34)。图 31A、图31B示出NPRCP融合分化。通过显微镜和记录的视频检查共培养的NPRCP。时间延 迟图像剪辑自视频记录的快照以示出一组小颗粒在150min内融合为细胞结构（A)。在共培 养的细胞中对于0CT4表达的染色（B)。标尺在A中=20 y m ;在B中=10 y m。
[0260] 图32示出NPRCP融合衍生的大细胞释放小的无核细胞。在培养皿中的活细胞（A) 伸出至少2个细胞部分（A中的箭头）。大细胞的H&E染色（B)示出不规则的苏木精染色。 伸出的细胞质部分显示在外部边缘的少量的苏木精染色（B中的箭头）。伸出部分的免疫荧 光染色示出大量的微管蛋白和0CT4和SOX2表达（C和D中的箭头）。活细胞释放小的无核 细胞并且示出多于2个更多的伸出（E中的箭头）。在下方图片中的图像示出了具有非常活 跃运动的细胞突起的时间延迟（箭头）。标尺在A-E中=10 ym，在下方图片中=20 ym。
[0261] 图33A-图33C示出多个NPRCP融合以形成细胞核（图33A-图33B)。DAPI染色 在不规则形状细胞核上。该图像表明DNA出现在多个NPRCP上，它们彼此紧密定位。DNA在 重排或细胞核编程后成为细胞核。33B中的标尺=5 ym。大的融合的细胞结构分化成多个 细胞。这些细胞定位于大的结构中，其对于〇ct4强烈表达（红）。未观察到清晰的细胞质 成分。33C中的标尺=10ym。
[0262] 图34示出在PFDNC衍生的前细胞中的细胞核编程的证据。NPRCP和它们的聚集的 产物PFDNC，确实不具有DNA或细胞核。它们从真核细胞的细胞核或从循环的DNA片段采集 DNA并且随后经历核编程。图像示出不具有DNA的前细胞（左上图片中）、分散的DNA(左 下图片）或环样形式的DNA(右下），表明它们经历核编程以成为真核细胞。标尺=10 ym。
[0263] 其他类型的血液NPRCP存在的证据，该血液NPRCP再生其他血液类型细胞（图 35)。上图示出两种H&E染色细胞结构，其不具有聚集的颗粒，提示它们可以转化为其他类 型的细胞，但不是间充质样细胞。标尺=5 ym。下图示出NPRCP的电子显微镜，其直接转 化为一种类型的血液细胞。这些颗粒是小的圆形并且随着它们变得更大时致密中心变得衰 减。在这些颗粒中未见细胞核，表明它们不是细胞。
[0264] 纯化NPRCP的技术的证据。图36A、图36B示出纯化的NPRCP的分离。NPRCP通过 它们的尺寸和运动区别于PFDNC。示出纯化的NPRCP (左）和PFDNC、分化的PFDNC和前细 胞的混合物（右）。这些图像说明发明人具有纯化NPRCP的技术。
[0265] 微小RNA的结果的表。使用3次采集的NPRCP (图36A)和3组中等尺寸的颗粒或 前细胞（图36B)进行微小RNA阵列。比较并分析在这两个组中的微小RNA的表达。选择 具有小于〇. 05的p-值的数据。相比于组2,在NPRCP中高表达的微小RNA列于表1。
[0266] 表1?在NPRCP中增加的表达（第1部分）
[0267]
[0269] 相比于混合组2,在NPRCP中显著地较低表达的微小RNA列于表2。
[0270] 表2.在NPRCP中降低的微小RNA。
[0271]
[0273] 分离小鼠NPRCP的证据。图37A-图37J至图38说明可以通过使用与用于人NPRCP 相似的方法分离小鼠NPRCP。GFP转基因小鼠分离的小鼠NPRCP表达0ct4、sox2、DDX4、肌 动蛋白、微管蛋白和GFP，具有从约1至约5 ym的尺寸。
[0274] 通过移植的NPRCP小鼠肾脏再生的证据。图39A-图39G直到图42A-图42J示出 在移植后第1天，NPRCP迀移至小鼠缺血性肾脏。微小的表达GFP的颗粒，其共表达0ct4、 S〇X2和DDX4和渗出的物质集群在一起。
[0275] 图43A、图43B至图44F示出在移植后第1周，GFP阳性NPRCP融合为大的补丁样 结构，其形成为肾导管结构。融合的补丁还共表达sox2和0ct4。
[0276] NPRCP直接分化为肾脏间质细胞的证据。图45示出间质组织的再生。在移植到具 有缺血性肾脏损伤的小鼠中后1周，微小的共表达GFP(箭头）和DDX4的细胞在间质区域。
[0277] NPRCP再生肾小球的证据。图46A-图4H示出肾小球的再生。在移植到具有缺血性 肾脏损伤的小鼠中后第1周。GFP和DDX4在无核区共表达为小颗粒。移植后第2周。GFP 阳性的肾小球共表达0ct4。DAPI染色显示没有细胞核。H&E染色示出从第1天到第4周的 肾小球的可能的再生阶段。图47显示其排列为肾小球结构而不具有细胞核的渗出的表达 GFP 的（棕色）NPRCP。
[0278] NPRCP再生肾脏导管的证据。图48示出在NPRCP移植后从第1天到第4周的肾小 管细胞（黑色箭头）。再生的肾小管示出对于GFP阳性的刷状缘结构（圈）。
[0279] NPRCP再生神经元的证据。图51-图52示出在移植4天后，在缺血性损伤的脑中 表达GFP的NPRCP的外观。DAB染色和荧光染色方法都确认了表达GFP和表达巢蛋白的 NPRCP在4天后出现在脑中。
[0280] 图53示出聚集的NPRCP形成为表达巢蛋白的新神经元。在聚集的表达GFP的 NPRCP中的核物质融合、经历核编程并成为神经元的细胞核。放大两个细胞核（DAPI中的箭 头）（下图）。清晰地示出这两个细胞核是由微小的点状DAPI颗粒形成的。此外，表达GFP 的NPRCP表达巢蛋白，表明它们形成为神经元干细胞。
[0281] 图55示出了移植7天后树突的外观。在移植后7天，聚集的NPRCP开始伸出树突。 同时，点状的巢蛋白已经连接在一起并成为纤维样结构。
[0282] 图56-图59示出树突形成从早期至晚期的机制。在早期（图56)，NPRCP分散在 某些区域并且形成圆形。巢蛋白表达为微小的点并且也分散于相同的区域。进一步（图 57)，NPRCP突出彼此连接以形成树突的小纤维。表达GFP的NPRCP已经失去小囊泡形状并 成为点状或线形。0ct4在该表达GFP的结构的核心区域中表达，提示其将成为新形成的细 胞核。这些数据还表明形成的细胞是干细胞。之后（图59-图59)，树突在细胞核完全形成 前形成。免疫荧光和免疫组化图像进一步确认新神经元的树突是通过NPRCP的连接和进一 步分化形成的。在DAB染色的图像中可以看见细胞核（箭头，右下），相比于其他细胞核，其 对苏木精染色较弱。
[0283] 在小鼠脑缺血性模型中的轴突再生的证据。图60-图65示出，除了形成树突外， NPRCP还聚集以形成轴突。然而，轴突形成较缓慢并且还以不同的方式。聚集的NPRCP被 细胞包围或在导管样结构内部。在NPRCP移植10周后，GFP和巢蛋白在轴突样结构上共表 达。该数据表明NPRCP可以再生轴突，然而是以更缓慢的过程。
[0284] 由移植的小鼠NPRCP使毛球再生的证据。图66-图67和图69示出NPRCP形成为 毛球。毛球在到达表皮层前在循环和组织中形成。图像示出2天的创伤对GFP、0ct4和H&E 染色。在具有毛球形状的创伤边缘渗出NPRCP。
[0285] 由移植的NPRCP使小鼠表皮再生的证据。图68示出NPRCP再生表皮细胞。表达 GFP、0ct4和DDX4的NPRCP出现在表皮层中，不仅在基底层中也在表层中。
[0286] 小鼠毛囊再生的证据。图70示出在创伤部位新的毛囊表达GFP、DDX4和oct4,证 明这些毛囊衍生自NPRCP。
[0287] 图71-图72示出NPRCP再生结缔组织。聚集的NPRCP位于损伤的真皮区域。这 些图像表明NPRCP再生真皮。
[0288] 平滑肌再生的证据。图73-图74示出NPRCP再生平滑肌。小的无核细胞排成列 以形成更大的结构。新形成的肌纤维表达〇ct4和GFP二者，支持这些肌纤维衍生自NPRCP。
[0289] 心肌细胞再生的证据。在迀移至心脏组织后，NPRCP聚集成群。在2周的心脏切 片中（图75-图77)，集群的NPRCP融合为成心肌细胞，其还表达平滑肌肌动蛋白（干细胞 标志物）。平滑肌肌动蛋白染色为颗粒状，不是纤维样，表明在分化的细胞上表达的是纤维 状。DAPI染色表明新融合的NPRCP正在形成细胞核。在移植后8周之前（图78-图80)， 在心脏中仅发现有表达GFP的成心肌细胞。
[0290] NPRCP再生肠隐窝干细胞的证据。众所周知的是在肠绒毛顶端的肠上皮细胞迀移 自底部或隐窝区域的细胞。经由尾静脉注射移植NPRCP。在NPRCP移植7天后采集小肠。 在较低放大倍数下，仅在隐窝区域发现聚集的表达GFP的NPRCP，表明NPRCP转化为肠隐窝 干细胞（图81-图85)。
[0291] 由NPRCP干细胞再生的证据。移植后，在肝脏中发现成群的和分散的表达GFP的 NPRCP (图86A-图86D)。这些成群的NPRCP还表达0ct4。更高放大倍数的图像显示表达 GFP的NPRCP集群在一起或围绕细胞核。该数据表明，除了融合外，NPRCP具有诱导分化的 细胞经历核编程并成为干细胞的功能。然而，由NPRCP诱导干细胞的机制不是通过基因修 饰而可能是通过调苄基因表达。
[0292] 图87-图91示出胰腺再生。产生胰岛素的无核细胞衍生自血液。NPRCP移植至糖 尿病小鼠。移植2天后，在胰岛组织中发现集群的表达GFP的NPRCP。在表达GFP的NPRCP 中胰岛素染色为细小颗粒。在聚集的NPRCP的中央可见中空结构，表明该细胞的细胞核尚 未形成。该数据还证明胰岛素在完全分化细胞中表达，而GFP在细胞分化之前表达。在胰 岛素和GFP表达间存在时间差。这些数据表明胰腺0细胞不是干细胞。这些细胞是完全 分化的并且不与干细胞标志物共表达。
[0293] NPRCP或PFDNC诱导有核细胞形成为干细胞的证据。图92示出长尾的NPRCP或 PFDNC，其在体内共表达sox2、0ct4和DDX4。该形态证明NPRCP或PFDNC释放转录因子或 其他调节因子用于使有核细胞重编程。因为PFDNC可以轻易进入有核细胞，它们可以释放 这些调节因子，如 〇Ct4、S〇x2、DDX4和其他未识别的蛋白。通过作用于下游蛋白以重编程这 些细胞，释放的〇ct4、sox2和DDX4可以诱导毒性细胞或应激细胞成为健康细胞或干细胞。 在这种情况下，NPRCP的功能是通过NPRCP自然释放的RNA和蛋白至而不是通过基因转染。
[0294] 尽管已经关于一种或更多种的实施方式说明和描述了本发明，其他本领域技术人 员在阅读和理解本说明书和附图之后，将想到等价的替换和修改。此外，尽管已经关于多种 实施方式中的仅仅一种公开了本发明的特定特征，然而，由于对于任何给定的或特定的申 请可能是需要的并且有利的，这类特征可以与其他实施方式的一个或更多其他特征组合。
[0295] 提供本发明的摘要以允许读者快速确定本技术公开的本质。连同以下理解一起提 交摘要：它将不会用于解释或限制下列权利要求的范围或含义。
【主权项】
1. 一种分离的非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，其中，所述NPRCP为1至5 y m，包含 至少5种具有薄的外膜的类型，所述薄的外膜包括松散膜或紧密膜。2. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，具有松散膜的所述NPRCP是不规则形状 的颗粒。3. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，具有紧密膜的所述NPRCP是圆形的颗 粒。4. 根据权利要求1所述的分离NPRCP，其中，所述膜不是典型的有核细胞质膜。5. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，所述NPRCP包含小RNA和微小RNA。6. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，至少5种类型的所述NPRCP包括：包含 大的核心样颗粒类型颗粒、松散膜类型、固体颗粒类型、致密物质类型或圆形并均匀类型。7. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，所述NPRCP包含颗粒，所述颗粒含有一 种或多种成分蛋白：0ct4、DDX4和sox-2〇8. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，所述NPRCP包含一种或多种表面标志 物：CD29、CXCR4 和 c-kit、CD45、CD34 或它们的组合。9. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，少于5 %的NPRCP包含E-钙粘蛋白。10. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，NPRCP包含缺少DNA的颗粒。11. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，NPRCP包含缺少细胞核的颗粒。12. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，NPRCP包含具有分类为小、中和大的不 同的尺寸，尺寸范围为约0.1 U m至约10 y m的颗粒并且是从表达0ct4的前干细胞释放。13. 根据权利要求1所述的分离的NPRCP，其中，两个或更多NPRCP的融合物产生包含 松散外膜并且缺少一个或多个细胞核、核膜和/或细胞质膜的颗粒。14. 一种分离的颗粒融合物衍生的无核细胞（PFDNC)，其中所述PFDNC衍生自一个或多 个非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，包含松散外膜并缺少一个或多个细胞核、核膜和/或 细胞质膜。15. 根据权利要求14所述的分离的PFDNC，其中，所述前细胞具有阿米巴样运动并通过 穿透真核细胞转化进入真核细胞。16. 根据权利要求14所述的分离的PFDNC，其中，所述前细胞经历核编程但是没有经历 重编程。17. 根据权利要求14所述的分离的PFDNC，其中，所述前细胞包含含有小RNA和微小 RNA的颗粒并且缺少DNA。18. 根据权利要求14所述的分离的PFDNC，其中，所述前细胞表达一种或多种标志物， 所述标志物包括：0ct4、sox2或微管蛋白。19. 一种分离的非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，其中，NPRCP包含通过约200 X g至 约6000 Xg离心分离的颗粒。20. -种分离的非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，其中，NPRCP可以通过用合适的培 养基的体外培养富集。21. -种分离的非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，其中，NPRCP包含能够产生下游产 物的颗粒。22. -种含有非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)的组合物，其中，NPRCP是包含位于不 规则形状颗粒上的松散膜或包含在圆形颗粒上的紧密膜的颗粒。23. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含具有薄的外膜的颗粒，所述外膜 不是细胞质膜。24. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含含有小RNA和微小RNA的颗粒。25. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含不同类型的颗粒，包括：颗粒类 型、松散膜类型、固体颗粒类型、致密物质类型或圆形并且均匀的类型。26. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含颗粒，所述颗粒含有一种或多种 成分蛋白：0ct4、DDX4/VASA、sox-2和微管蛋白。27. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含一种或多种表面标志物：⑶29、 CXCR4和c-kit、⑶45、⑶34、肌动蛋白或它们的组合。28. 根据权利要求22所述的组合物，其中，少于5%的NPRCP包含E-钙粘蛋白表面标 志物。29. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含不含有DNA的颗粒。30. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含缺少细胞核和核膜的颗粒。31. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含通过约200Xg至约5000Xg离 心可以从生物样品中分离的颗粒。32. 根据权利要求31所述的组合物，其中，NPRCP包含通过用合适培养基的体外培养可 以富集的颗粒。33. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包括分类为小、中和大并且范围为约 0? I y m至约10 y m的不同尺寸。34. 根据权利要求22所述的组合物，其中，NPRCP包含这些颗粒，所述颗粒可以产生权 利要求14所述的下游产物。35. -种包含颗粒融合物衍生的无核细胞（PFDNC)的组合物，其中，所述PFDNC产生自 或衍生自一个或多个非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)，其中所述前细胞样细胞（PFDNC)包 含松散外膜并缺少一个或多个细胞核、核膜和/或细胞质膜。36. 根据权利要求35所述的组合物，其中，所述PFDNC具有阿米巴样运动并且通过穿透 真核细胞转化真核细胞。37. 根据权利要求35所述的组合物，其中，所述PFDNC经历细胞核编程但没有经历重编 程。38. 根据权利要求35所述的组合物，其中，所述PFDNC包含小RNA和微小RNA并缺少 DNA039. 根据权利要求38所述的组合物，其中，通过约200Xg至约5000Xg离心分离所述 PFDNC040. 根据权利要求38所述的组合物，其中，通过使用合适培养基的体外培养可以富集 所述PFDNC。41. 一种体内使细胞或组织再生的方法，包括：将有效量的非血小板包含RNA的颗粒 (NPRCP)体内给予至患者，其中，在移植或给予后，所述NPRCP可以在体内环境转化；从而使 所述细胞或组织再生。42. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP是被薄膜覆盖的颗粒，所述薄膜可以是 松散的或紧密的并且不是细胞质膜。43. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包含含有小RNA和微小RNA的颗粒并缺 少 DNA。44. 根据权利要求41所述的方法，其中NPRCP包含颗粒，所述颗粒具有大的核心样颗粒 类型、松散膜类型、固体颗粒类型、致密物质类型和圆形并且均匀类型。45. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包含含有0ct4、DDX4/VASA和sox-2的 颗粒。46. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包含一种或多种表面标志物：⑶29、 CXCR4和c-kit、CD45、CD34或它们的组合。47. 根据权利要求41所述的方法，其中，少于5%的NPRCP包含E-钙粘蛋白表面标志 物。48. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包含缺少细胞核的颗粒。49. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包括分类为小、中和大并且范围为约 0? I y m至约10 y m的不同尺寸。50. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述NPRCP是多能的并且分化为多个细胞谱 系。51. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP获自包括以下的来源：自体的、异源的、 同基因的、同种异体的或异种的来源。52. 根据权利要求41所述的方法，其中，在给予至患者前，可选地离体培养和扩增 NPRCPo53. 根据权利要求41所述的方法，其中，在给予至患者前，用期望的分化因子和/或生 长因子可选地培养NPRCP。54. 根据权利要求41所述的方法，其中，NPRCP包含可以产生下游前细胞样颗粒的颗 粒，所述前细胞样颗粒衍生自一个或多个非血小板包含RNA的颗粒（NPRCP)。55. 根据权利要求54所述的方法，其中，所述PFDNC包含松散外膜并缺少一个或多个细 胞核、核膜和/细胞质膜。56. 根据权利要求54所述的方法，其中，所述PFDNC经历细胞核编程但是未经历重编 程。57. 根据权利要求54所述的方法，其中，所述PFDNC包含小RNA和微小RNA并缺少DNA。58. 根据权利要求54所述的方法，其中，所述PFDNC表达一种或多种标志物，包括： Oct、sox2或微管蛋白。59. -种分离的前细胞，其中，所述PFDNC表达0ct4并缺少细胞核。60. 根据权利要求59所述的分离的PFDNC，其中，所述PFDNC分化为有核细胞。61. 根据权利要求59所述的分离的PFDNC，其中，这些PFDNC释放非血小板包含RNA的 颗粒（NPRCP)。
【专利摘要】一组称为"非血小板包含RNA的颗粒(NPRCP)"的新的颗粒的识别提供了新的组合物、下游产品和治疗工具，此外，识别了一组混合的NPRCP，其包含RNA和蛋白质。NPRCP不具有细胞核且它们的膜不是典型的真核细胞膜。还提供了用于分离和富集的方法。PTA-1339620121219
【IPC分类】C12N5/00
【公开号】CN104884611
【申请号】CN201380019883
【发明人】孔五一
【申请人】孔五一
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年2月12日
【公告号】US20150079045, WO2013122950A1