性化学损伤的肝中出现聚集的NPRCP。NPRCP通过聚集融合方式（图86A-图 86B)或如描述的通过将调节因子释放至细胞使肝细胞再生（图86C-86D)。
[0027] 在其他实施方式中，NPRCP和PFDNC使毒性损伤的胰腺再生（图87-图91)。移植 后2天在胰腺组织中发现为群体（grouped)的表达GFP的NPRCP。在表达GFP的NPRCP中， 胰岛素染色为细小颗粒。在聚集的NPRCP的中央可以看见中空结构，表明该细胞的细胞核 还未形成（图87-图88)。移植后2天在胰腺中发现分散的表达GFP的NPRCP。这些NPRCP 与表达0ct4的颗粒紧密定位，证明NPRCP使胰腺腺泡细胞再生（图89)。因为在细胞中表 达GFP和胰岛素有时间差，在胰岛细胞中进一步研宄0ct4表达。再一次，0ct4在胰岛边缘 的细胞中表达，而表达胰岛素的细胞不与表达〇ct4的细胞共定位。这些数据证明胰腺0 细胞不是干细胞。这些细胞完全分化并且不与干细胞标志物共表达（图91)。
[0028] 在下文描述本发明的其他方面。
【附图说明】
[0029] 第1部分（图1A，图1B-图12)描述了 NPRCP的特征，包括其形态，通过电子显微 镜和标准的光学显微镜观察，在培养条件下的NPRCP的特异性标志物的表达和形态。第2 部分（图13-图18)描述了 NPRCP的起源。NPRCP由表达oct4的前干细胞释放。第3部分 (图19-图24A-图24C)描述了 PFDNC形成和特征，包括其形态和表面标志物。第4部分 (图25-图30)描述了通过PFDNC的直接转分化的单个有核细胞形成。第5部分（图31A， 图31B-图34)描述了通过PFDNC的融合分化的多个有核细胞形成。第6部分（图35)描述 了使其他血型细胞再生的其他类型的血液NPRCP。第7部分（图36A，图36B)证明在人脐 带血中的NPRCP纯化技术。第8部分（图37A-图37J，图38)示出小鼠NPRCP可以被纯化 并且具有与人类中那些相似的表达。第9部分（图39A-图39G，图40-图50)证明了在缺 血性损伤的肾脏中NPRCP的体内再生。第10部分（图51-图65)证明在缺血性脑损伤的 小鼠中通过移植的NPRCP的体内神经元再生。第11部分（图66-图72)证明通过小鼠皮 肤创伤中的移植的NPRCP的体内皮肤和毛囊再生。第12部分（图73-图74)证明通过在 小鼠皮肤创伤中的移植的NPRCP的体内平滑肌再生。第13部分（图75-图80)证明通过 缺血性损伤的小鼠心脏中的移植的NPRCP的体内心脏细胞（cardiac cell)再生。第14部 分（图81-图85)证明通过移植的NPRCP的体内肠细胞再生。第15部分（图86A-图86D) 证明在毒性化学品损伤的小鼠肝脏中移植的NPRCP的肝细胞再生。第16部分（图87-图 91)证明通过小鼠模型中的移植的NPRCP的体内肝细胞再生。第17部分（图92)证明在 健康条件下，通过释放转录因子或蛋白，如〇ct4和sox2 (公认的用于细胞重编程的因子） PFDNC可以调节细胞重编程。PFDNC可以通过经由其长尾样结构出芽来释放转录因子。
[0030] 图1A，图IB :NPRCP包含蛋白和RNA二者。图1A和图1B示出使用苏木精和伊红 (H&E)和仅用苏木精染色的培养的富集的NPRCP。所有的NPRCP都小于5ym。苏木精染色 用于细胞核物质而伊红染色多用于蛋白质。对于H&E染色小的NPRCP是阳性的，其中更多 的苏木精染色在膜的一边（箭头）而伊红在其他区域。标尺=5 ym。
[0031] 图2-图6示出NPRCP是混合的群体。为确定这些NPRCP的详细的结构，使用电子 显微镜用于检测。EM图像显示超过5种类型的不同的颗粒。将它们列为：1)包含大的核心 样颗粒类型颗粒（图2)。这个类型的颗粒包含大的核颗粒（箭头）。这些核颗粒具有致密 核心样结构并且尺寸不同（0. 1-0. 5 ym)。该类型的NPRCP尺寸范围为约2 ym至约5 ym。
[0032] 2)松散膜类型（图3)。该类型的NPRCP具有非常薄的外膜并且在膜内包含分散 的致密核颗粒。它们还具有内部分层的结构。由于膜结构的柔韧性，它们的形状可以改变。
[0033] 3)固体颗粒类型（图4)。该类型的NPRCP不具有松散膜。它们包含小的肺泡小 颗粒、致密核物质和低致密区域。它们大多是圆形。大部分核颗粒定位于颗粒的一边（见 3-4 y m和4-5 y m图片）或在膜下方。
[0034] 4)致密物质类型（图5)。该类型的NPRCP包含致密物质，其均匀分布于NPRCP的 主体内。可以看见一些较大的致密核颗粒在膜的附近。此外，它们的膜是厚的并且具有不 规则突起。
[0035] 5)均匀和非致密的类型（图6)。这种类型的NPRCP包含小的核颗粒和纤维样结 构，其均匀分布于成分内。这些NPRCP是具有薄膜的圆形。
[0036] 图 7 示出 NPRCP 仅包含小于 200nt 的 RNA 片段。在 Agilent 2100Bi〇-analyzer 上采集并运行来自NPRCP和前细胞的RNA。分析RNA条带并且结果表明NPRCP仅具有小于 200拉的1?^。约30%的这些小1?^是微小1?^。在前细胞样品中可以看见核糖体1?^。数 据在3份分离的样品中是可重复的。
[0037] 图8A-图8D示出在NPRCP的成分中特异性标志物表达。0ct4和Sox-2 (胚胎干细 胞标志物）在约80%的NPRCP上表达。通过比较，DDX4/VASA(生殖细胞标志物）在约60% 的NPRCP上表达。Sox2和DDX4/VASA在NPRCP上表达为颗粒形状，证明它们的表达是特异 性的。它们中的约40%共表达微管蛋白并且它们全部表达肌动蛋白。NPRCP不对DAPI染 色，证明它们不具有细胞核，但有少量的核物质。标尺=10 ym。
[0038] 图9示出NPRCP上的表面标志物的免疫荧光染色。NPRCP对于c-kit (约30% )、 整联蛋白0 1 (超过80% )和E-钙粘蛋白（少于5% )染色是阳性的。它们不表达⑶90。 标尺=10 U m〇
[0039] 图10示出⑶45和⑶34表达的免疫荧光研宄。发现⑶45 (血液干细胞标志物） 在大部分小的圆形颗粒上表达。在下面的图中，一组DNA对于DAPI染色，虽然还未成为细 胞核，并且对于⑶34是强的，表明表达⑶34的组是前细胞。标尺=10 y m。
[0040] 图11示出培养的人脐带血衍生的NPRCP，其使用Nikon显微镜通过40X透镜成 像。图像示出NPRCP通过与多个小颗粒融合增加它们的尺寸。标尺=10 ym。
[0041] 图12示出NPRCP的体外扩增。图像示出NPRCP可以在培养期间富集。图像是在 第0天（左）和5天后（右）的相同的场下。NPRCP的数量显著增加，证明NPP可以在培养 基中富集。
[0042] 图13示出NPRCP是由无核细胞产生的。分离人脐带血细胞中的NPRCP并滴在盖 玻片上并且对苏木精和伊红染色。识别具有纺锤形（左）和圆形（右）的多个NPRCP。两 种类型的NPRCP都紧密定位于不具有细胞核（箭头）的较大的细胞结构中。
[0043] 图14示出识别出3种不同类型的NPRCP。在人脐带血中识别了纺锤形（左）和圆 形（右）的NPRCP。在小鼠NPRCP的移植后，在小鼠组织体内识别出短棒状的NPRCP (右）。 全部3种类型的NPRCP都对于苏木精和伊红染色。未观察到特异的伊红染色，表明这些 NPRCP包含除蛋白质外更多的核物质。标尺=10 ym。
[0044] 图15示出在分化后，产生NPRCP的细胞是有核的。从人脐带血中采集NPRCP并滴 在盖玻片上并且用H&E染色。与无核细胞相比（右边箭头），在左边图像中可以看见致密 的苏木精染色的细胞核（左边箭头）。这些数据表明当这些产生NPRCP的细胞是分化的时 候，它们可以是有核的。标尺=l〇ym。
[0045] 图16示出产生NPRCP的细胞的活体图像。在培养的人脐带血中拍摄图像。许多 小的NPRCP (左）位于小的细胞结构周围。相对较大尺寸的NPRCP位于小的细胞结构附近 (右）。这些数据证明这些细胞结构产生小的NPRCP，其在细胞外进一步生长。标尺=10 y m