ID N0:10、ll、12和13 表示。PSM2168中的全部转移DNA序列由SEQ ID NO: 14表示。
[0228] 实例8:用于TAL效应子的载体
[0229] 各TAL效应子（正向或反向）由组成性（35s或FMV)启动子和随后终止子（Nos 或〇cs)驱动形成两种各别植物表达盒。两种盒克隆到双运载体中形成PSIM2170,如图2所 示。这一双运载体仅具有一个边界且含有ipt基因表达盒使得其可能针对稳定整合效应基 因而选择。
[0230] 实例9 :Ubi7内含子5'区上游的右边界支持DNA转移
[0231] 因为边界作为主要裂解位点的功效部分取决于侧接DNA序列，所以测试Ubi7内含 子5'区上游的右边界支持DNA转移的能力。为此目的，将包含在Ubi7单体上游的右边界 /内含子序列和经修饰ALS基因的DNA片段克隆到双运载体pSM123-F中形成pSM2164。 载体PSM123-F含有可选标记基因nptll的表达盒，但缺乏将这一盒转移到植物细胞中所 需的边界（参看图3)。尽管如此，用携带pSIM2164的农杆菌病毒株感染外植体使每个外植 体产生与阳性对照（用携带位于T-DNA边界内的nptll基因的病毒株感染）相同数目的耐 卡那霉素嫩枝。
[0232] 为了测试突变ALS基因赋予马铃薯以甲氧咪草烟耐药性的效率，形成携带 Ubi7 ::ALS盒的载体（pSM2162,参看图4)。用这一载体转化获得耐除草剂植物，通过PCR 确认所述植物含有Ubi7: :ALS盒。
[0233] 实例10 :针对本塞姆氏烟草中的短暂转化的载体设计
[0234] 为了体内测试特异性设计的TALE的效率，设计具有目标序列（Ubi7内含子的部 分）的载体。这一载体PSIM2167与携带效应子的载体一起共转化到本塞姆氏烟草中。如 图6中所示，目标序列含有正向和反向识别位点，所述位点位于紧靠着GUS报告基因的起始 密码子的下游处。在两个识别序列之间并且与GUS编码序列同框的终止密码子使GUS编码 序列不活化。如果TALE结合其经设计的识别位点并且在中间序列中裂解，那么将预期随后 的修复偶尔消除终止密码子而不更改读取范围，因此恢复GUS功能。这类事件可以通过在 浸润之后约4天，通过对本塞姆氏烟草叶进行组织化学染色来目测。
[0235]目标序列区也可以PCR扩增并且定序来鉴别TALE介导的突变。然而，目标序列 的直接PCR和克隆将产生未经修饰的目标序列，因为转化的效率可能较低。因此，经分离 的DNA首先用Alul酶消化，所述酶裂解位于两个TALE识别位点之间的AGCT限制位点。 扩增后，PCR产品再用Alul消化以进一步富集突变的目标序列用于下游克隆和定序分析。 FMV-目标-GUS-Nos盒的全部序列由SEQ ID N:15表示。用于扩增目标序列的PCR引物由 5￡〇10勵：16和5￡〇10勵：17表示。
[0236] 实例11:农杆菌转化和本塞姆氏烟草浸润
[0237] 将经设计的载体转化成农杆菌病毒株AGL1并且测试载体稳定性。浸润后四到六 天，收集来自浸润组织的叶圆片用于⑶S染色分析和DNA分离。经分离的DNA用Alul酶消 化并且用作用于目标区扩增以及进一步克隆和定序的模板。如图7中所示，共同浸润组织 (右图）中观测到⑶S染色，但单独目标载体浸润的组织（左图）中未观测到⑶S染色。图 8中所示的其它序列分析也确认目标序列被TALE修饰。
[0238] 实例12 :稳定转化体的基因分型
[0239] 引物对HD208F1和R1经设计以对耐除草剂转化体进行基因分型。正向引物位于 Ubi7基因的启动子区，并且反向引物位于ALS编码区。引物对为靶向插入特异性引物，因为 仅当转移DNA插入到设计的位置中时，引物对才会扩增片段。pSIM2170和pSIM2168的共转 化产生的耐独立除草剂品种的PCR分析确实扩增片段。这些片段被克隆和定序。如图9中 所示，在一个品种（TALE1)中，片段含有转移DNA盒的部分，其包括通过马铃薯基因组序列 侧接的部分Ubi7内含子、Ubi7单体和ALS编码区的部分。序列blast显示侧接的马铃薯 基因组为位于染色体7上的Ubi7类基因的启动子区，染色体7也含有非常类似的经设计的 TALE的识别位点。在另外两个品种TALE2和TALE3中，转移DNA盒插入到与TALE1中相同 的染色体组基因座中，但转移DNA盒的内含子部分大部分缺失。TALE2和TALE3品种非常相 似，但TALE2中的Ubi7单体中有9bp缺失。
[0240] 实例13 :用于靶向插入的稳定转化品种的表征
[0241] 上文所述的数据和结果指示预期DNA区段的靶向插入是成功的。将来自pSIM2170 和PSIM2168的共转化的耐除草剂蓝吉鲁赛特（RR)品种繁殖和转移到土壤中用于随后测试 /分析。具体来说，通过测定酶多酚氧化酶的活性，并且对沉默盒和Vntl盒的拷贝数进行南 方分析，测试经转化品种对晚疫病攻击的抗性。对于疾病分析，在土壤中持续三周的小植株 用致病疫霉晚疫病病毒株US8BF6接种产生疾病症状。对于南方墨点分析，通过Hindlll限 制酶消化从叶组织分离的3 yg DNA，在0.7%琼脂糖凝胶上跑胶，转移到带正电的尼龙膜上 并且针对沉默盒中的转化酶片段或Vntl表达盒中的Vntl启动子与Dig标记的探针杂交。 下表1中鉴别和概括了四个品种。这些品种是晚疫病抗性品种（参看图11)并且具有两个 盒的单一拷贝（参看图12)。品种RR-36和RR-39中的每个额外段与RR对照品种比较，表 明存在单个转基因拷贝。（品种RR-26和RR-32的数据未显示）。
[0242] 表1:靶向插入的品种表征。
[0245] 实例14 :用于靶向插入的经转化品种的田间试验评估
[0246] 在复制田间试验中种植用PSM2170和pSM2168共转化的蓝吉鲁赛特（RR)和斯 诺登（SN)小植株。评估各植物品种的性质功效和产量。斯诺登品种2、15、55和83(参看 图13)以及蓝吉品种26、32、38和39(参看图15)的马铃薯块茎中的天冬酰胺沉默非常均 勾。此外，相同SN品种（参看图14)和RR品种（参看图16)也具有非常均匀的多酚氧化酶 (PP0)沉默。这些结果指示目标位点允许均匀并且高度表达沉默盒。上述SN和RR品种的 产量（参看图17)与野生型（WT)和空白载体对照物（2162、2370)相比时无显著不同。此 结果表明靶向插入位点对产量潜力不具有负面影响。
[0247] 实例15 :CAS9介导的靶向转移DNA插入
[0248] 除转录活化子类效应子核酸酶（TALEN)之外，存在可将DSB引入到目标DNA序 列中的基于其它核酸内切酶的基因组编辑酶，例如大范围核酸酶（埃必那等人，2003)、 锌指核酸酶（ZFN)(波蒂厄斯和巴尔的摩（Baltimore)，2003)、（博格丹弗和福亚塔 斯，2011)和CRISPR相关（Cas)核酸内切酶（季聂克等人，2012 ;墨索里尼，C.和凯瑟曼 (Cathomen) 2013)。产生DSB后，植物DNA修复机制将通过非同源末端连接（NHEJ)路径修 复断裂，其不精确并且产生突变以实现基因剔除；或通过同源重组（HR)路径实现基因靶向 (基因置换或插入）（赛明顿（Symington)和戈蒂埃（Gautier) 2011)。因此，我们的基于 TALEN的DNA整合中使用的类似策略可转移到基于其它核酸酶的基因组编辑工具中。举例 来说，我们在此处显示工程改造的CAS9核酸内切酶可改良我们的Ubi7内含子DNA目标。
[0249] Cas9基因组编辑技术使用含有20bp目标特异性序列的小嵌合RNA和小RNA骨架 以引导Cas9核酸酶裂解目标。构筑体pSM4187经设计以含有两个表达盒（图18)。第一 个为CAS9核酸酶表达盒。植物密码子优化Cas9由组成性FMV启动子驱动并且在蛋白质的 N端添加来自SV40病毒的核定位序列。工程改造Cas9的DNA和氨基酸序列分别列为SEQ ID No: 18和SEQ ID No: 19。第二个盒在组成性35S启动子控制下在植物细胞中转录时产生 引导RNA。引导RNA的序列列为SEQ ID N0:20。经设计的载体pSM4187转化成农杆菌病 毒株AGL1并且检验载体稳定性。接着，使用含有pSM4187的农杆菌与含有质粒pSIM2167 的农杆菌共同浸润本塞姆氏烟草，含有质粒PSIM2167的农杆菌为含有前述实例中所述的 Ubi7内含子目标的构筑体。浸润后二到四天，收集来自浸润组织的叶圆片用于GUS染色分 析和DNA分离。经分离的DNA用Alul酶消化并且用作用于目标区扩增以及进一步克隆和 定序的模板。如图19中所示，共同浸润组织（右图）中观测到GUS染色，但单独目标载体 浸润的组织（左图）中未观测到GUS染色。图20中所示的其它序列分析确认目标序列被 Cas9修饰。所述修饰与经设计的TALEN诱导的修饰非常类似。
[0250] 序列表
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260]
【主权项】
1. 一种将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包含 (A) 用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸序列 经设计以识别目标序列； (B) 用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含（i)标记基因，其未可操作地连 接于启动子（"无启动子的标记盒"）且其包含与所述目标序列同源的序列；以及（ii)所要 多核苷酸；以及 (C) 鉴别所述所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。2. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述经转化植物材料暴露于反映所述经转化植 物中存在或不存在所述标记基因的条件。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述标记基因为耐除草剂基因且所述经转化植物 材料暴露于除草剂。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述耐除草剂基因为ALS基因。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述无启动子的标记盒稳定整合到所述植物基因 组中。6. -种将外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包含以下步骤：（i)用以下转化经分 离的植物细胞 (A) 包含启动子较少的盒的第一双运载体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7内含子 5'-未转译区的部分序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7 单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)终止序列，其中所述所要核苷酸序列未可操 作地连接于启动子；以及 (B) 第二双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含可操 作地连接于强组成性启动子和终止序列的经修饰TAL效应子；以及（c)编码异戊烯基转移 酶ipt的序列，其中所述经修饰TAL效应子经设计以结合马铃薯的泛素-7 Ubi7基因的内 含子内的所述所要核苷酸序列； 以及（ii)在促进表达所述所要核苷酸序列的植物生长的条件下培养经分离的植物细 胞；其中载体骨架DNA未永久地插入到所述植物基因组中。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述经修饰TAL效应子包含（a)包含Fokl核酸 内切酶催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包含16. 5个对应 于所述Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定位序列的 N端区。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默 盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶I AsnU多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基因组成的 群组。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。10. -种经转化植物，其基因组中包含可操作地连接于所要外源性核苷酸序列的内源 性Ubi7启动子，所述外源性核苷酸序列可操作地连接于外源性终止序列。11. 根据权利要求10所述的经转化植物，其中一或多种选自由天冬酰胺合成酶1 AsnU多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基因组成的群组的基因的表达下调。12. 根据权利要求11所述的经转化植物，其中所述植物另外表达晚疫病抗性基因 Vntl013. 根据权利要求12所述的经转化植物，其中所述植物为具有块茎的植物。14. 根据权利要求13所述的经转化植物，其中所述具有块茎的植物为马铃薯植物。15. 根据权利要求14所述的经转化植物，其中所述植物具有由以下中的一或多者表征 的表型：晚疫病抗性、黑斑碰伤耐受性、降低的低温诱发甜化和其块茎中降低的天冬酰胺含 量。16. -种根据权利要求15所述的经转化植物的热加工产品。17. 根据权利要求16所述的热加工产品，其中所述产品为法式炸薯条、薯片、脆片、马 铃薯、脱水马铃薯或烤马铃薯。18. 根据权利要求17所述的热加工产品，其中所述热加工产品的丙烯酰胺含量低于相 同物种的非转化植物的热加工产品。19. 一种经设计以结合到所要序列的经修饰TAL效应子，其包含（a)包含催化域的截短 C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域；以及（c)包含核定位序列的N端区。20. 根据权利要求19所述的经修饰TAL效应子，其中所述经修饰TAL效应子经设计以 结合马铃薯的泛素-7 Ubi7基因的内含子内的所述所要序列。21. 根据权利要求20所述的经修饰TAL效应子，其中（a)所述C端活化域中的所述催 化域包含Fokl核酸内切酶；(b)所述目标序列结合域包含16. 5个对应于所述Ubi7 5'-未 转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)所述N端区中的所述核定位序列为SV40核定 位序列。22. -种双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含可操 作地连接于强组成性启动子和终止序列的根据权利要求16所述的经修饰TAL效应子；以及 (c)编码异戊烯基转移酶ipt的序列。23. -种包含启动子较少的盒的DNA构筑体，其包含（a)连接到（b)部分Ubi7 5'-未 转译内含子序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7单体编码 序列；（d)所要核苷酸序列；（e)终止序列；以及（f)左边界，其中所述所要核苷酸序列未可 操作地连接于启动子。24. 根据权利要求23所述的DNA构筑体，其中所述所要核苷酸序列为靶向一或多种基 因的沉默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶I Asnl、多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基 因组成的群组。25. 根据权利要求24所述的DNA构筑体，其中所述DNA构筑体另外包含晚疫病抗性基 因Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。26. -种用于将外源性DNA靶向插入到植物中的试剂盒，其包含： (A) 包含启动子较少的盒的第一双运载体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7内含子 5'-未转译区的部分序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7 单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)终止序列，其中所述所要核苷酸序列未可操 作地连接于启动子；以及 (B) 第二双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含可操 作地连接于强组成性启动子和终止序列的经修饰TAL效应子；以及（c)编码异戊烯基转移 酶ipt的序列，其中所述经修饰TAL效应子经设计以结合马铃薯的泛素-7 Ubi7基因的内 含子内的所述所要核苷酸序列。27. 根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述经修饰TAL效应子包含（a)包含Fokl核 酸内切酶催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包含16. 5个对 应于所述Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定位序列 的N端区。28. 根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的 沉默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶I Asnl、多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基因组 成的群组。29. 根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。
【专利摘要】本发明涉及将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包含用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸序列经设计以识别目标序列；用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含(i)标记基因，其未可操作地连接于启动子(“无启动子的标记盒”)且其包含与所述目标序列同源的序列；以及(ii)所要多核苷酸；以及鉴别所述所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。
【IPC分类】C12N15/82
【公开号】CN104884626
【申请号】CN201380066411
【发明人】C·M·罗门思, 段辉, T·J·威克斯
【申请人】杰.尔.辛普洛公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月19日
【公告号】CA2891956A1, EP2922959A1, US20140154397, WO2014081729A1