一种具有免疫调节活性的玛卡多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域。具体的说，本发明涉及一种具有免疫调节活性的玛卡多糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002]多糖(Polysaccharides)又称多聚糖，是一类由α-或β-糖苷键相连的十个及十个以上单糖聚合而成的生物大分子，在能量储存、结构构成及免疫防御等方面有极其重要的作用，是构成生物体的四大基本物质之一。自然界中90%以上碳水化合物均以多糖形式存在，广泛存在于高等动植物、藻类、真菌、细菌等生物体的细胞膜上，具有控制细胞分裂分化，调节细胞生长与衰老等多种复杂的功能。近些年又发现多糖因可增进机体免疫功能而有抑制肿瘤、抑菌解毒等作用，使国内外对动植物多糖的研究逐步深入，在我国如香菇多糖、黄芪多糖等研究均取得了很多成果。
[0003]玛卡中糖类含量比较高，据报道碳水化合物占总营养物质的59 %，每克玛卡能提供2850卡路里的能量与此密切相关。而玛卡糖类组成中又以多糖的比例最大。玛卡中的多糖包含淀粉及非淀粉类的多糖。玛卡是目前已知的十字花科作物中唯一的一种富含淀粉的植物，这与其能抵抗安第斯高海拔山区寒冷、霜冻、昼夜温差大等恶劣环境有关。目前国内外对玛卡中非淀粉类的的多糖报道较少，本实验室对这方面进行了研究，并对其结构组成及其活性进行了初步探讨发现玛卡多糖结构较为均一，单糖组成简单，对机体细胞具有一定的免疫调节活性，这为进一步深入研究其作用机理，开发多糖类免疫功能调节剂提供了理论依据。
【发明内容】
[0004]本发明目的以玛卡干片为原料，采用水提醇沉并经过一系列的方法分离纯化出具有免疫调节活性的多糖。运用柱前衍生化法检测其单糖组成，高效凝胶排阻色谱法检测其分子量，并在细胞模型上初步验证其具有一定的免疫调节活性，为进一步研究开发多糖类新药提供了基础。
[0005]本发明通过以下技术方案实现以上目的:以玛卡干片为原料，经过脱脂后，热水浸提，70?90%乙醇沉淀多糖，加水溶解沉淀物，再次醇沉得到粗多糖，通过DEAE-52纤维素(C1-型)树脂加水洗脱，经过过滤、冷冻干燥得到纯度较高的玛卡多糖。
[0006]本发明制备出的玛卡多糖经过柱前衍生化及高效凝胶排阻色谱法分析后可知，单糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖，其摩尔比为4?10: 1，分子量为10000?30000Da。
[0007]本发明制备出的玛卡多糖经过体外细胞实验表明具有一定的免疫调节活性，且毒性较低。
【附图说明】
[0008]图1九种单糖标准图谱
[0009]图2玛卡多糖单糖组成图谱
[0010]图3玛卡多糖分子量测定图谱
[0011]图4玛卡多糖(LMP-1)对巨噬细胞Raw264.7的增殖的影响
[0012]图5玛卡多糖(LMP-1)对巨噬细胞TLR样受体及下游炎症因子表达的影响
【具体实施方式】
[0013]下面的实施例将对本发明做进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应该认为属于本发明范围。
[0014]实施例1
[0015]玛卡多糖的制备工艺路线:
[0016](1)玛卡干片用80?95%的乙醇回流脱脂，加入水使得料液比1: 15?25，沸水回流提取，反应时间为1.5h。
[0017](2)用终浓度为70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C静置过夜，离心收集沉淀。
[0018](3)以1: 15?25的料液比用双蒸水复水溶，60°C搅拌4h，离心回收上清，用终浓度为70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C静置过夜，离心收集沉淀，得到粗多糖。
[0019](4)将上述粗多糖加双蒸水配成浓度为15?25mg/mL的溶液，离心去上清备用。DEAE-52纤维素(C1-型)树脂经过活化后装填至层析柱中，双蒸水平衡，将离心后的多糖上清液溶液上样，用双蒸水作为洗脱液进行洗脱，用硫酸蒽酮法进行跟踪检测多糖含量，直至流出液基本无多糖。
[0020](5)将含有多糖组分的水洗成分直接过滤除去杂质、冷冻干燥得到玛卡多糖(LMP-1)。
[0021]实施例2
[0022]玛卡多糖的结构鉴定
[0023](1)柱前衍生化法检测其单糖组成
[0024]图1为九种单糖标准图谱，如图中标注所示九种单糖标准品的出峰时间的先后顺序为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、和岩藻糖，根据样品中所出的峰及其出峰时间，可以比对判断出样品由葡萄糖、阿拉伯糖组成，如图2所示，经过计算可得葡萄糖、阿拉伯糖的摩尔比为4?10: 1。
[0025](2)高效凝胶排阻色谱法检测其分子量
[0026]图3为采用高效凝胶排阻色谱法测定玛卡多糖分子量图谱，通过GPC PostrunAnalysis分子量分析软件，计算得到分子量校正曲线，从而计算出玛卡多糖的分子量为10000 ?30000Dao
[0027]实施例3
[0028]玛卡多糖的免疫调节活性初步研究
[0029](1)玛卡多糖对鼠巨噬细胞Raw264.7的增殖作用
[0030]对数期RAW264.7细胞消化下来后进行计数，调整细胞密度为3X 104/ml，接种到96孔板上，100 μ L/孔。置于C02恒温培养箱，过夜培养，待细胞贴壁后加入不同浓度的玛卡多糖(终浓度为0，1.56，3.125，6.25，12.5，25，50 μ g/ml)，每个孔做4个重复，并加入LPS(1 yg/ml)做阳性对照，刺激48h后显微镜下观察细胞形态，MTT方法测定细胞浓度。结果如图4所示。从图中可以看出玛卡多糖在1.56,3.125,6.25，12.5 μ g/ml时能明显促进Raw264.7增殖，而浓度增高时对细胞的作用不明显。因此接下来的实验中选用促增殖作用较强的低浓度剂量(1.56，3.125，6.25 μ g/ml)作为试验剂量探索其对细胞TLR样受体及下游炎症因子表达的影响。
[0031](2)玛卡多糖对鼠巨噬细胞Raw264.7TLR样受体及下游炎症因子表达的影响
[0032]以每孔3xl0~5个细胞接种于6孔板中(每孔2ml)，细胞贴壁24h后加入不同终浓度的多糖(终浓度为1.56，3.125，6.25 μ g/ml)，同时设立空白组，LPS模型组(终浓度为1 μ g/ml)，培养24h后收集细胞提取总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，采用PCR仪定量扩增目的基因的cDNA，最后用琼脂糖凝胶核酸电泳验证所提取扩增的基因，用quantity one软件进行初步定量分析。结果如图5所示。从图中可以看出玛卡多糖能明显促进TLR4，TLR2受体表达，具有一定的剂量依赖性。三个剂量的玛卡多糖均能明显促进TNF-α的表达，剂量稍高时(3.125，6.25 μ g/ml)能促进IL-1 β的表达，只有当浓度达到6.25 μ g/ml时才能刺激细胞分泌IL-6。
【主权项】
1.一种玛卡多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)玛卡干片用80?95%的乙醇回流脱脂，加入水使得料液比1: 15?25，沸水回流提取，反应时间为1.5h。 (2)用终浓度为70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C静置过夜，离心收集沉淀。 (3)以1: 15?25的料液比用双蒸水复水溶，60°C搅拌4h，离心回收上清，用终浓度为70?90%的乙醇沉淀所提上清，4°C静置过夜，离心收集沉淀，得到粗多糖。 (4)将上述多糖加双蒸水配成浓度为15?25mg/mL的溶液，离心去上清备用。DEAE-52纤维素(C1-型)树脂经过活化后装填至层析柱中，双蒸水平衡，将离心后的多糖上清液溶液上样，用双蒸水作为洗脱液进行洗脱，用硫酸蒽酮法进行跟踪检测多糖含量，直至流出液基本无多糖。 (5)将含有多糖组分的水洗成分直接过滤除去杂质、冷冻干燥得到玛卡多糖(LMP-1)。2.权利要求1所述的玛卡多糖(LMP-1)的提取工艺，其特征在于用80?95%的乙醇回流脱脂，用终浓度为70?90%的乙醇沉淀多糖，同时过DEAE-52纤维素(C1-型)树脂得到纯度较高的玛卡多糖。3.权利要求2所述的玛卡多糖(LMP-1)的结构鉴定，其特征在于用柱前衍生化法检测其单糖组成，高效凝胶排阻色谱法检测其分子量，结果显示其单糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖，两者摩尔比为4?10: 1，分子量为10000?30000Da。4.权利要求3所述的玛卡多糖(LMP-1)的免疫活性研究，其特征在于玛卡多糖具有促进鼠巨噬细胞Raw264.7的增殖作用，在浓度1.56,3.125,6.25 μ g/ml时效果明显。刺激后的细胞TLR4，TLR2表达明显增强，TNF- a、IL-1 β、IL-6的表达量增多，并具有一定的剂量依赖性。5.权利要求4所述的玛卡多糖在制备免疫调节药物或/和抗炎药物，防癌抗癌、抗衰老、抗氧化中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种玛卡多糖的制备方法及其免疫调节活性的初步研究，采用沸水浸提、乙醇醇沉、过DEAE-52纤维素树脂等多种手段提取分离出纯度较高的玛卡多糖，检测出其单糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖，两者摩尔比为4～10∶1，分子量为10000～30000Da，同时发现本发明提取的多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的活性及其TLR4，TLR2，炎症因子的表达具有一定的促进作用。本发明的特点是：工艺流程简单，操作容易，成本较低，有利于大规模生产；本发明提取的多糖具有防癌抗癌、抗衰老、抗氧化、对抗自身免疫性疾病等功效，为进一步研究开发多糖类新药提供了理论依据。
【IPC分类】C08B37/00, A61P37/02
【公开号】CN105367677
【申请号】CN201510872970
【发明人】乐龙, 阚红金, 魏伟坤, 王莹, 欧瑜, 尹鸿萍
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月1日