基因表达的调控的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP)表达的控制和操纵以及抗坏血酸的制 备。本发明也涉及控制所述表达和制备的序列元件，及其使用。
【背景技术】
[0002] 抗坏血酸是植物中最丰富的可溶性抗氧化剂，并且对于人和一些其它动物也是必 需的营养素。抗坏血酸显著地促进人类膳食中"游离自由基清除剂"或"抗氧化代谢产物" 的全面摄入。令人信服的证据现在表明，这种代谢产物单独或者联合地作为抗癌症形成剂 和预防冠心病而有利于健康和身体。
[0003] 人类摄入的几乎全部膳食抗坏血酸都来源于植物产品。然而，植物组织的抗 坏血酸含量显著不同。虽然在草本和木本植物中，叶子的抗坏血酸含量通常很高并 且相对一致，但是在非绿色的可食用植物组织中，发现抗坏血酸含量有巨大的无法解 释的差异。例如，在果实中，其水平在Mirciaria dubia的卡姆果（camu camu)中高 达 30mg gFW_l AsA，而在 Mespilus germanica 的欧植果（medlar)中低于 3ug gFW_l AsA(Rodriguez 等，1992, J Chromatogr Sci，30:433-437) D 据报道猕猴桃中抗坏血酸值的 变化很大（Ferguson，A. R.，Botanical nomine lature: Act ini dia chinensis，Actinidia deliciosa,and Actinidia setosa.Kiwifruit:science and management, ed. I. J. Warrington 和 G. C. Weston. 1990,Palmerston North ；New Zealand:New Zealand Society for Horticultural Science.576.Beever,D.J.和 G.Hopkirk，Fruit development and fruit physiology. Kiwifruit:science and management, ed. I. J. Warrington and G. C. Weston. 1990, Palmerston North ；New Zealand:New Zealand Society for Horticultural Science. 576.) D不同的藤本植物水果的抗坏血酸含量， 对于美味称猴桃（A. deliciosa)范围是 30_400mg/100g(Ferguson，A. R.，1991 Acta Hort.290:p. 603-656, Spano，D?等，1997 Acta Hort.，.444:p. 501-506.)，而对于栽 培品种 "Hayward" 报道的范围在 80-120mg/100g(Beever，D. J?和 G.Hopkirk，Fruit development and fruit physiology.Kiwifruit:science and management, ed. I. J. Warrington 和 G. C. Weston. 1990,Palmerston North ；New Zealand:New Zealand Society for Horticultural Science. 576.) D 据报道，软率称猴桃（A. arguta)、中 华称猴桃（A. chinensis) (Muggleston，S?等，Orchardist，1998. 71 (8) :p. 38-40, Ch en，Q?和 Q. Chen，Crop Genetic Resources，1998 (2):p. 3,Coggiatti，S.，1971Ital Agr，Oct，? 108(10) :p. 935-941)、金花猕猴桃（A. chrysantha)和葛率猕猴桃（A. polygama) 的果实中含有较高浓度的抗坏血酸，在毛花猕猴桃（A. eriantha)和阔叶猕猴桃 (A.latifolia)中水平非常高（>1%鲜重）（Ferguson 1991 Acta Hort.290:p. 603-656?和 A. kolomikta (Kola，J. and J. Pavelka，1988 Nahrung，? 32(5) :p. 513-515) 〇
[0004] 已经提出植物中生物合成抗坏血酸的三种途径，一种是通过L-半乳糖（L-Gal) (Wheeler 等，1998, Nature 393,365-369)，另一种是由肌醇（myo-inositol)合成 (Loewus 和 Kelly, 1961，Arch. Biochem.Biophys. 95, 483-493 ;Lorence 等，（2004) Plant Physiol. 134, 1200-1205)，以及第三种途径是通过半乳糖醛酸（Agius等， 2003, Nat Biotechnol 21,177-81)。L-Gal途径通过L-半乳糖生产半乳糖酸-1,4-内 醋（galacton〇-l，4-lactone)，并由此形成抗坏血酸（Wheeler 等，1998, Nature 393, 365-369)。
[0005] 对于L-半乳糖途径，已经鉴定并且至少部分表征出来编码这些酶的所有基因和 它们相关的酶活性。
[0006] 被表征的基因和酶活性包括⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶（Conklin，1998, Trends Plant Sci 3:329-330. ;Conklin 等，1999Proc Natl Acad Sci U S A 96:4198-4203.; Keller 等，1999 Plant J 19:131-141.)、⑶P-D-甘露糖 3'，5'-茶香异构酶（Wolucka et al.,2001, Anal Biochem294:161-168 ；ffolucka and Van Montagu, 2003, J. Biol. Chem. 278:47483-47490 ；ffatanabe et al. ,2006 Phytochemistry 67:338-346.)> L-半乳糖-1H3磷酸酶（Laing等，2004, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:16976-1698L ;Conklin 等，2006, J. Biol. Chem. 281:15662-15670.)、 L-半乳糖脱氢酶（Wheeler 等，1998, Nature 393:365-369. ;Gatzek 等，2002, Plant J. 30,541 (2002 ;Laing 等，2004 Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:16976-16981)、L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Imai 等，1998 Plant and Cell Physiology 39:1350-1358. ;Bartoli 等，2005，Plant，Cell and Environment 28:1073-1081.)和⑶P-L 半乳糖磷酸化酶（GGP)(Laing 等，2007, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 104:9534-9)。申请人之前已经不出了 GDP-L 半乳 糖磷酸化酶在决定抗坏血酸的产生中是重要的（Bulley S等，2012 Plant Biotechnol J 2012,10:390-397)〇
[0007] 抗坏血酸的浓度是根据需求调控的。当在高光强度下对高抗坏血酸的需求最高 时，叶子中抗坏血酸浓度升高（Bartoli 等，J. Exp. Bot. 57, 1621 (2006) ;Gatzek,等，Plant J. 30, 541 (2002))。然而，对植物中抗坏血酸的生物合成的调控机制知之甚少（Bulley等， Plant Biotechnol J 10,390(2012) ;Bulley 等，J.Exp.Bot. 60, 765(2009))。了解抗坏血 酸的生物合成如何调控可以为在植物中操纵生物合成提供工具。了解基因表达的调控、以 及控制所述表达的因子/元件也能为基因操纵提供有价值的工具。
[0008] 本发明的一个目的在于提供用于调节GGP(也称为GDP-L-半乳糖磷酸化酶）活 性；和/或植物中的抗坏血酸含量的改进组合物和方法；和/或提供可用于遗传操纵的改 进工具；或至少为公众提供有用的选择。
【发明内容】
[0009] 第一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，包含编码具有以下氨基酸序列 的多肽或其变体或片段的序列，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO: 1至20、以及132至 134(u0RF 肽）。
[0010] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID N0:21至40、以及135至 137的氨基酸序列（uORF肽的保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0011] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:21至40、以及135至 137的氨基酸序列（uORF肽的保守区域）。
[0012] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自氨基酸序列SEQ ID N0:21至30、 33至37以及135至137 (双子叶植物uORF肽的保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0013] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:21至30、33至37以 及135至137的氨基酸序列（双子叶植物uORF肽的保守区域）。
[0014] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）有至少70%同一性的序列。
[0015] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）。
[0016] 在另一个实施方案中，所述变体包含与选自SEQ ID NO: 1至20、以及132至134的 氨基酸序列（uORF肽）有至少70 %同一性的序列。
[0017] 在另一个实施方案中，所述变体包含选自SEQ ID NO: 1至20、以及132至134的氨 基酸序列（uORF肽）。
[0018] 在另一个实施方案中，所述变体包含与选自SEQ ID NO: 1至10、13至17以及132 至134的氨基酸序列（双子叶植物uORF肽）有至少70%同一性的序列。
[0019] 在另一个实施方案中，所述变体包含选自SEQ ID NO: 1至10、13至17以及132至 134的氨基酸序列（双子叶植物uORF肽）。
[0020] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID N0:61至80、以及 138至140的序列（uORF DNA序列保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0021] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:61至80、以及 138至140的序列（uORF DNA序列保守区域）。
[0022] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID N0:61至70、73至 77以及138至140的序列（双子叶植物uORF DNA序列保守区域）有至少70%同一性的序 列。
[0023] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:61至70、73至77 以及138至140的序列（双子叶植物uORF DNA序列保守区域）。
[0024] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID N0:41至60、以及 129至131的序列（uORF DNA序列）有至少70%同一性的序列。
[0025] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:41至60、以及 129至131的序列（uORF DNA序列）。
[0026] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID N0:41至50、53至 57以及129至131的序列（双子叶植物uORF DNA序列）有至少70%同一性的序列。
[0027] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:41至50、53至57 以及129至131的序列（双子叶植物uORF DNA序列）。
[0028] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO: 111至125的 序列（5' -UTR子序列）有至少70%同一性的序列。
[0029] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO: 111至125的序 列（5' -UTR子序列）。
[0030] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID N0:81至100、以及 126至128的序列（完整5'-UTR序列）有至少70 %同一性的序列。
[0031] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQIDN0:81至100、以及 126至128的序列（完整5' -UTR序列）。
[0032] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQIDN0:81至90、93至 97以及125至128的序列（完整双子叶植物5' -UTR序列）有至少70%同一性的序列。
[0033] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:81至90、93至97 以及125至128的序列（完整双子叶植物5' -UTR序列）。
[0034] 在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，包含选自于SEQ ID N0:41至 60、以及129至131(u0RF DNA序列）、或其变体或片段的序列。
[0035] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID N0:61至80、以及138至 140的序列（uORF DNA序列保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0036] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:61至80、以及138至140 的序列（uORF DNA序列保守区域）。
[0037] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:41至60、以及 129至131的序列（uORF DNA序列）。
[0038] 在一个实施方案中，所述变体包含与选自SEQ ID N0:41至60、以及129至131的 序列（uORF DNA序列）有至少70 %同一性的序列。
[0039] 在一个实施方案中，所述变体包含与选自SEQ ID N0:41至50、53至57以及129 至131的序列（双子叶植物uORF DNA序列）有至少70%同一性的序列。
[0040] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO: 111至125的 序列（5' -UTR子序列）有至少70%同一性的序列。
[0041] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO: 111至125的序 列（5' -UTR子序列）。
[0042] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQIDN0:81至100、以及 126至128的序列（完整5'-UTR序列）有至少70 %同一性的序列。
[0043] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQIDN0:81至100、以及 126至128的序列（完整5' -UTR序列）。
[0044] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自SEQIDN0:81至90、93至 97以及126至128的序列（完整双子叶植物5' -UTR序列）有至少70%同一性的序列。
[0045] 在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:81至90、93至97 以及126至128的序列（完整双子叶植物5' -UTR序列）。
[0046] 在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，具有选自SEQIDN0:81至 100、以及126至128 (完整5' -UTR序列）、或其变体或片段的序列。
[0047] 在一个实施方案中，所述变体与选自SEQIDN0:81至100、以及126至128 (完整 5' -UTR序列）有至少70%同一性的序列。
[0048] 在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，具有选自SEQIDN0:111至 125(5' -UTR子序列）、或其变体或片段的序列。
[0049] 在一个实施方案中，所述变体与选自SEQ ID NO: 111至125(5'-UTR子序列）的序 列有至少70%同一性。
[0050] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID NO:41至60、以及129 至131 (uORF DNA序列）有至少70%同一性的序列。
[0051] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:41至60、以及129至 131的序列（uORF DNA序列）。
[0052] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID N0:41至50、53至57 以及129至131 (双子叶植物uORF DNA序列）有至少70%同一性的序列。
[0053] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:41至50、53至57以 及129至131的序列（双子叶植物uORF DNA序列）。
[0054] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID N0:61至80、以及138 至140的序列（uORF DNA序列保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0055] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:61至80、以及138至 140的序列（uORF DNA序列保守区域）的序列。
[0056] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQ ID N0:61至70、73至77以 及138至140的序列（双子叶植物uORF DNA序列保守区域）有至少70%同一性的序列。
[0057] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ ID N0:61至70、73至77以 及138至140的序列（双子叶植物uORF DNA序列保守区域）。
[0058] 在另一个实施方案中，所述变体编码与SEQ ID N0:21至40、以及135至137 (uORF 肽的保守区域）中任一者有至少70%同一性的序列。
[0059] 在另一个实施方案中，所述变体编码选自SEQIDN0:21至40、以及135至 137(uORF肽的保守区域）中任一者的序列。
[0060] 在另一个实施方案中，所述变体编码与SEQIDN0:21至30、33至37以及135至 137 (双子叶植物uORF肽的保守区域）中至少一者有至少70%同一性的序列。
[0061] 在另一个实施方案中，所述变体编码选自SEQIDN0:21至30、33至37以及135 至137(双子叶植物uORF肽的保守区域）中的至少一者的序列。
[0062] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）有至少70%同一性的序列。
[0063] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）。
[0064] 在另一个实施方案中，所述变体编码与SEQ ID NO: 1至20、以及132至134 (uORF 肽）中的至少一者有至少70%同一性的序列。
[0065] 在另一个实施方案中，所述变体或片段编码选自SEQ ID NO: 1至20、以及132至 134 (uORF肽）中至少一者的序列。
[0066] 在另一个实施方案中，所述变体编码与SEQ ID NO: 1至10、13至17以及132至 134 (双子叶植物uORF肽）中至少一者有至少70%同一性的序列。
[0067] 在另一个实施方案中，所述变体或片段编码选自SEQ ID NO: 1至10、13至17以及 132至134 (双子叶植物uORF肽）中至少一者的序列。
[0068] 在一个实施方案中，所述分离的多核苷酸是修饰的。
[0069] 在一个实施方案中，所述修饰为在编码5' -UTR的序列中至少一个核苷酸的缺失、 添加或置换的至少一者。
[0070] 在一个实施方案中，所述修饰减少、干扰或阻止uORF多肽或其变体的翻译，所述 uORF多肽具有SEQ ID NO: 1和20以及132至134(u0RF肽）中任一者的序列。
[0071] 在另一个实施方案中，所述修饰减少、干扰或破坏uORF多肽或其变体的活性，所 述uORF多肽具有SEQ ID NO: 1和20以及132至134 (uORF肽）中任一者的序列。
[0072] 在一个实施方案中，所述变体包含与SEQ ID NO: 1和20以及132至134 (uORF肽） 中任一者有至少70 %同一性的序列。
[0073] 在另一个实施方案中，所述变体包含与SEQ ID NO: 1至10、13至17以及132至 134 (双子叶植物uORF肽）中任一者有至少70 %同一性的序列。
[0074] 在另一个实施方案中，所述变体包含与SEQ ID N0:21至40、以及135至137 (uORF 肽保守区域）中至少一者有至少70%同一性的序列。
[0075] 在另一个实施方案中，所述变体包含具有SEQ ID N0:21至40、以及135至 137(u0RF肽保守区域）中至少一者的序列。
[0076] 在另一个实施方案中，所述变体包含与SEQ ID NO: 1至30、33至37以及135至 137 (双子叶植物uORF肽保守区域）中至少一者有至少70%同一性的序列。
[0077] 在另一个实施方案中，所述变体包含具有SEQ ID NO: 1至30、33至37以及135至 137 (双子叶植物uORF肽保守区域）中至少一者的序列。
[0078] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）有至少70%同一性的序列。
[0079] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含氨基酸序列SEQ ID N0:108 (uORF肽共 有基序）。
[0080] 在一个实施方案中，所述多核苷酸、或变体或片段可操作地连接至目标核酸序列。
[0081] 在另一个实施方案中，所述目标核酸序列编码目标蛋白。
[0082] 在一个实施方案中，所述多核苷酸和核酸序列在自然界中通常不相连。
[0083] 当如上所述修饰多核苷酸时，为了干扰uORF多肽的表达或活性，可操作地连接的 序列可以为GGP序列。在该实施方案中，所述修饰除去通过抗坏血酸对uORF的阻遏。在经 修饰的多核苷酸的控制下表达GGP可以有利地保留与天然GGP启动子和5' -UTR的控制类 似的空间和/或时间表达，但是停止了抗坏血酸经由uORF多肽的负向调控表达。在该实施 方案中，所述多核苷酸与目标核酸序列在自然界可以正常地相连，但是所述多核苷酸处于 如上所述的修饰形式。
[0084] 多肽
[0085] 在另一个方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO: 1至20以 及132至134 (uORF肽）、或其变体或片段中任一者的序列。
[0086] 在一个实施方案中，所述变体或片段包含与选自SEQIDN0:21至40、以及135至 137(uORF肽的保守区域）的序列有至少70%同一性的序列。
[0087] 在另一个实施方案中，所述变体或片段包含选自SEQ