Tal介导的转移dna插入的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请案要求2013年3月15日提交的美国临时申请案第61/790434号和2012 年11月20日提交的的美国临时申请案第61/728466号的优先权，所述申请案的全文通过 引用并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及植物生物技术领域并且提供靶向转移DNA插入以制造具有所要性质 的植物和植物产品的方法。
【背景技术】
[0003] 可以通过将DNA区段插入到植物的基因组中对植物进行修饰。添加的DNA包含重 新排列以产生编码蛋白质或触发特定原生RNA分解的RNA的遗传元件。现有技术教示多种 产生非靶向（不可预测并且随机）插入的次优方法。
[0004] 所属领域需要高效并且可重现的制造具有所要性质的基因工程改造植物和植物 产品。与采用转基因性质有关的挑战令人不安，尤其是因为通过习知育种不能有效地解决 重要质量问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个方面是一种将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包 含：
[0006] (A)用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸 序列经设计以识别目标序列；
[0007] (B)用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含（i)标记基因，其未可操作 地连接于启动子（"无启动子的标记盒"）且其包含与所述目标序列同源的序列；以及（ii) 所要多核苷酸；以及
[0008] (C)鉴别所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。
[0009] 在一个实施例中，经转化植物材料暴露于反映经转化植物中存在或不存在标记基 因的条件。在另一实施例中，标记基因为耐除草剂基因且经转化植物材料暴露于除草剂。在 一个实施例中，耐除草剂基因为ALS基因。在另一实施例中，无启动子的标记盒稳定整合到 植物基因组中。
[0010] 在另一实施例中，本发明提供一种将外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包 含以下步骤：（i)用以下转化经分离的植物细胞：(A)包含启动子较少的盒的第一双运载 体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7内含子5'-未转译区的部分序列的右边界序列；(c) 融合到突变乙酰乳酸合成酶（ALS)基因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及 (e)终止序列，其中所要核苷酸序列未可操作地连接于启动子；以及（B)第二双运载体，其 包含（a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含经修饰TAL效应子可操作地连 接于强组成性启动子和终止序列；以及（c)编码参与细胞分裂素制造的酶（例如异戊烯基 转移酶（ipt))的序列，其中经修饰TAL效应子经设计以结合马铃薯的泛素-7(Ubi7)基因 的内含子内的所要核苷酸序列；以及（ii)在促进表达所要核苷酸序列的植物生长的条件 下培养经分离的植物细胞；其中载体骨架DNA未永久地插入到植物基因组中。
[0011] 在本发明的一个优选方面，经修饰TAL效应子包含（a)包含Fokl核酸内切酶催 化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包含16. 5个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定位序列的N端区。
[0012] 在本发明的一个额外优选方面，所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默盒， 所述基因选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成 的群组。在本发明的一个甚至更优选方面，第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所 述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。
[0013] 在一不同实施例中，本发明提供一种经转化植物，其基因组中包含可操作地连接 于所要外源性核苷酸序列的内源性Ubi7启动子，所述外源性核苷酸序列可操作地连接于 外源性终止序列。在本发明的一个方面，一或多种选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧 化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成的群组的基因的表达下调。在本发明的一个优选 方面，植物另外表达晚疫病抗性基因Vntl。
[0014] 在一个实施例中，经转化植物为具有块茎的植物。在一优选实施例中，具有块茎的 植物为马铃薯植物。优选地，经转化植物具有由以下中的一或多者表征的表型：晚疫病抗 性、黑斑碰伤耐受性、低温诱发的甜化降低和其块茎中的天冬酰胺含量降低。
[0015] 在另一实施例中，本发明提供一种本发明的经转化植物的热加工产品。优选地，热 加工产品为法式炸薯条、薯片、脆片、马铃薯、脱水马铃薯或烤马铃薯。在本发明的一个优选 方面，热加工产品的丙烯酰胺含量低于相同物种的非转化植物的热加工产品。
[0016] 在一不同实施例中，本发明提供一种经设计以结合到所要序列的经修饰TAL效应 子，所述所要序列包含（a)包含催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合 域；以及（c)包含核定位序列的N端区。在本发明的一个优选方面，经修饰TAL效应子经设 计以结合马铃薯的泛素_7(Ubi7)基因的内含子内的所要序列。因此，经修饰TAL效应子包 含（a)包含Fokl核酸内切酶的C端活化域中的催化域；(b)目标序列结合域，其包含16. 5 个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复变数双残基；以及（c) N端区中的SV40核定位 序列。
[0017] 在另一实施例中，本发明提供一种双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒 和反向表达盒，其各自包含根据权利要求16所述的经修饰TAL效应子可操作地连接于强 组成性启动子和终止序列；以及（c)编码参与细胞分裂素制造的酶（例如异戊烯基转移酶 (ipt))的序列。
[0018] 在另一实施例中，本发明提供一种包含启动子较少的盒的DNA构筑体，其包含（a) 连接到（b)部分Ubi7 5'-未转译内含子序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成 酶（ALS)基因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；（e)终止序列；以及（f)左边界， 其中所要核苷酸序列未可操作地连接于启动子。在本发明的一个优选方面，DNA构筑体中的 所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、 多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成的群组。在一个甚至更优选方面，DNA构 筑体另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。
[0019] 在一个不同实施例中，本发明提供一种将外源性DNA靶向插入到植物中的试剂 盒，其包含：(A)包含启动子较少的盒的第一双运载体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7 内含子5'-未转译区的部分序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成酶（ALS)基 因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)终止序列，其中所要核苷酸序列 未可操作地连接于启动子；以及（B)第二双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒和 反向表达盒，其各自包含经修饰TAL效应子可操作地连接于强组成性启动子和终止序列； 以及（c)编码异戊烯基转移酶（ipt)的序列。在本发明的一个优选方面，经修饰TAL效应 子经设计以结合马铃薯的泛素-7 (Ubi7)基因的内含子内的所要核苷酸序列，并且包含（a) 包含Fokl核酸内切酶催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包 含16. 5个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定 位序列的N端区。在本发明的另一个优选方面，所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉 默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶l(Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基 因组成的群组。在本发明的一个甚至更优选方面，第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。
[0020] 前述整体描述和以下详细描述为例示性和说明性的并且打算提供所要求的本发 明的其它解释。本领域的技术人员从本发明的以下详细描述容易显而易知其它目标、优势 和新颖特征。
【附图说明】
[0021] 本申请案含有至少一个图式制成彩图。
[0022] 图1说明质粒pSM2168的转移DNA组构。下图中所示的序列以25bp未突出的右 边界开始。浅灰色突出的序列为Ubi7内含子的部分，深灰色突出的序列为Ubi7单体并且 其余未突出的序列为马铃薯ALS基因编码的部分。pSM2168的Ubi7In区段包含与TAL选 择性剪切的内源性内含子序列同源的同源臂。
[0023] 图2说明载体pSM2170中的正向（E3)和反向（E4)TAL效应子盒。
[0024] 图3显示实例9中所述的右边界测试盒。
[0025] 图4说明携带Ubi7: :ALS盒的质粒pSM2162的DNA组构。
[0026] 图5显示正向（5A)和反向（5B)效应蛋白的组构。
[0027] 图6说明携带目标序列的质粒pSM216的组构，所述目标序列含有位于紧靠着⑶S 报告基因的起始密码子下游处的正向和反向识别位点。
[0028] 图7显示农杆菌（Agrobacterium)浸润后的本塞姆氏烟草（Nicothiana benthamiana)叶的⑶S染色。左图：用单独的目标载体pSIM2167浸润。右图；用目标载体 PSIM2167和TAL效应载体pSIM2170浸润。
[0029] 图8显示用TAL效应载体pSM2170共同浸润后的质粒pSM2167的PCR扩增目标 区的序列。效应子识别部位用灰色突出。目标序列的修饰为小缺失（主要形式）和取代 (深灰色突出）。
[0030] 图9显示来自靶向插入特异性PCR的的片段的序列。第一未突出序列和第一浅灰 色突出序列为马铃薯基因组序列。未突出序列：Uni7类启动子的部分；浅灰色突出序列： Uni7类内含子。其余序列来自pSIM2168载体。深灰色序列：Ubi7内含子的部分；未突出序 列：Ubi7单体；浅灰色突出序列：ALS编码序列的部分。
[0031] 图10显示在含有特美汀（timentin)和0? Omg/1甲氧咪草烟（imazamox)(左图） 或2. Omg/1甲氧咪草烟（右图）的不含激素的培养基中生长的节点间外植体。当节点间外 植体在含有甲氧咪草烟的培养基中生长时，可见未完全展开的正常嫩枝。
[0032] 图11显示蓝吉鲁赛特对照（Ranger Russet control) (RR-C)品种和耐除草剂蓝 吉鲁赛特品种用PSIM2170和pSIM2168质粒共转化以供靶向插入，在感染后七天用致病疫 霉（P. infestans)晚疫病病毒株US8BF6攻击产生疾病症状。
[0033] 图12描绘用pSM2170和pSM2168质粒共转化以供靶向插入的所选定耐除草剂 蓝吉鲁赛特品种的南方墨点凝胶。左图：转化酶探针；右图：Vntl启动子探针。经转化品种 中相较于蓝吉鲁赛特对照（RR)品种的每一额外带指示品种RR-36(36)和RR-39(39)的单 拷贝转基因。经转化品种RR-26和RR-32未图示。
[0034] 图13显示马铃薯块茎中的天冬酰胺的均匀沉默。斯诺登品种（Snowden line)2、 15、55 和 83 用 pSIM2168 和 pSIM2170 转化。
[0035] 图14显示马铃薯块茎中的多酚氧化酶的均匀沉默。斯诺登品种2、15、55和83用 PSIM2168 和 pSIM2170 转化。
[0036] 图15显示马铃薯块茎中的天冬酰胺的均匀沉默。蓝吉品种（Ranger line) 26、32、 38 和 39 用 pSIM2168 和 pSIM2170 转化。
[0037] 图16显示马铃薯块茎中的多酚氧化酶的均匀沉默。蓝吉品种26、32、38和39用 PSIM2168 和 pSIM2170 转化。
[0038] 图17显示经转化马铃薯植株的产量。
[0039]图 18 显示 pSM4187 中的 FMV-CAS9-0CS 和 35s-gRNA-Nos 盒。显示 gRNA 的序列 并且突出20bp目标特异性序列。
[0040] 图19显示农杆菌浸润后的本塞姆氏烟草叶的⑶S染色。pSM2167:目标-GUS载 体；PSM4187 :Cas9 和 gRNA 载体。
[0041] 图20显示用pSM4187共同浸润后质粒pSM2167的PCR扩增目标区的序列。gRNA 中的目标特异性序列经墨绿色突出。目标序列的修饰为小缺失和取代。
【具体实施方式】
[0042]本发明的一个方面为短暂表达经设计以结合到所要染色体组目标基因座且因此 剪切所要染色体组目标基因座的转录活化子类效应蛋白，并且由此有助于在那个特定目标 基因座处插入所要多核苷酸。因此，本发明涵盖用含有编码形成识别和裂解目标基因座的 适当TAL二聚体的肽或蛋白质的表达盒的载体和包含一或多个所要表达盒的第二载体转 化植物材料。这类所要表达盒可编码特定蛋白质或基因沉默转录物。在一个实施例中，第二 载体可包含在本文中称为"无启动子的"盒的盒，其包含（i)标记基因或编码所要表型的基 因，和如果可操作地连接于启动子，那么有助于适当表达所述标记基因的适当其它调节元 件；以及（ii)与内源性目标基因座位点目标同源的核苷酸区。所述同源核苷酸区可包含例 如10-20个、20-50个或20-100个核苷酸，其与内源性目标基因座的相应序列共享100%， 或至少99%，或至少98%，或至少97%，或至少96%，或至少95%，或至少94%，或至少 93 %，或至少92 %，或至少91 %，或至少90 %，或至少89 %，或至少88 %，或至少87 %，或至 少86 %，或至少85 %，或至少84 %，或至少83 %，或至少82 %，或至少81 %，或至少80 %，或 至少79 %，或至少78 %，或至少77 %，或至少76 %，或至少75 %，或至少74 %，或至少73 %， 或至少72%，或至少71%，或至少70%，或至少69%，或至少68%，或至少67%，或至少 66 %，或至少65 %，或至少64 %，或至少63 %，或至少62 %，或至少61 %，或至少60 %，或至 少59 %，或至少58 %，或至少57 %，或至少56 %，或至少55 %，或至少54 %，或至少53 %，或 至少52%，或至少51%，或至少50%核苷酸序列一致性。
[0043]因此，在一个实施例中，第二载体包含至少⑴编码所要多核苷酸的表达盒（例如 编码蛋白质或不可转译的RNA转录物的表达盒，所述RNA转录物可包含待下调的目标基因 的有义序列、反义序列和/或反向重复序列），以及（ii)无启动子的标记盒，其包含可操作 地连接于调节元件（例如终止子或3-未转译区）的标记基因以及同源目标位点区。
[0044] 第二载体的无启动子的标记盒和表达盒理想地一起行进，使得两者都因为TAL介 导的活性（由另一 TAL编码载体引起）而整合到目标基因座中。理想地，无启动子的盒和 表达盒整合到目标基因座处的所要位点中，所述所要位点适合地例如视具体情况而定靠近 一或多个功能性内源性启动子或内源性调节元件的下游或上游，使得内源性启动子或调节 元件表达第二载体中的无启动子的标记盒的标记基因。因此，适当设计TAL序列以识别这 类在起始基因表达的内源性基因启动子或调节元件（例如增强子元件）下游或上游的目标 序列对于帮助确保表达盒和无启动子的标记盒在具体选择的基因组定位时间以及不同转 化事件之间整合是重要的。
[0045] 因此，本发明允许定点插入所要多核苷酸（例如本文所揭示和如别处所述的盒中 的一个），这确保具体目标基因在不同转化事件之间表达或下调程度的一致性。举例来说， 定点插入所要多核苷酸可用于重新表达或过度表达目标基因。在一些实施例中，目标基因 的重新表达或过度表达程度在不同转化事件之间可能变化不超过200 %，或不超过100 %， 或不超过50 %，或不超过30 %。或者，定点插入所要多核苷酸可用于制造下调目标基因的 RNA转录物。在一些实施例中，目标基因的下调程度在不同转化事件之间可能变化不超过 200 %，或不超过100 %，或不超过50 %，或不超过30 %。
[0046] 标记基因是重要的，因为如果适当整合无启动子的标记盒，那么标记基因将通过 内源性调节元件表达，并且视标记类型而定将（a)有效鉴别成功转化体，以及（b)产生在所 要目标位置成功插入共接合的表达盒的初步迹象。因此，如果标记基因为耐除草剂基因，那 么经转化植物细胞可基于相关除草剂培养，并且存活的细胞反映在靠近功能性内源性启动 子的所要目标基因座处用耐除草剂基因转化的那些细胞。
[0047] 因此，高度需要在不同转化事件之间在相同染色体组基因座处常规地插入表达盒 的能力，并且因为其减少鉴别否则将在不同染色体组环境中随机发生的整合事件所需的筛 选数量而有利并且节约成本。参看例如实例14。随机整合基因座中的那些差异通常可不 利地扰乱局部染色体组环境，基因敲除必需基因，或将所要表达盒置于未能表达整合的DNA 的基因座中。
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