[0353] 因此，本领域技术人员能够理解存在众多方式来干扰uORF以除去抗坏血酸引起 的负向调控以及提高抗坏血酸的产生。任意这样的方法包括在本发明的范围中。
[0354] 植物
[0355] 术语"植物"意欲包括整个植物、植物的任何部分、植物的繁殖体及子代。
[0356] 术语"繁殖体"是指植物中可用于繁殖或增殖的任何部分，其为有性或无性的，包 括种子及插枝。
[0357] 可培养本发明的植物，并自交或与不同植物品系杂交，且由两代或更多代得到的 后代也构成了本发明的一个方面，条件是它们保留本发明的转基因或修饰。
[0358] 从植物中提取和测定抗坏血酸的方法
[0359] 还提供了通过从本发明的植物中提取抗坏血酸，以生产抗坏血酸的方法。可按照 如下方式从植物中提取抗坏血酸：
[0360] 将冰冻组织样品在Cryomill中在液氮温度下研碎成精细的粉末。然后将约200mg 冰冻粉末组织用5倍体积的含2mMTCEP(Pierce公司）的7%偏磷酸中悬浮，振荡混合20 秒，并在40°C在加热块中孵育2小时。在提取溶液中使用TCEP是因为其在酸性条件下是比 DTT更有效的还原试剂，确保所有维生素C是抗坏血酸的还原形式。提取物在4°C离心，且 将20yL上清液注射入Rocket柱内，并用两种溶剂A(0. 28%正磷酸，0.ImMEDTA和0. 25% 甲醇）和B(乙腈）洗脱。使用5分钟梯度（直至90%B)洗脱抗坏血酸及其它组分。每批 或处理20个样品后运行标准试样。根据在240nm处洗脱1分钟的吸收曲线下方的面积计 算抗坏血酸。
[0361] 该方法可使用本领域人员熟知的方法为大规模抗坏血酸提取扩大规模。
[0362] 本发明还可以宽泛得解释为包括本申请说明书中分别或一起提及或所提示的各 部分、元素和特征，和任意两个或更多个所述部分、元素或特征的任一种或所有组合，并且 在本文中提及特定整体的情况下，所述整体具有本发明所涉及领域内的已知等同物，这种 已知的等同物被认为是引入本文中，好像其被独立地阐述那样。
[0363] 附图简要说明
[0364] 参考下列附图可更好地理解本发明，其中：
[0365] 图1示出了抗坏血酸对由GGP启动子或对照启动子驱动的报告基因活性的影响。 A :对于GGP启动子，LUC/REN比作为叶抗坏血酸浓度的函数；B :对于TT8启动子，LUC/REN 比作为叶抗坏血酸浓度的函数。▲低抗坏血酸（K0)叶，对照叶，〇高抗坏血酸（GGP)叶。
[0366] 图2示出了在GGP基因的5'_UTR中存在的ACG uORF的各种改变形式下，抗坏血酸 对GGP启动子强度的影响（图S7B)。A :LUC/REN比；B :相同处理中抗坏血酸的浓度。VTC2 是野生型GGP5' -UTR和启动子。ACG1是ACG1的启动ACG变为TCG，不再为起始密码子。ACG2 是在uORF的高保守区域（图S5、S7B)中第一个组氨酸His变为亮氨酸Leu。加入GGP以 操纵抗坏血酸浓度。在A中，VTC2+GGP处理比所有其它处理（差异不显著）具有显著更低 的LUC/REN值（p = 0.001)。在B中，向叶中加入GGP显著提高了抗坏血酸（p = 0.001)， 但是高或低抗坏血酸的处理之间的差异不显著。棒为标准误差，n = 4。
[0367] 图3示出了检测GGP5'-UTR的非典型uORF是以顺式还是反式的方式作用的结 果。VTC2wt是指抗坏血酸阻遏启动子和5' -UTR，ACG1指uORF的突变ACG密码子（无响 应），uORF是指添加了由35S驱动子驱动的uORF并且GGP是指添加了也由35S驱动的GGP 编码序列以提高抗坏血酸。
[0368] 图4示出了对于来自猕猴桃和拟南芥的GGP全长启动子构建体，报告基因对抗坏 血酸的反应的比较。GGP用于如图1所示提高抗坏血酸的水平。拟南芥GGP(启动子和 5' -UTR)，□标准猕猴桃GGP (启动子和5' -UTR)。其他的细节可见方法部分。
[0369] 图5示出了在瞬时转化的烟叶中用抗LUC抗体测量（由GGP启动子或对照TT8 启动子驱动），高抗坏血酸浓度对LUC蛋白的量的影响。如图1所示的那样进行试验。在 319998 (GGP)泳道中抗坏血酸的浓度为55至63mg/100g FW，而没有GGP的泳道中抗坏血酸 浓度为21mg/100g FW。其他的细节可见方法部分。
[0370] 图6示出了独立于提高叶抗坏血酸的GGP酶，在不同的GGP水平下通过使用进一 步提高抗坏血酸的GME来操纵抗坏血酸浓度的效果。A :GGP和GME的不同组合对LUC/REN 比的影响；B :GGP和GME的不同组合对抗坏血酸浓度的影响。在A和B中，具有相同的字 母的柱在5%水平无显著差异。C:单个叶片LUC/REN和叶抗坏血酸之间的关系。其他的细 节可见方法部分。在 C 中，，对照；?，GME ;?，0? 33x GGP ;▲，lx GGP ;口，0? 33x GGP+lx GME ;▼，lx GGP+GME。1和0. 33指注入叶中的GGP和GME的相对量。
[0371] 图7示出了对来自一系列双子叶物种的5'_UTR序列的比对。使用Clustal X完 成比对，用Vector NTI执行。后缀字母表示5' -UTR序列来自的物种：Aa为软枣猕猴桃，Ae 为毛花猕猴桃并且Ac为中华猕猴桃，MXd为苹果，Fv为野草莓，S1为番茄，St为马铃薯，Vv 为葡萄，Gm为大豆，Mt为蒺藜苜蓿，Pt为毛果杨，Cs为黄瓜。各名之前的前缀为GenBank 登陆号。两种基因组序列来自公开的来源（T.P.G.S. Consortium, 2011 Nature 475,189); Velasco等，2010 Nat Genet 42,833)。以ATG起始的短uORF为粗体，而以ACG起始的高度 保守的非典型uORF用下划线粗体（ACG1)示出。各序列括号内的数字表示其5'-UTR的总长 度。下方的图示出了 5'-UTR的高保守区域以及用于检测它们功能的三个缺失。着色区域 为高保守区域，其单独删除（从左至右缺失2和3)或是完整删除（缺失1)。黄色基序为以 ATG起始的小的保守uORF (ATG1)，而橙色基序为以ACG起始的两个非典型uORF (ACG1底部、 八〇62顶部）。所有3个1101犯在物种间保守，而六062(家族间同一性为~40%至~60%) 在蛋白质水平方面比ACG1 (~60 %至~80% )保守性差。
[0372] 图8示出了 GGP基因5' -UTR区域的缺失对抗坏血酸下调启动子的影响。缺失如 图S4标记。底部图示出了测量LUC/REN比时相同叶中对应的抗坏血酸浓度。棒表示标准 误差。
[0373] 图9示出了 GGP⑶S前方5' -UTR存在或缺失对叶抗坏血酸的影响的时间过程。所 有构建体由35S启动子驱动。其他的细节可见方法部分。，对照（仅P19) ;?，-5'-UTR GGP ;▲，+5' -UTR GGP ;5' -UTR GGP+GME ;?，+5' -UTR GGP ;〇，GME〇
[0374] 图10示出了对来自一大系列物种的GGP的5' -UTR中的ACG uORF的预测肽序列 的比对。用 Clustal X 完成比对，用 Vector NTI 执行（Thompson 等，Nucleic Acids Res 25,4876(1997).)。后缀字母如图7所示，还增加了双子叶植物植物之外的植物。Cr，莱茵 衣藻（Chlamydomonas rheinhardtii) ;Pp，小立碗藓（Physcomitrella patens) ;Ps，北美 云杉（Picea sitchensis) ;Sm，江南卷柏（Selaginella moellendorffi) ;Zm，玉米。各名之 前的前缀为GenBank登陆号。还示出了完整uORF的共有序列。此外标记下划线的为高度 保守的共有基序 NPSPHGGRGALPSEGGSPSDLLFLAGGG(SEQ ID N0:108)。
[0375] 图11示出了小ATG uORF对报告基因的活性对抗坏血酸浓度反应的影响，报告基 因的活性由GGP启动子和5' -UTR驱动。5' -UTR中小的30bp 0RF的起始密码子通过将起始 的ATG变为TTG而失活。□，失活u0RF;_，u0RF起始密码子存在。在该试验以及重复试验 中，受到不具有起始密码子的5' -UTR控制的报告基因的活性在低和高的抗坏血酸浓度下 的表达都高于uORF完整的基因。实心线为对数据的多项拟合。其他的细节可见方法部分。
[0376] 图12示出了抗坏血酸的还原状态作为叶中的总抗坏血酸的函数。这些数据来 自三个独立的试验。使用GGP操纵抗坏血酸，用还原剂和不用还原剂测量。当抗坏血酸 浓度分为低（27±0.7mg/100g FW)、中（59±2.7)和高（179±17.5)(平均值土标准误 差）时，氧化还原电势值显著不同并且随抗坏血酸的升高而下降：74. 8± 1. 0、70. 1 ± 1. 2和 65. 6±0. 8 (p = 0. 05)。实线是还原％数据的双曲线拟合，而虚线是对氧化还原电势的线性 拟合。
[0377] 图13示出了抗坏血酸对报告基因活性的影响，报告基因的活性受到GGP启动子或 对照启动子驱动。A，对GGP启动子，LUC活性对比REN活性；B，对TT8启动子，LUC活性对 比REN活性。在A中的三个斜率差异显著（p〈0. 001)，而在B中只有低抗坏血酸斜率明显 (p〈0. 001)比斜率差异不显著的其他两条线的斜率更低。
[0378] 图14示出了基于pGreen 0800的报告基因构建体的位置的图，所述构建体被设计 用于检测来源于不同物种的GGP的5' UTR。
[0379] 图15示出了来源于马铃薯、番茄和苹果的GGP基因的5'UTR序列。uORF用粗体 示出。
[0380] 图16示出了对番茄5' UTR而言，高（+319998)和低抗坏血酸下LUC值对REN的 图。
[0381] 图17示出了对马铃薯5'UTR而言，高（+319998)和低抗坏血酸下LUC值对REN的 图。
[0382] 图18示出了对苹果5' UTR而言，高（+319998)和低抗坏血酸下LUC值对REN的 图。
[0383] 图19示出了对于对照启动子-5' UTR-LUC构建体而言，高（+319998)和低抗坏血 酸下LUC值对REN的图。
[0384] 图20示出了对于野生型猕猴桃GGP启动子-5'UTR-LUC构建体而言，高（+319998) 和低抗坏血酸下LUC值对REN的图。
[0385] 例子
[0386] 现在参考下列非限制性例子来说明本发明。
[0387] 不能认为本发明的范围仅限于上述的例子。本领域技术人员能够理解，在不脱离 本发明的范围的情况下可对本发明进行多种变形。
[0388] 实施例1:对GGP的表达控制的阐明
[0389] 概要
[0390] 抗坏血酸（维生素C)是植物和动物体内必需的抗氧化剂和辅酶因子。在植物中 抗坏血酸浓度受到密切调节，部分地对应激反应。申请人已经示出了通过GDP-L-半乳糖磷 酸化酶（GGP)的转录后阻遏来控制抗坏血酸浓度，GGP是抗坏血酸生物合成途径中的限速 酶。该调节要求顺式作用的uORF(上游开放读码框）的翻译，其由非典型的起始密码子启 动并在高抗坏血酸浓度下阻遏下游GGP 0RF的翻译。除去该uORF允许植物产生高浓度的 抗坏血酸。更高级和低级的植物中GGP基因中uORF的存在表明其是控制抗坏血酸的一种 古老的机制。
[0391] 抗坏血酸（维生素C)是在大部分生物体中发现的必需生物化学品，其主要作 用在于控制细胞的氧化还原电势（Asensi-Fabado等，2010, Trends Plant Sci. 15,582; Foyer 等，Plant Physiol. 155,2(2011))以及作为酶辅因子（Mandl 等，2009，&\ J. Pharmacol. 157, 1097)。根据需要调节抗坏血酸的浓度；例如，在高光强度下对抗坏血酸 的需要最高时，叶抗坏血酸浓度升高（Bartoli等，2006, J. Exp. Bot. 57, 1621 ;Gatzek等， 2002, Plant J. 30,541)。然而，如何调节抗坏血酸生物合成的机制是未知的。申请人之前 已经示出了酶⑶P L-半乳糖磷酸化酶（GGP)对决定植物中抗坏血酸是重要的（Bulley等， 2012，Plant Biotechnol J 10,390 出111167等，2009，1￡1?.8〇七 60,765)，表明其可能具有 调节作用。
[0392] 结果和讨论
[0393] 为了研宄GGP基因是否受到抗坏血酸水平的调节，申请人将猕猴桃GGP启动子 及其5'-UTR(SEQ ID N0:101)与荧光素酶（LUC)报告基因融合，并在本氏烟（Nicotiana benthamiana)叶中瞬时表达该构建体（Hellens 等，2005, Plant Methods 1,13.)。申 请人也在强的组成型启动子下仅表达GGP编码序列来操纵抗坏血酸。抗坏血酸浓度从 2mM(20mg/100g FW)翻倍到4mM足以将相对LUC活性降低50%，并且当抗坏血酸升高至接 近10mM时，>90%的LUC活性被破坏（图1)。类似地，拟南芥GGP(VTC2 ;At4g26850)启动 子和5' -UTR(SEQ ID NO: 102)也对LUC报告基因赋予抗坏血酸依赖性的阻遏（图4)。
[0394] 相反，使用与抗坏血酸代谢不相关的基因的对照启动子（TT8 :控制多酚生物合成 的拟南芥bHLH转录因子），高抗坏血酸对相对LUC活性无影响（图1)。其它的对照示出该 调控对GGP序列是特异的，与转基因的表达水平无关，并且由LUC蛋白的改变体现（表1-3， 图5)。
[0396]表1 :LUC或REN的绝对值不显著影响LUC/REN比。LUC和REN之间的关系在超过 200倍的范围内是线性的。下标P是指整个启动子，包括得自该基因的任意5'-UTR基因。 其他的细节可见方法部分。
[0398]
[0399]表2 :抗坏血酸对一系列对照基因的效果比较。+GGP是指为了提高抗坏血酸，共 转化处于35S启动子控制下的来源于猕猴桃的GGP⑶S (GenBank登录号FG528585)。LUC REN斜率是LUC值相对于REN值的绘图强制通过原点的斜率，以作为与LUC/REN比的比较。 N是独立LUC/REN比的测量次数。下标P是指整个启动子，包括得自该基因的任意5' -UTR 基因。在一组两行内，具有相同字母的LUC/REN值没有显著差异p〈0.01。其他的细节可见 方法部分。
[0401] 表3.对用来操纵抗坏血酸浓度的基因添加对照基因的影响。为了检测额外基因 (GGP)的表达增加抗坏血酸并不直接影响LUC/REN比，我们用另一个对抗坏血酸浓度无直 接影响的对照基因进行置换（GenBank登录号FG429343)，猕猴桃甲基转移酶。下标P是指 整个启动子。在一组三行内，具有相同字母的LUC/REN值没有显著差异p〈0. 01。其他的细 节可见方法部分。
[0402] 在所述的试验中，通过GGP编码序列的表达变化操纵叶抗坏血酸。为了将抗坏血 酸的影响与 GGP 蛋白的可能影响分开（MUller-Moul6, P.，2008, Plant Mol. Biol. 68, 31)， 申请人将GGP和GME分别和一起表达。申请人之前已经示出了（Bulley等，2009, J. Exp. Bot. 60, 765.)在烟草中单独表达GGP有中度影响、GME影响很小，而当一起表达时对抗坏血 酸浓度有很强的协同刺激。因此，通过改变这两个基因的比率，可以独立于GGP蛋白量来操 纵抗坏血酸（图6)。尽管不同的GGP蛋白水平，但是该比率对抗坏血酸的响应为与不同抗 坏血酸浓度相关的平滑曲线（图6)，表明了抗坏血酸或相关代谢物是降低LUC活性的因子。
[0403] 为了检测抗坏血酸的影响是否是通过非转录的启动子或5' -UTR介导，申请人进 行了两个试验。首先，申请人在GGP TT8启动子之间交换5'-UTR。我们在叶中瞬时表达这 些物质并测量相对LUC活性。仅在GGP的5' -UTR存在时，升高的抗坏血酸降低LUC活性 (表4)。其次，申请人删除了 5' -UTR中物种间在DNA水平高度保守的两个区域。第一个是 从387到432bp，并且第二个是从514到597bp (图7)，而GGP启动子的其余部分不变，并且 使用报告分析对它们进行检测。所有的缺失引起抗坏血酸对报告基因表达下调的能力的损 失（图8)。这些试验表明，5' -UTR是抗坏血酸实现下调所必要的和充分地。
[0405] 表4 :抗坏血酸下调GGP启动子通过该基因的5' -UTR区进行表达。下标UTR指基 因的5'-UTR，并且下标P'是指相应基因的非转录启动子。GGP是指共转化了 35S启动子控 制下的GGP⑶S从而提高抗坏血酸水平，而FG429343为甲基转移酶对照基因。LUC REN斜 率是LUC值相对于REN值的绘图强制通过原点的斜率。N是独立LUC/REN比的测量次数。 在一组三行内，具有相同字母的LUC/REN值没有显著差异p〈0. 01。其他的细节可见方法部 分。
[0406] 为了研宄抗坏血酸控制是在转录水平还是在转录后水平，申请人测量了报告基因 构建体的转录水平。我们的数据示出抗坏血酸对LUC mRNA水平的影响不大（表5)，表明抗 坏血酸直接地或间接地通过5' -UTR控制GGP的翻译起作用。
[0407]
[0408] 表5 :抗坏血酸水平对LUC RNA水平的影响（通过GGP启动子或TT8对照基因驱 动）。在相同的RNA制备品中，相对于REN的表达测量基因表达。所得值为三个生物学重 复的平均值，每个包括三个合并的叶。标准误差在括号中表示。在每个启动子对内，对于 TT8启动子，基因表达或LUC活性没有显著差异。对于GGP启动子，LUC活性的改变是显著 的（p〈0. 001)，如同两种启动子的抗坏血酸改变（p〈0. 003)那样。
[0409] 为了验证5' -UTR直接起作用以影响叶抗坏血酸浓度，我们构建了 35S启动子驱 动的GGP编码序列，在该编码序列前方具有或不具有GGP 5'-UTR。两种构建体都能在瞬时 体系中增强叶抗坏血酸，但是不含5' -UTR的构建体比具有5' -UTR的构建体多约30%的抗 坏血酸（图9)。此外，将GME共渗透入叶中从而使抗坏血酸比仅由GGP还高（Bulley等， 2009, J.Exp.Bot. 60, 765.)，这使得在不含5' -UTR的构建体的情况下抗坏血酸浓度是含 5' -UTR的构建体的两倍。因此，在高抗坏血酸情况下，GGP 5' -UTR同时限制了 GGP的产生 和抗坏血酸的合成。除去该调控提供了一种制备具有高抗坏血酸水平的植物的方式。
[0410] 考虑到抗坏血酸的影响是通过GGP的5' -UTR区介导的，我们研宄了 5' -UTR的性 能。在具有严格保守元件的许多物种中，GGP是不同寻常的，具有超过500bp的长5' -UTR (图 7)。比较来自不同物种（包括藻类和苔藓）的GGP 5'-UTR，示出了存在高度保守的uORF， 其可能编码60-65个氨基酸的肽（图10)。有趣的是，为了制备该肽，需要在非典型ACG起 始密码子启动翻译。已经描述了多个非典型翻译起始的例子（Ivanov等，2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA105, 10079)。高效的翻译需要Kozak序列，对于该0RF也是这种情况（图8)。 为了检测这种uORF是否是GGP基因的抗坏血酸依赖性调控所需要的，申请人将可能的ACG 起始密码子突变为TCG。来自突变构建体的LUC活性仍然很高，即使在高抗坏血酸的存在 下也是如此（图2)。为了进一步检测对uORF的需要，申请人将残基36处的高度保守的 His (CGG密码子）突变为Leu (CTG)。再次，这破坏了抗坏血酸依赖性调控（图2)。突变内 部ATG密码子（可能编码10个氨基酸的短uORF)将相对LUC活性提高了超过两倍，这可能 是因为它移除了竞争的起始密码子，但并没有改变该启动子对抗坏血酸浓度的相对灵敏度 (图 11)。
[0411] 申请人然后用对抗坏血酸没有反应的ACG uORF突变体检测预计的uORF是以顺式 还是反式构型起作用。申请人检测了独立表达ACG uORF是否能在该突变载体中恢复抗坏血 酸对LUC活性的阻遏。在图3中，申请人示出了 ACG uORF的存在对任何处理无影响，并且 不能补偿ACG uORF的突变形式。这与GGP⑶S情况下uORF以顺式构象起作用是一致的。
[0412] 在该工作中，申请人提供的证据表明，抗坏血酸或抗坏血酸的前体通过中间物 与由GGP 5'-UTR中的非典型uORF产生的肽（抗坏血酸生物合成的关键调控基因）直 接或间接相互作用，导致对GGP酶的翻译的抑制。在真核细胞中通过生物合成途径的产 物控制蛋白表达的报导是罕见的。通常，基因表达是通过借助于单独受体到转录因子的 信号级联或通过目标蛋白的翻译后修饰来控制的（Smeekens等，2010, Curr. Opin. Plant Biol. 13,273)。虽然已经报导5'-UTR序列在控制蛋白表达中是重要的（Hulzink等， 2003, Plant Physiol. 132, 75)，但是在真核生物中报告利用小分子通过mRNA的5' -UTR控 制基因表达是罕见的（Rahmani等，2009，Plant Physiol. 150, 1356)，并且通过非典型起始 密码子uORF进行控制是极其罕见的。
[0413] 一个简单的作用模型可能是ACG uORF被翻译，但在高抗坏血酸存在时，核糖体停 留在uORF。在低抗坏血酸时，翻译在终止密码子终止，并且在GGP的起始ATG下游立即重 新启动。没有明显的Kozak序列与GGP主要起始密码子相关，但有相当强的Kozak序列与 ACG1相关。这有效地引起在高抗坏血酸时，准备进行翻译的GGP mRNA水平的核糖体快速应 对应激条件下抗坏血酸的任意减少。
[0414] 似乎该反馈环的作用需要另一个因素。这是因为来源于毛花猕猴桃（具有很高抗 坏血酸的猕猴桃物种）的GGP 5' -UTR(Bulley等，2009, J. Exp. Bot. 60, 765.)的抗坏血酸调 控，在本氏烟中起作用。猕猴桃有高抗坏血酸表明毛花猕猴桃中发生突变干扰了抗坏血酸 对GGP翻译的反馈。然而，抗坏血酸对毛花猕猴桃GGP的控制在本氏烟中起作用表明在抗 坏血酸和ACGluORF之间介导的因素在本氏烟中起作用。该因素可能是蛋白质。
[0415]有两种类型的 uORF (Tran 等，2008. BMC Genomics 9, 361):序列独立性 uORF，其中 uORF翻译影响下游0RF的重新启动的效率，从而影响整体翻译（Calvo等，2009. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7507)，但uORF编码的肽序列是不重要的（GGP 5' -UTR中短ATG 10氨 基酸uORF似乎符合该类（图7))，以及序列依赖的0RF，其中新生uORF肽在翻译延伸和终 止期间引起核糖体停止。事实上，GGP uORF在很宽范围的植物分类学中编码高度保守的肽， 并且通过uORF中的单个氨基酸突变破坏抗坏血酸阻遏，这表明是后一种类型的uORF。植 物中的两个例子，多胺和鹿糖调节（Rahmani等，2009，Plant Physiol. 150, 1356 ;Gong and Pua，2005, Plant Physiol. 138, 276)涉及序列依赖uORF。我们的新的例子的不同之处在于 其由高度保守的非典型密码子启动翻译。
[0416] 总之，我们已经示出，叶片中抗坏血酸的水平可以通过抗坏血酸生物合成的控制 基因GGP的长5' -UTR中的非典型uOR