一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明是属于生物和医学领域，应用于高灵敏度检测目标生物分子，具体地是涉及一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法。
【背景技术】
[0002]小分子有机染料作为生物荧光探针已被广泛应用于诊断学和分子成像等生命科学中。然而大多数有机荧光探针对光不稳定，且荧光光谱较宽，易受样品本身荧光信号背景的干扰。纳米探针技术如无机发光量子点(luminescent quantumdots)和突光纳米乳液微球(fluorescent latex nanoparticles),克服了有机染料的一些缺点。但是无机发光量子点由于其水溶性较差，黏度大，量子产率较低，且含有毒的金属镉化合物，因而在生物医学等领域受到一定的限制。因此，有机高分子纳米微球及以氧化硅为代表的无机纳米微球等作为负载荧光分子的基质已成为纳米荧光探针的研究热点之一。上述基质能实现较高的标记率，大大提高了分析灵敏度，但绝大多数无机或有机高分子纳米微球在标记荧光分子和生物分子前需引入反应活性较高的官能团。
[0003]壳聚糖为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是甲壳素部分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖。它是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性能。其弱酸水溶液具有高粘性，带正电荷。可与带负电荷高聚物发生交联反应而形成微球。壳聚糖链中的伯胺基团很容易和生物分子发生反应，诸如:蛋白质、DNA、酶、抗原抗体、生物素以及荧光分子异硫氰酸酯(FITC)等。壳聚糖微球已应用于亲和色谱介质及酶的固定化。因此壳聚糖纳米微球极有可能成为同时偶联荧光分子和生物识别分子的良好基质。
[0004]Roula等报道用FITC的甲醇溶液和壳聚糖醋酸溶液在黑暗中反应lh即制得FITC标记的壳聚糖，利用荧光偏振技术研究壳聚糖和粘液素的相互作用。Yoen等报道了在碱性条件下用FITC标记衍生化壳聚糖(glycol-chitosan)溶液，并将阿霉素负载于壳聚糖，研究负载药物在生物体内的分布。本实验报道了壳聚糖纳米荧光探针的制备方法。以三聚磷酸钠为交联剂的壳聚糖纳米粒子表面具有丰富的氨基，因此能方便地与FTIC分子中的异硫氰根反应，所得到FITC标记的纳米壳聚糖荧光探针具有荧光强度高，对光稳定的特点。此外，该荧光探针为多糖基质，生物相容性好，毒性小，因而在生物染色，酶联免疫反应以及生物芯片中具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明就是针对上述问题，提出一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法。
[0006]为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0007]—种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法包括如下步骤:
(1)取5 g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在40摄氏度水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用10 mol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0008](2)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7，取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3mL0.25% (m/V)TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖(CS)纳米粒子悬池液；以12000 r /m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用。
[0009](3)将离心后的CS纳米粒子分散在1% ( V /V )醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3h,得到FITC标记的壳聚糖纳米突光探针(N ano-sized
FITC-labled chitosan part icles, NFCS);离心，洗涤，用紫外分光光度计在 480nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
[0010]本发明的有益效果是。
[0011]本发明通过低分子量的壳聚糖(LCS)聚阳离子与三聚磷酸钠(TPP)的静电作用制备纳米级壳聚糖微球，并利用壳聚糖链上丰富的氨基与荧光素异硫氰酸酯(FITC)反应从而制备纳米壳聚糖微球荧光探针(NFCS)。当壳聚糖分子量为60000，LCS与TPP的质量比为6:1时，可得到粒度均一的球形纳米粒子，平均粒径为40±3nm。荧光倒置显微镜观察证实FITC结合到壳聚糖微球上。荧光光谱分析显示NFCS的最大激发波长、最大发射波长与游离态FITC无显著差异。光漂白实验证实NFCS的稳定性比游离态FITC有显著提闻。
【具体实施方式】
[0012]一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法包括如下步骤:
(1)取5 g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在40摄氏度水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用10 mol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0013](2)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7，取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3mL0.25% (m/V)TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖(CS)纳米粒子悬池液；以12000 r /m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用。
[0014](3)将离心后的CS纳米粒子分散在1% ( V /V )醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h,得到FITC标记的壳聚糖纳米突光探针(N ano-sizedFITC-labled chitosan particles, NFCS);离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
【主权项】
1.一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)取5g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在40摄氏度水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用10 mol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用； (2)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1%( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为.0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7，取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3 mL 0.25% (m /V )TPP溶液，磁力搅拌，得到经ΤΡΡ交联的壳聚糖(CS)纳米粒子悬池液；以12000 r /m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用； (3)将离心后的CS纳米粒子分散在1%( V /V )醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g/L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h，得到FITC标记的壳聚糖纳米突光探针(N ano-sized FITC-labled chitosan part icles, NFCS);离心，洗涤，用紫外分光光度计在 480nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
【专利摘要】一种壳聚糖纳米粒子荧光探针的制备方法。本发明通过低分子量的壳聚糖(LCS)聚阳离子与三聚磷酸钠(TPP)的静电作用制备纳米级壳聚糖微球,并利用壳聚糖链上丰富的氨基与荧光素异硫氰酸酯(FITC)反应从而制备纳米壳聚糖微球荧光探针(NFCS)。当壳聚糖分子量为60000,LCS与TPP的质量比为6：1时,可得到粒度均一的球形纳米粒子,平均粒径为40±3nm。荧光倒置显微镜观察证实FITC结合到壳聚糖微球上。荧光光谱分析显示NFCS的最大激发波长、最大发射波长与游离态FITC无显著差异。光漂白实验证实NFCS的稳定性比游离态FITC有显著提高。
【IPC分类】C08J3/24, C09K11/06, G01N21/64, C08B37/08
【公开号】CN105367685
【申请号】CN201410420061
【发明人】姜丹宁
【申请人】姜丹宁
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年8月25日