图77表明聚集的NPRCP形成为成心肌细胞。表达GFP的NPRCP在2周的缺血性 心脏中聚集。未检测到聚集的NPRCP，相反，只在4周心脏中发现表达GFP的成心肌细胞。 可以检测到平滑肌肌动蛋白。
[0107] 图78示出循环衍生的NPRCP形成为成心肌细胞。图像显示在移植8周后在心脏 中的新形成的成心肌细胞。它们形成为集群的或分散的成肌细胞。它们中的一些定位在临 近血管的右边（在下图中的箭头）。
[0108] 图79示出NPRCP形成为成心肌细胞。较高的放大图像示出在NPRCP移植8周后 一组新形成的表达GFP的成心肌细胞。在新形成的成心肌细胞中仍然可见一组表达GFP的 NPRCP〇
[0109] 图80示出NPRCP形成为成心肌细胞。较高的放大倍数显示在NPRCP移植8周后一 组新形成的表达GFP的成心肌细胞。在新形成的成心肌细胞中仍然可见表达GFP的NPRCP。
[0110] 图81示出NPRCP使肠上皮细胞再生。众所周知，在肠绒毛（villa)顶端的肠上皮 细胞脱落（shed off)，而在底部或隐窝区域的细胞向上迀移以填充空间。通过尾静脉注射 移植NPRCP。在NPRCP移植7天后，采集小肠。在较低放大倍数下，仅在隐窝区域发现聚集 的表达GFP的NPRCP。
[0111] 图82示出NPRCP迀移至肠隐窝并且融合进入细胞。较高倍数的放大图像显示0ct4 并不与NPRCP共定位（上图中的箭头），而sox2 (下图中的箭头）仅在聚集阶段，而不在融 合阶段与NPRCP共定位。
[0112] 图83示出NPRCP迀移至肠隐窝并且融合进入细胞。较高倍数的放大图像显示0ct4 并不与NPRCP共定位（上图中的箭头），而sox2 (下图中的箭头）仅在聚集阶段，而不在融 合阶段与NPRCP共定位。
[0113] 图像84显示NPRCP形成为隐窝细胞。图像显示通过H&E染色（上图）和免疫荧 光染色（下图）的在更高放大倍数下肠隐窝的水平横切面。所有的GFP-阳性的融合结构 是聚集的NPRCP，表明隐窝细胞衍生自血液衍生的NPRCP。
[0114] 图85示出新的NPRCP形成的隐窝细胞的高增殖率。图像示出了经历有丝分裂的具 有强烈的苏木精染色的两种新形成的细胞。这两种细胞定位在NPRCP聚集体所在的区域， 表明它们衍生自NPRCP融合物。标尺=20 ym。
[0115] 图86A-图86D显示通过NPRCP的肝细胞的再生。移植4天后在肝脏中发现集群 的表达GFP的NPRCP (箭头）（图86A)。这些集群的NPRCP中的一些也表达0ct4 (红色）。 在更高的放大倍数下（图86B)，也识别了分散的表达GFP的NPRCP。图86C中的图像示出 分散的表达GFP的NPRCP。在移植后第7天（图86D)，更高放大倍数的图像显示表达GFP 的NPRCP聚集在一起或围绕细胞核。该数据并未排除NPRCP具有诱导分化的细胞以经历核 编程并成为干细胞的功能。然而，通过NPRCP诱导干细胞的机制不是通过修饰基因而是通 过调苄基因表达。标尺在A和C中=50 y m ;在B和D中=20 y m。
[0116] 图87示出产生胰岛素的细胞衍生自血液。NPRCP被移植至糖尿病小鼠。移植2天 后，在胰腺组织中发现集群的表达GFP的NPRCP。在表达GFP的NPRCP中胰岛素染色为细小 颗粒。在聚集的NPRCP的中央可见中空结构，表明该细胞的细胞核尚未形成。该数据说明 胰岛素在充分分化的细胞中表达，而GFP在细胞分化之前表达。在胰岛素表达和GFP表达 之间存在时间差。
[0117] 图88示出NPRCP移植至糖尿病小鼠。移植2天后，在胰腺组织中发现集群的表达 GFP的NPRCP。在表达GFP的NPRCP中胰岛素染色为细小颗粒。在聚集的NPRCP的中央可 见中空结构，表明该细胞的细胞核尚未形成。该数据还提示胰岛素在充分分化的细胞中表 达，而GFP在细胞分化之前表达。该数据还支持在胰岛素表达和GFP表达之间存在时间差。
[0118] 图89示出移植2天后在胰腺中发现分散的表达GFP的NPRCP。这些NPRCP与 0ct4-表达颗粒紧密定位，提示NPRCP使胰腺腺泡细胞再生。
[0119] 图90示出NPRCP形成新的胰岛。在二次NPRCP移植两月后，在胰腺中检测到小的 胰岛。表达GFP (红色）的NPRCP定位在集群细胞的外部边缘，表明GFP在衰弱。在中央的 2个细胞正在表达胰岛素，其作为颗粒表达，表明它们是新的产生胰岛素的细胞。
[0120] 图91示出由于细胞中表达GFP和胰岛素具有时间差，所以进一步研宄在胰岛细 胞中的0ct4表达。再一次，0ct4在胰岛边缘的细胞中表达，而表达胰岛素的细胞不与表达 〇ct4的细胞共定位。这些数据表明胰腺0细胞不是干细胞。这些细胞是充分分化的并且 不具有干细胞标志物的共表达。
[0121] 图92示出NPRCP或PFDNC可以释放转录因子以调控在正常状态下的细胞重编程。 在体内发现长尾的NPRCP或PFDNC。它们表达sox2、0ct4和DDX4,然而具有长尾。该形态 证明了 NPRCP或PFDNC释放重新编码有核细胞的转录因子或其他调节因子。由于PFDNC可 以容易地进入有核细胞，它们可以将这些调节因子直接释放进入细胞核。
【具体实施方式】
[0122] 当用于细胞治疗时干细胞诱导排斥，并且因此必须测试来自供体和受体二者的血 液用于组织配型，这使得难以找到具有匹配的组织类型的合适的供体。在本发明的实施方 式中，分离并且培养富集了被称为"非血小板包含RNA的颗粒"（NPRCP)的一组混合颗粒。 NPRCP不具有细胞核以及细胞质膜。因此，NPRCP不表达诱导排斥的抗原蛋白。此外，NPRCP 可以产生一组细胞结构（PFDNC)其采集来自真核细胞的遗传物质并进一步转化为该类型 的真核细胞或间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC)。除了这些类型之外，NPRCP还 产生进一步转化成其他血液干细胞或造血干细胞（HSC)的其他类型的前细胞。由于这些益 处，在治疗处理中，与MSC和HSC的治疗处理相比，可以更安全和更有效率地使用NPRCP。在 进一步的实施方式中，提供了纯化和进一步富集NPRCP的技术。
[0123] 参考附图描述本发明，其中贯穿图像使用相同的参考数字来指定相似的或等同的 要素。图像并不按比例绘制，提供它们仅是说明本发明。以下参考用于说明的实施例应用 描述了本发明的若干方面。应理解，提出了许多具体细节、关系以及方法从而提供对本发明 的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易地认识到可以实践本发明而无需这些 特定细节中的一种或多种或其他方法。本发明不受所说明的动作或事件的顺序的限制，因 为一些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时地发生。此外，对于实施根据 本发明的方法并不要求所有说明的动作或事件。
[0124] 可以实施本发明的实施方式而无需提出的理论方面。此外，本发明提出的理论方 面应理解为申请人并不寻求被提出的理论所束缚。
[0125] 除非另外限定，本文使用的所有术语（包括技术和科学术语）都具有与本领域技 术人员通常理解的相同意义。此外应当理解的是，术语，如在通用词典中限定的那些，应被 解释为具有与它们在相关领域的背景中的含义一致的含义，并且不得以理想化或过度形式 化的意义进行解释，除非明确规定如此限定。
[0126] 定义
[0127] 本文所用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的而不意在限制本发明。
[0128] 本文所用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的而不意在限制本发明。如本 文中所用的，单数形式"一种"、"一个"和"该"意在也包括复数形式，除非上下文另有明确 说明。此外，对于详述的说明书和/或权利要求书中使用的术语"包括"（including)、"包 含"（includes)、"具有" (having)、"具有" (has)、"有" (with)或它们的变体来说，此类术语 意在包括于与术语"含有"（comprising)类似的方式内。
[0129] 术语"约"或"大约"意味者在对于如由本领域普通技术人员所确定的具体值的可 接受的误差范围内，这将部分地取决于值是如何测量或确定的，即，测量系统的限制。例如， "约"可以意思是在本领域每一惯例的1个标准差内或大于1个标准差。可替代地，"约"可 以指给定值的最尚达20%，优选最尚达10%，更优选最尚达5 %并且还更优选最尚达1 %的 范围内。可替代地，特别是对于生物学系统和方法，术语可以指一个值的一个数量级内，优 选在5倍并且更优选在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述具体的值时，除非另外指 出，否则应假设术语"约"为意思是对于一个具体值可接受的误差范围内。
[0130] 在本文中术语"患者"或"个体"互换使用，并且涉及待治疗的哺乳动物受试者，其 中优选人类患者。在一些情况下，本发明的方法发现用于实验动物中、在兽医学应用中和在 用于疾病的动物模型的开发中，包括但不限于啮齿类动物包括小鼠、大鼠和仓鼠；以及灵长 类动物。
[0131] "诊断（diagnostic)"或"诊断的"是指识别病理学病症的存在或性质。诊断方法 在其敏感性和特异性方面不同。诊断测定的"敏感性"是测试呈阳性的患病个体的百分数 ("真阳性"的百分数）。未由测定检测的患病个体是"假阴性"。未患病并且在测定中呈阴 性的受试者被叫做"真阴性"。诊断测定的"特异性"是1减去假阳性率，其中"假阳性"率 被限定为测试呈阳性但不患有疾病的那些的比例。尽管特定的诊断方法可能不提供病症的 决定性诊断，但是如果这种方法提供帮助诊断的阳性指示，则它是合格的。
[0132] "治疗"是带有防止病症的发展或改变病症的病理或症状的目的所进行的干预 (intervention)。因此，"治疗"是指治疗性治疗和预防性（prophylactic或preventative) 措施两者。需要治疗的那些包括已经患有这种病症的那些以及在其中要预防这种疾病的那 些。如本文中使用的，"改善"或"治疗"是指症状其接近正常值（例如在健康的患者或个体 中获得的值），例如不同于正常值少于50%，优选不同于正常值少于约25%，更优选，不同 于正常值少于10%，并且仍更优选，与使用常规统计检验测定的正常值没有显著差别。
[0133] "分离"小颗粒涉及从生物样品中除去颗粒并分离开其他细胞，其并非生物样品的 颗粒，例如血液的方法。分离的颗粒通常将不会被其他细胞类型污染，即，"同质性"或"纯 度"并且通常将具有增殖和分化以产生其由它分离的组织的成熟细胞的能力。在小部分 的其他颗粒类型存在的情况下，分离的颗粒可以存在，其他颗粒类型并不干扰颗粒用于分 析和产生其他分化的细胞类型的利用。分离的颗粒通常将最少是30%、40%、50%、60%、 70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或99. 9%纯度。优选地，根据本发明的分离的颗粒 将最少是80 %纯度。
[0134] 如本文中使用的，"培养"涉及在支持颗粒生活力或增殖的环境和条件下通过培养 一段时间增殖或培育（nurturing)颗粒。根据本发明，培养可以包括一个或更多的扩增和 富集颗粒、纯化颗粒的步骤。
[0135] 如本文中使用的，术语"自体颗粒"意在是指涉及衍生自个体随后再次重新引入该 相同个体的任何物质。
[0136] 术语"异种颗粒"涉及在移植或免疫过程中，衍生自与成为受体动物宿主的动物物 种不同的动物物种的任何颗粒。
[0137] 术语"同种异体颗粒"是指与成为"受体宿主"的动物为相同的动物种类但是在一 个或更多遗传位点不同的任何颗粒。这通常应用于从一个动物到相同物种的另一个不同动 物移植的细胞。
[0138] "生物样品"包括固体和体液样品。用于本发明中的生物样品可以包括细胞、蛋白 质或细胞的膜提取物、血液或生物液体例如腹水液或脑液（例如脑脊液）。固体生物样品的 实例包括但不限于，取自以下的组织的样品：中枢神经系统、骨、胸部、肾脏、子宫颈、子宫内 膜、头/颈、胆囊、腮腺、前列腺、垂体、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰脏、甲状腺、 心脏、肺脏、膀胱、脂肪、淋巴结、子宫、卵巢、肾上腺、睾丸、扁桃体和胸腺。"体液样品"的实 例包括但不限于血清、精子、前列腺液、精液、尿液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴液和泪液。
[0139] 术语"样品"是指按其最广泛的意义解读。"样品"是指分离自个体或来自细胞培养 物成分的生物样品，如，例如；一个或多个细胞、组织或液体（包括，但不限于，血浆、血清、 全血、脑脊液、淋巴液、泪液、尿液、唾液、乳汁、脓、组织渗出液和分泌物），以及获自例如，实 验步骤的样品。生物样品可以包含分离自细胞的染色体（例如，中期染色体的传播），分离 自细胞的细胞器或细胞膜，完整细胞或组织，核酸如在溶液中或连接至固体支持物（如用 于Southern分析）的基因组DNA、在溶液中或连接至固体支持物（如用于Northern分析） 的RNA、在溶液或连接至固体支持物的cDNA、在溶液中的或连接至固体支持物的核苷酸，在 溶液中或连接至固体支持物的多肽或肽，组织或组织印迹等。
[0140] 可以利用许多熟知的组织或流体采集方法来从受试者中采集生物样品以确定受 试者中感兴趣的变异体的DNA、RNA和/或多肽的水平。实例包括但不局限于：细针穿刺活 检，穿刺活检、芯针穿刺活检以及手术活检（例如，脑活检）以及灌洗。与所采用的程序无 关，一旦获得活检/样品，就可以确定变异体的水平并且因此可以做出诊断。
[0141] 非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)组合物。
[0142] 为避免颗粒和血小板之间的混淆，这些体现于本发明的新的颗粒在本文中称为 "非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP) "。虽然这些颗粒可以使用与血小板相似的离心速度分 离，这些NPRCP是并非由巨核细胞产生的颗粒。此外，电子显微镜显示这些颗粒不包含如血 小板所包含的a颗粒（a-granule)、细胞器或糖原颗粒，表明它们不是血小板。NPRCP具 有多种形状。NPRCP在国际认可的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约下于2012年 12月19日保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC)(ATCC专利保藏号PTA-13396)。
[0143] 简要地，本文描述的新的颗粒是具有不同形态的混合群体，并且非常小、包含RNA 但不是核糖体RNA，并且表征为表达一种或多种标志物。在本发明中已经至少识别了 5种 类型的NPRCP。NPRCP装配成一组生命有机体，其不具有细胞质膜和细胞核。为避免这些生 命有机体和真核细胞之间的混淆，本文中它们已经被称为"PFDNC"。除了装配PFDNC，NPRCP 还装配成其他聚集产物，其可以进一步转化为其他类型的血液衍生的细胞。
[0144] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP包括至少5种不同类型的类别。
[0145] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP包含小RNA和微小RNA。小RNA小于200nt并 且表达超过100种不同的微小RNA(参见，表）。
[0146] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP包含0ct4、DDX4/VASA和sox-2或它们的成 分，或它们的组合。
[0147] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP在其表面上包含并表达整联蛋白M、⑶45和 ⑶34或它们的组合。
[0148] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP表达低于5%的表达E-钙粘蛋白。
[0149] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP产生更大尺寸的产物。它们的产物中的一种 (p FDNC)具有阿米巴样运动并且被薄的松散膜包围。pFDNC特征在于其穿透、跨越真核细胞 细胞膜并进入真核细胞的内部而不损伤这些细胞、反复采集物质的能力。
[0150] 在优选的实施方式中，分离的NPRCP产生其他产物，其通过与其自身或与血液循 环DNA片段随机结合进一步转化为造血干细胞（HSC)。
[0151] 在另一个优选的实施方式中，NPRCP包含分类为小、中、大的不同尺寸。
[0152] 在另一个优选的实施方式中，可以用不同的生长和/或分化因子培养NPRCP。在 其他实施方式中，用多肽、蛋白质、或核苷酸培养NPRCP。这些可以包括激素、酶、细胞因子， 等。在其他实施方式中，NPRCP可以与期望类型的细胞或组织共培养以诱导期望细胞类型 例如肌细胞、神经细胞、心脏细胞、肾细胞等的核编程。
[0153] 在另一个优选的实施方式中，从骨髓、脐带血或外周血中分离NPRCP。
[0154] 在另一个优选的实施方式中，组合物包含NPRCP并且它们的产物可以是从0. 1 ym 至10 ym的不同的尺寸。在一个实施方式中，组合物包含小尺寸NPRCP。在另一个实施方 式中，组合物包含中等尺寸的NPRCP和它们的产物。在又一个实施方式中，组合物包含大的 NPRCP和它们的产物PFDNC。在又一个实施方式中，组合物包含两种或更多尺寸的NPRCP的 组合和它们的产物PFDNC。
[0155] 在另一个优选的实施方式中，包含主题NPRCP的组合物特征在于它们包含核颗 粒。在又一个实施方式中，组合物包含NPRCP和它们的产物PFDNC，其缺少细胞核和细胞器。 这和真核细胞形成对比。
[0156] 在另一个优选的实施方式中，包含主题NPRCP和它们的产物PFDNC的组合物的特 征在于它们没有核糖体RNA。从NPRCP中分离的总RNA具有不超过200nt的短片段。
[0157] 主题NPRCP特征在于通过电子显微镜拍摄的它们独特的形态。识别了至少5种具 有有核颗粒和蛋白质膜二者的颗粒。
[0158] NPRCP进一步表征为它们的细胞表面标志物的表达。虽然在本领域中对于特 定的标志物提及细胞为"阳性"或"阴性"是常见的，然而实际的表达水平是数量性状 (quantitative trait)。在细胞表面的分子数可以有几个对数的区别，然而仍被表征为"阳 性"。那些本领域技术人员也理解，对于染色是阴性的细胞，例如，标志物特异性试剂的结合 水平与对照（例如同种型匹配的对照）没有可检测的区别；可以表达少量的标志物。染色 水平的特征允许细胞群体间的细微的差别。
[0159] NPRCP特征在于在它们的成分中的0ct4的表达。尽管在本领域中对于特定的标志 物提及细胞为"阳性"或"阴性"是常见的，然而实际的表达水平是数量性状。分子的数量 可以有几个对数的区别，然而仍被表征为"阳性"。本领域技术人员也理解，对于染色是阴性 的细胞，即，标志物特异性试剂的结合水平与对照（例如，同种型匹配的对照）没有可检测 的区别；可以表达少量的标志物。染色水平的特征允许群体间的细微的差别。
[0160] NPRCP特征在于在它们的成分中的DDX4/VASA的表达。尽管在本领域中对于特定 的标志物提及细胞为"阳性"或"阴性"是常见的，然而实际的表达水平是数量性状。分子 的数量可以有几个对数的区别，然而仍被表征为"阳性"。本领域技术人员也理解，对于染色 是阴性的细胞，即，标志物特异性试剂的结合水平与对照（例如，同种型匹配的对照）没有 可检测的区别；可以表达少量标志物。染色水平的特征允许群体间的细微的差别。
[0161] NPRCP特征在于Sox-2或它们的成分的表达。尽管在本领域中对于特定的标志物 提及细胞为"阳性"或"阴性"是常见的，然而实际的表达水平是数量性状。在细胞表面的 分子数可以有几个对数的区别，然而仍被表征为"阳性"。本领域技术人员也理解，对于染色 是阴性的细胞，即，标志物特异性试剂的结合水平与对照（例如，同种型匹配的对照）没有 可检测的区别；可以表达少量的标志物。染色水平的特征允许群体间的细微的差别。
[0162] 细胞的染色强度可以通过流式细胞仪监控，其中激光检测荧光物的定量水平（其 与特异性试剂结合的细胞表面标志物（例如抗体）的量成比例）。基于连接至特异性试剂 的强度，以及其他参数如细胞尺寸和光散射，还可以使用荧光激活细胞分选或FACS来分离 颗粒群体。虽然染色的绝对水平与特定的荧光和试剂制剂可以不同，但是可以对于对照标 准化数据。
[0163] 为了将分布对于对照标准化，将每个颗粒记录为具有特定染色强度的数据点。可 以根据对数比例显示这些数据点，其中测量的单位是任意染色强度。在一个实施例中，样品 中最亮的染色颗粒可以是比未染色颗粒多达4对数更高的强度。当以这种方式显示的时 候，显然落