或组合物，包括药物组合物，包含有效量的NPRCP 和 / 或 PFDNC。
[0208] 在另外优选的方面，通过注射递送本发明的药物组合物。这些用于给予（递送） 的途径包括但不限于：皮下或胸骨旁，包括静脉内，动脉内（例如冠状动脉内）、肌内、腹膜 内、心肌内、经心内膜（transendocardial)、经心包内、鼻内给予、以及关节内、囊内和输注 技术。因此，药物组合物优选为适合用于注射的形式。当肠胃外给予本发明的治疗时，其通 常配制成单位剂量的可注射形式（溶液、悬液、乳液）。适合用于注射的药物制剂包括无菌 水溶液或分散液以及用于重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。载体（carrier)可 以为包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等）、它们的合适的 混合物和植物油的溶剂或分散介质。
[0209] 可以例如通过使用涂层，如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持期望粒径，以及通 过使用表面活性剂来维持适当的流动性。非水媒介物（vehicle)，如棉籽油、芝麻油、橄榄 油、大豆油、玉米油、葵花子油、或花生油以及酯，如肉豆蔻酸异丙酯也可以用作用于化合物 组合物的溶剂系统。此外，可以添加各种添加剂，其增强组合物稳定性、无菌性和等渗性，包 括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过不同抗细菌剂和抗真菌剂（例 如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等）来保证微生物的预防动作。在许多情况下， 期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用延迟吸收药剂（例如单硬脂酸铝和明胶） 可以带来可注射的药物形式的延长的吸收。然而，根据本发明，使用的任何媒介物、稀释剂 或添加剂必须与化合物相容。如所期望的，通过以合适溶剂的需要量与其他成分的不同的 量引入（incorporate)在实践本发明中使用的化合物可以制备无菌的可注射溶液。
[0210] 可以以包含任何相容载体（如各种媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂）的可注射的制 剂将本发明的药物组合物，例如包含NPRCP和/或PFDNC的治疗剂量的药物组合物给予至 受试者；或者，可以以缓慢释放的皮下植入物或靶向递送系统（如单克隆抗体、离子电渗疗 法（iontophoretic)、聚合物基质、脂质体和微球体）的形式，将在本发明中利用的化合物 肠胃外地给予至受试者。
[0211] 在一个实施方式中，可以初始给予、并随后通过进一步给予维持本发明的组合物。 例如，可以以组合物的一种类型给予和随后以组合物的不同或相同类型进一步给予本发明 的组合物。例如，可以通过静脉注射至血管达到合适的水平给予本发明的组合物。随后通过 口服剂量的形式维持受试者的水平，虽然取决于受试者的条件，也可以使用其他给予形式。 待给予的药物组合物的量对于被治疗的受试者可以不同。
[0212] 精确测定深思熟虑的有效剂量可以基于每个受试者的单独的因素，包括其尺寸， 年龄，受损心肌的面积和损伤以后的时间量。因此，本领域技术人员可以容易地确定在本发 明的方法中待给予的组合物中的化合物和可选的添加剂、媒介物和/或载体的剂量和量。 典型地，任何添加剂（除了一种或多种活性干细胞和/或一种或多种细胞因子外）以在磷 酸盐缓冲液中〇. 001至50wt%溶液的量存在，并且活性成分以微克到毫克的量级（order) 存在，如约0. 0001至约5wt %，优选约0. 0001至约lwt %，最优选约0. 0001至约0. 05wt % 或约0. 001至约20wt%，优选约0. 01至约10wt%，和最优选约0. 05至约5wt%。当然，对 于给予至动物或人的任何组合物，和对于给予的任何特定方法，因此优选确定：毒性，如通 过在合适的动物模型（例如啮齿类，如小鼠）中确定致死剂量（LD)和LD50 ;和一种或多种 组合物的剂量，引起合适的反应的其中的成分的浓度和给予一种或多种组合物的时机。这 类确定不需要过度的本领域技术人员的知识、本发明和本文引用的文献的实验。可以确定 用于顺序给予的时间而不需要过度的实验。包含本发明治疗剂的组合物的实例包括用于孔 (orif ice)的液体制剂，例如口腔的、鼻的、肛门的、阴道的、经口的（peroral)、胃内的、粘 膜的（例如经舌的、牙槽的、牙龈的、嗅觉器官的或呼吸道粘膜）等，给予如悬浮液、糖浆或 酏剂；和用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内给予（例如，注射给予）的制剂，如无菌悬 浮液或乳液。这类组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄 糖等混合。组合物还可以是冻干的。取决于给予途径和所需的制剂，组合物可以包含助剂 物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、色素 等。可以参考标准文献，如"REMINGTON，SPHARMACEUTICAL SCIENCE"第17版，1985,通过引 用结合于此，以制备合适的制剂而无需要过度的实验。
[0213] 以液体制剂方便地提供了本发明的药物组合物，液体制剂例如等渗水溶液、悬浮 液、乳液或粘性组合物，其可被缓冲至选定的pH值。
[0214] 已经参考其优选的实施方式详细说明本发明。然而，应理解，本领域普通技术人员 在考虑本公开内容之后，在本发明的精神和范围内可以做出不同的修改和改进。下列非限 制性的实施例是本发明的说明。
[0215] 在此提到的所有文件通过引用结合在此。出于达到如同每个单独公开物或专利文 件单独地指出的相同程度的所有目的，所有在本申请中引用的公开物和专利文件通过引用 结合在此。通过在本文件中不同参考文献的引用，申请人并不承认，任何特定参考文件是本 发明的"现有技术"。
[0216] 实施例
[0217] 虽然上面已经描述了本发明的各种实施方式，应理解的是仅以实例而不是限制的 方式提出。根据本发明可以对公开的实施方式做出各种改变而不背离本发明的精神或范 围。因此，本发明的宽度和范围不应由任何上面描述的实施方式限制。
[0218] 材料和方法
[0219] 肾脏再生（缺血性损伤）：麻醉8至10周龄的雌性Balb/c小鼠。去毛后，清洁并 打开腹部皮肤。同时使用4-0的缝合线结扎每一侧的肾动脉。45min后，除去缝合线以重新 打开结扎的动脉。在缝合腹部皮肤后，通过使用26线规（26-guage)的针经尾静脉注射移 植在150 y 1生理盐水中的2千万个GFP小鼠血液衍生的NPRCP。对照组经历尾静脉注射生 理盐水。在移植后的第1天以及1、2、3、4和6周后处死小鼠。移去并且固定肾脏用于组织 学检查。
[0220] 神经元再生（缺血性损伤）：通过大脑中动脉阻塞（MCAO)诱导局灶性脑缺血。简 要地，在用水合氯醛（400mg/kg，i.p.)麻醉后，结扎同侧颈外动脉（ECA)。端部钝化并且 涂覆有1 %的聚L-赖氨酸的6-0尼龙单丝缝合线，通过右侧颈总动脉（CCA)插入颈内动脉 (ICA)并前进约10mm远至ECA/ICA分叉点以在韦利斯氏环（Circle of Willis)的结合点 封闭大脑中动脉（MCA)的起点。在阻塞90min后取出缝合线以允许再灌注。假手术小鼠进 行相同的手术，除了未插入线栓。手术后，将小鼠置于在灯加热的暖箱内2小时以保持体 温。在脑手术5小时内，将从GFP转基因小鼠分离的2千万个NPRCP通过尾静脉植入每只 小鼠。
[0221] 皮肤再生（急性创伤）：通过6mm的活检穿孔器在每只Balb/c小鼠的背部上产生 两个创伤。在创伤产生后1小时内，移植从GFP转基因小鼠中采集并培养三周的2千万个 NPRCP。在移植后2、4、6、8、10天采集创伤。
[0222] 平滑肌再生（急性创伤）：通过6mm的活检穿孔器在每只Balb/c小鼠的背部上产 生两个创伤。在创伤产生后1小时内，移植从GFP转基因小鼠中采集并培养3周的2千万 个NPRCP。在移植后2、4、6、8、10天采集创伤。
[0223] 心肌细胞再生（通过缺血性损伤）：左前降支（LAD)冠状动脉结扎和再灌注。使 用10至12周龄的雄性Balb/c用于LAD手术。通过吸入3%的异氟烷麻醉每只小鼠。使 用设置在1. 5%异氟烷的小鼠呼吸器，通过气管内管通气保持麻醉。使用解剖显微镜，沿着 胸骨旁左侧开胸。随后轻轻地解剖心包膜以心脏和左冠状动脉可见。在中间水平通过使用 9-0尼龙缝合线结扎阻断LAD冠状动脉，并且通过30分钟后移除结扎再灌注。使用6-0羟 乙酸乳酸聚酯（polyglactin)缝合线间断缝合封闭胸壁。随后，使用6-0丝缝合线缝合皮 肤。将从GFP转基因小鼠采集并培养3周的2千万个NPRCP通过静脉注射植入每只小鼠。 在移植后的2、4和8周米集心脏。
[0224] 肝脏再生（毒性损伤）：12周龄的C57BL6小鼠腹膜内给予链脲霉素（STZ) 100mg/ kg，每隔一天一次，共3次（周一、周三、周五）。3天后，检测血糖。使用具有高于13mmol/ L血糖的小鼠用于NPRCP移植。在移植后2、4、7和9天采集肝脏。
[0225] 胰腺再生（毒性损伤）：12周龄的C57BL6小鼠腹膜内给予100mg/kg链脲霉素，每 隔一天3次（周一、周三、周五）。3天后测量血糖。认为具有血糖高于13mmol/L的小鼠可 成功用于糖尿病建模。将从GFP转基因小鼠中采集并且培养3周的2千万个NPRCP经由尾 静脉注射移植至每只糖尿病小鼠。在移植后2、4、7和9天采集胰腺。每只小鼠在首次NPRCP 移植后的10天接受第二次NPRCP移植用于2个月的糖尿病研宄。在第一次移植2个月后 采集胰腺。
[0226] 实施例 1 :识别 NPRCP 和 PFDNC。
[0227] 健康的新生儿分娩后采集人脐带血。通过在200 Xg离心10min除去血衆。血衆部 分在5000Xg再次离心10min。细胞部分转移至红血细胞裂解缓冲液（155mM氯化铵，10mM 碳酸氢钾和〇. ImM EDTA)中20至30min。随后，将裂解物在300Xg下离心10min。随后将上 面的部分在5000Xg下离心10min。在吸出上清液和蓬松的细胞膜层后，在含有0.1 mMEDTA 的PBS中重悬颗粒并且在5000 Xg下再次离心10min。
[0228] 将在血浆和细胞部分中的颗粒或汇集在一起或使用具有20%胎牛血清的a-MEM 在平板上分开培养。每隔一天换一次培养基，并且观察NPRCP的生长。痕量的红血细胞和 血小板在培养10天后消失。
[0229] 识别和表征NPRCP (图1-图12)。NPRCP包含蛋白和RNA二者。图1A和图1B示出 用苏木精和伊红（H&E)以及苏木精染色的培养富集的NPRCP。所有的NPRCP都小于5 ym。 苏木精用于核物质的染色而伊红多用于蛋白质的染色。小的NPRCP对于H&E染色阳性，在 膜一侧（箭头）具有更多苏木精染色而在其余区域是伊红染色。
[0230] NPRCP是混合的群体。为辨别这些NPRCP的详细结构，使用电子显微镜用于检查。 EM图像显示超过5种类型的不同的颗粒。它们被列出为：1)核心样颗粒类型（图2)。这 个类型的颗粒包含大的核颗粒（箭头）。这些核颗粒具有致密核心样结构并且尺寸不同 (0? 1-0. 5 y m)。该类型NPRCP的尺寸范围为2 y m至5 y m。
[0231] 2)松散膜类型（图3)。该类型的NPRCP外部具有非常薄的膜并且在膜内包含分 散的致密核颗粒。它们还具有内部分层的结构。由于膜结构的柔韧性，它们的形状可以非 常不同。
[0232] 3)固体颗粒类型（图4)。该类型的NPRCP不具有松散膜。它们包含小颗粒、致密 核物质和低致密区域。它们是圆形。大部分的核颗粒定位于颗粒的一边（见4-5 ym)或在 膜下方。
[0233] 4)致密物质类型（图5)。该类型的NPRCP包含致密物质，其均匀分布于成分中。 可以看见一些核颗粒在膜下方。此外，它们的膜是厚的并且具有不规则突起。
[0234] 5)均匀和非致密的类型（图6)。该类型的NPRCP包含小的核颗粒和纤维样结构， 其均匀分布于成分中。这些NPRCP是具有薄膜的圆形。
[0235] 图 7 示出了 NPRCP 仅包含小于 200nt 的 RNA 片段。在 Agilent 2100Bi〇-analyzer 上采集并运行来自NPRCP和前细胞的RNA。分析RNA条带和结果表明NPRCP仅具有小于 200nt的RNA。在前细胞样品中可以看见核糖体RNA。数据在3份分离的样品中是可重复 的。
[0236] 图8A-图8D示出在NPRCP的成分中特异性标志物的表达。0ct4和Sox-2 (胚胎 干细胞标志物）在约80%的NPRCP上表达。通过比较，DDX4/VASA(生殖细胞标志物）在约 60%的NPRCP上表达。0ct4、sox2和DDX4/VASA在NPRCP上表达为颗粒形状，提示它们的 表达是特异性的。它们中的约40%共表达微管蛋白并且它们全部表达肌动蛋白。NPRCP不 对DAPI染色，表明它们不具有细胞核并且内部的核成分很少。标尺=10 ym。
[0237] 图9示出NPRCP上的表面标志物的免疫荧光染色。NPRCP对于c-kit (约30% )、 整联蛋白0 1 (超过80% )和E-钙粘蛋白（少于5% )染色是阳性的。它们不表达⑶90。 标尺=10 U m〇
[0238] 图10示出⑶45和⑶34表达的免疫荧光研宄。已经发现⑶45 (血液干细胞标志 物）在大部分小的圆形颗粒上表达。在下面的图中，一组DNA对于DAPI染色，虽然还未成 为细胞核，并且对于⑶34是强的，表明表达⑶34的组是前细胞。标尺=10 ym。
[0239] 图11示出使用Nikon显微镜通过40X透镜成像的培养的人脐带血细胞衍生的 NPRCP。图像示出NPRCP与多个小颗粒融合增加它们的尺寸。标尺=10 ym。
[0240] 图12示出NPRCP体外扩增的证据。图像示出NPRCP可以在培养期间富集。图像 是在第0天（左）和5天后（右）的相同的场下的。NPRCP的数量显著增加，证明NPP可以 在培养基中富集。
[0241] NPRCP是由表达oct-4的前干细胞所释放的证据（图13-图18)。图13示出NPRCP 是由无核细胞产生的。分离人脐带血细胞中的NPRCP并滴在玻璃片上并且对苏木精和伊红 染色。识别具有纺锤形（左）和圆形（右）的多个NPRCP。两种类型的NPRCP紧密定位于 不具有细胞核（箭头）的较大的细胞结构中。
[0242] 图14示出识别出3种不同类型的NPRCP。在人脐带血中识别了纺锤形（左）和圆 形（右）的NPRCP。在小鼠NPRCP的移植后，在小鼠组织中体内识别出短棒状的NPRCP (右）。 全部3种类型的NPRCP均对于苏木精和伊红染色。在它们中均没有特异的伊红染色，表明 这些NPRCP包含除蛋白质外更多的核物质。标尺=10 ym。
[0243] 图15示出在分化后，产生NPRCP的细胞是有核的。从人脐带血中采集NPRCP并且 滴在盖玻片上并且用H&E染色。与无核细胞相比（右边箭头），在左边图像中可以看见致密 的苏木精染色的细胞核（左边箭头）。这些数据表明当这些产生NPRCP的细胞是分化的时 候，它们可以是有核的。标尺=l〇ym。
[0244] 图16示出产生NPRCP的细胞的活体图像。在培养的人脐带血中拍摄图像。许多 小的NPRCP (左）位于小的细胞结构周围。相对较大尺寸的NPRCP位于小的细胞结构附近 (右）。这些数据表明这些细胞结构产生小的NPRCP，其在细胞外进一步生长。标尺=10 y m。
[0245] 图17示出产生NPRCP的细胞在分化后成为有核的细胞。培养人脐带血细胞。图像 示出释放大量小颗粒的有核细胞。该细胞附着于培养皿的底部并具有明显的细胞核。该数 据表明图15中的这些产生NPRCP的小细胞结构可以是分化的，其特征在于出现的细胞核。
[0246] 图18示出产生NPRCP的细胞结构表达0ct4。将人脐带血衍生的细胞滴在盖玻片 上并且对0ct4染色。上图示出包含许多小的DAPI致密颗粒的细胞结构。小颗粒正在出芽 该细胞结构（箭头）。下面的4张图示出具有弱的DAPI染色的强表达oct4的结构。仅当 过度曝光时其示出弱的DAPI染色。许多小的oct4阳性和DAPI阳性的颗粒位于该结构的 周围。这些图像表明产生NARCP的细胞结构在早期不具有细胞核。标尺=10 ym。
[0247] PFDNC形成和表征，包括其形态和表面标志物（图19-图24)。图19示出NPRCP 融合为无核细胞。延时图示显示一组NPRCP在llmin内融合为细胞结构。许多小囊泡围绕 结构。标尺=10 U m
[0248] 图20示出从至少2个具有约3-10 ym的尺寸的NPRCP发育出的无核PFDNC。当它 们达到成熟时（箭头），可以看见一个颗粒具有薄的膜。标尺=10 um。
[0249] 图21A至图21F示出当PFDNC在培养皿中时它们的不同形态。PFDNC的特征为具 有阿米巴样运动。它们在培养基中扭动其主体。G-I中的图像示出分化的PFDNC。它们具 有从10至20 ym的尺寸。它们改变它们的动作以在培养皿上缓慢行进。标尺=10 ym。
[0250] 图22示出了活动整合DNA和RNA的（PFDNC)的表达和形态。非活动（A)和活动 (B)的PFDNC的剪辑图像。PFDNC对于SOX2、整联蛋白M、微管蛋白和DDX4的H&E(C)和 微管蛋白免疫荧光染色（D)。中间的2个图像示出PFDNC的免疫荧光染色。所有合并的图 像用DAPI染色（蓝色）。由直立式常规荧光显微镜拍摄图像。标尺=10 ym
[0251] 图23A-图23B示出PFDNC通过NPRCP衍生自细胞质物质的集合。2个前细胞结构 (各为约5ym(A)和8ym(B))的电子显微镜图像在中央（箭头）具有NPRCP，其提示PFDNC 的核心衍生自NPRCP。
[0252] 图24A-图24C示出PFDNC的FACS结果。图24A、图24B和图24C是在PFDNC上通 过荧光活化细胞分拣器（FACS)测定表面标志物的结果。图24A =对照组；图24B =⑶29 而图24C = CXCR4表达。FACS分析证明PFDNC表达更多，超过60%的PFDNC表达CD29。它 们中的约40%表达CXCR4。它们不表达E-钙粘蛋白。下列图像来自FACS实验结果。在进 行其他实验后结果可重复。
[0253] 通过PFDNC的直接转分化形成单个有核细胞的证据（图25-图30)。图25示出 NPRCP和PFDNC成为有核细胞。该图像描述了约1至2 y m的NPRCP (左上图）至更大尺寸 的NPRCP(右上图）的转化。NPRCP进一步与蛋白质融合（左下图中的箭头）并开始分化。 与有核细胞相比，分化的PFDNC仍不具有典型的细胞核（右下图）。标尺=10 ym。
[0254] 图26显示新的PH)NC衍生的细胞是干细胞。H&E染色（A-D)表明PFDNC并不如有 核细胞一样具有强烈的伊红染色。在PFDNC的分化期间，它们的蛋白含量增加而核仍未形 成。免疫荧光染色表明PFDNC和分化的PFDNC对于0ct4染色（H中的箭头），然而完全有核 的细胞不具有〇ct4染色（下方图片中的箭头）。标尺=10ym。
[0255] 图27示出进入细胞以从这些细胞获取物质的成熟的PFDNC的图像。在28min(细 箭头）和在55min (粗箭头）时，两个成熟的PFDNC(箭头）在真核细胞内。之后它们成为 分化的PFDNC。标尺=50 ym。
[0256] 图28示出图像，显示分化的PFDNC可以通过彼此融合并进入细胞质膜而转化为真 核细胞。该过程可以在几分钟内发生。上方图片示出两对分化的PFDNC融合成为两个前细 胞。下方图片示出了一个前细胞在9min内融合进入细胞质膜并且成为一个细胞。标尺= 10 u m〇
[0257] 图29示出通过PFDNC的细胞的融合分化。时间延迟图像（A)示出PFDNC的融合。 3个PFDNC (箭头）在18min内融合成为细胞。标尺=10 ym。
[0258] 图30示出PFDNC衍生的前细胞，在细胞核区域具有DNA(大的那一个中的致密蓝 色）。大的前细胞中的致密蓝色染色不是圆形，提示该前细胞正在形成细胞核。在全部3个 图像中都可以看见薄和松散膜，提示它们来自相同类型的颗粒。标尺=5 ym。
[0259] 通过PFDNC的融合分化形成的多个有核细胞的证据（图31A、图31B-图